从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

我们发现，在一群具有干细胞特性和肿瘤起始能力的癌细胞亚群中，HLA-I 存在表观遗传学的下调。HLA-I 的下调与免疫逃逸直接相关，为癌症干细胞提供了生存优势，因此 HLA-I 阴性可作为这类细胞的准确功能性标志物。本次实验操作将由本实验室的博士后 Sudeh Izadmehr 演示。

获取样本后，将组织置于无菌生物安全柜中的100毫米培养皿内，并向培养皿中加入500微升无菌PBS。使用无菌手术刀将组织机械性地切碎，直至无任何碎片大于0.1毫米。将含有组织的全部500微升PBS液体通过35微米孔径的细胞滤筛转移至50毫升锥形管中。

向组织碎片中再加入 500 微升 PBS，再次切碎组织。然后将上清液通过细胞筛过滤至同一收集管中，并继续切碎组织块，直至样品完全解离。当收集完最后一部分细胞后，通过离心沉淀肿瘤细胞，并将沉淀重悬于 5 毫升红细胞裂解缓冲液中。

室温孵育五分钟后，再次离心收集细胞，并用五毫升磷酸盐缓冲液洗涤沉淀。将沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液中，计数活细胞。将细胞冰上稀释至每200微升磷酸盐缓冲液含一×10⁷个细胞的浓度，再轻轻混匀加入200微升基底膜基质。

然后将细胞悬液与基底膜基质混合，皮下注射到 NOD scid gamma 小鼠的侧 flank 部位，并每周两次检查注射部位肿瘤的生长情况。当肿瘤直径达到 1 厘米时，将肿瘤切成两半，取其中一半用 4% 多聚甲醛固定过夜，用于组织学分析。将另一半肿瘤按照前述方法处理，制备成单细胞悬液，并将细胞稀释至每毫升 PBS（含 5% FBS）中含 2 × 10⁶ 个细胞的浓度。

将细胞置于冰上孵育30分钟，然后将细胞悬液分装至一个同型对照管和一个抗体管中。记录每管中的细胞数量，并在抗体管中加入抗-HLA抗体，在同型对照管中加入相应的同型对照抗体，两管均于冰上孵育90分钟。孵育结束后，通过离心收集两组细胞，随后用10毫升PBS离心洗涤两次。

第二次洗涤后，将沉淀重悬于终浓度为每毫升10微克的DAPI溶液中，细胞浓度调整为每毫升一乘以十的七次方个细胞。随后，将每种细胞悬液通过35微米孔径的滤网过滤至各自的12乘75毫米聚苯乙烯管中。经荧光激活细胞分选后，将HLA-I阴性和阳性细胞群体分别稀释至每15毫升肌球体生长培养基中含有一乘以十的五次方个细胞的浓度。

将细胞在每份15毫升新鲜肉瘤球生长培养基中依次稀释至1×10⁴、10³和10²浓度，每种稀释度取100微升细胞悬液分别加入一个96孔超低吸附细胞培养板的每个孔中。将培养板置于37°C、5% CO₂细胞培养箱中，每天通过光学显微镜观察肉瘤球形成情况，并每隔三天在不更换培养基的情况下向每孔补充新鲜的基础成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。三周后，分别统计HLA-I阴性细胞和HLA-I阳性细胞在各稀释度下肉瘤球阳性孔与肉瘤球阴性孔的数量，以便基于泊松概率分布计算成球细胞频率。

通常，来源于人类患者的肉瘤异种移植瘤包含两种不同的HLA-I阳性与阴性细胞群体，其组织学特征与亲本原发性肿瘤相似。如所示，通过对来源于肉瘤患者的异种移植瘤起始细胞进行荧光激活细胞分选，可从亲本细胞群体中有效富集大量HLA-I阴性细胞。HLA-I阴性细胞能够在初始接种量低至10个细胞的条件下形成细胞球，并且其成瘤能力高于HLA-I阳性肉瘤患者来源的异种移植瘤起始细胞。

将相同数量的HLA-I阴性和阳性细胞分别皮下注射至同一只小鼠的对侧 flank，结果表明HLA-I阴性细胞具有显著更高的成瘤能力。尽管由HLA-I阴性和阳性亚群形成的异种移植瘤均为细胞异质性肿瘤。此外，对肿瘤起始细胞的基因表达分析显示，HLA-I阴性细胞表达干细胞分化标志物，并可被诱导向脂质生成和成骨方向分化，表现出强烈的油红O和茜素红S染色及培养特征。

该方法可用于分离多种人类癌症中的肿瘤干细胞。通过下一代测序等分子表征手段，可能揭示可用于治疗性靶向这些细胞的共同标志物。我们的发现表明，HLA-I 的恢复是功能单位免疫细胞增强策略成功的关键步骤。