Name: 来自沙柯玛患者衍生异种移植物的肿瘤启动细胞的分离和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 了解如何使用荧光激活细胞分选技术从肉瘤患者衍生异种移植物中分离HLA-I阴性肿瘤启动细胞。该方法利用HLA-I作为阴性标记物来识别具有干细胞特性的细胞，有助于研究肿瘤起始机制和开发靶向治疗策略。

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本研究由 NCI-P01-CA087497（资助 C.C.-C. 和 D.H.）、NIH-U54-OD020353（资助 C.C.-C.、D.H. 和 J.D.-D.）、安捷伦科技思想领袖奖（资助 C.C.-C.）以及马特尔基金会（资助 C.C.-C. 和 J.D.-D.）提供支持。

本文所讨论的小鼠实验的所有方案均符合机构指南，并已获得西奈山医学中心机构人类研究伦理委员会和动物护理与使用委员会的批准。
1. 肉瘤组织样本的处理及PDX模型的建立
<ol>
	<li>在机构审查委员会批准的方案下，由病理科工作人员从手术标本中获取肉瘤样本，并立即将每个样本置于冰上，放入100 mm培养皿中。</li>
	<li>将样本放入含有6 mL冷的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素）的15 mL聚苯乙烯圆锥形离心管中。立即处理组织样本。</li>
	<li>（可选）仅针对骨肉瘤，执行以下步骤；软组织肉瘤可跳过这些步骤。
	<ol>
		<li>使用解剖刀将组织切成20 mm3大小的组织块。将组织块转移至含有3 mL胶原酶溶液（RPMI 1640加1 mg/mL胶原酶）的15 mL离心管中。</li>
		<li>将离心管置于37 °C水浴中30分钟。</li>
		<li>充分涡旋混匀后，加入3 mL含10% FBS的RPMI 1640培养基以中和胶原酶活性。</li>
		<li>在室温下以350 × g离心5分钟。弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在无菌生物安全柜中操作，将组织样本放入100 mm培养皿中。向组织中加入500 μL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）。使用无菌解剖刀将组织机械吹打成小块，直至无任何肉眼可见大于0.1 mm的组织块。</li>
	<li>将500 μL细胞悬液转移至35 μm细胞滤器中，并用50 mL聚苯乙烯离心管收集滤过液。将含有细胞悬液的50 mL聚苯乙烯离心管置于冰上。</li>
	<li>向组织中再加入500 μL PBS。第二次进行吹打，将悬液通过细胞滤器转移，并收集至同一50 mL离心管中。</li>
	<li>重复上述步骤（步骤1.5–1.6），直至组织完全解离，通常需6–8次。</li>
	<li>在室温下以350 × g离心10分钟，使细胞悬液沉淀。弃去上清液，用5 mL溶血缓冲液（0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3和0.1 mM EDTA）重悬沉淀，并在室温下孵育5分钟以去除红细胞。</li>
	<li>在室温下以350 × g离心5分钟，弃去溶血缓冲液。用5 mL PBS洗涤沉淀，再次以350 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL PBS重悬沉淀，使用血细胞计数板或其它替代方法计数活细胞数量。将细胞稀释至最终浓度为200 μL PBS中含1 × 107个细胞。将细胞悬液置于冰上保存。</li>
	<li>将基底膜基质置于冰上使其融化。将200 μL基底膜基质加入200 μL细胞悬液中。轻轻混匀后保持在冰上。</li>
	<li>将细胞悬液与基底膜基质（1:1）混合物皮下注射至两只NOD scid gamma（NSG）小鼠的侧 flank 部位。每次注射使用200 μL。</li>
	<li>每周检查两次小鼠注射部位，监测PDX（人源肿瘤异种移植）形成情况。当肿瘤直径达到1 cm时，取出移植瘤组织。</li>
</ol>
2. 通过FACS从PDX中分离肿瘤起始细胞
<ol>
	<li>按照先前所述方法，通过手术从小鼠体内取出PDX12。</li>
	<li>将肿瘤切成两半。其中一半异种移植组织用4%多聚甲醛固定过夜，用于组织学分析。另一半组织按照上述步骤（1.3–1.8）进行处理，以获得肿瘤细胞悬液。</li>
	<li>用PBS重悬细胞沉淀，并计数活细胞数量。</li>
	<li>将细胞悬液用含5% FBS的PBS稀释至浓度为2 × 106 个细胞/mL。将细胞悬液置于冰上30分钟。将细胞悬液分装至两个离心管中，分别标记为同型对照管和抗体管。记录每管中的细胞数量。</li>
	<li>用含5% FBS的PBS将HLA-1-PE抗体按1:250比例稀释，配制2×抗体工作液；同型对照抗体在相同条件下进行稀释。将“抗体”管中的细胞悬液与稀释后的抗体按1:1比例混合，使最终抗体稀释比例为1:500；将“同型对照”管中的细胞悬液与同型对照抗体按1:1比例混合。将两管细胞悬液置于冰上孵育90分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以350 × g 离心5分钟，弃上清。加入10 mL PBS洗涤沉淀，重复洗涤两次。</li>
	<li>将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）加入PBS中，使其终浓度为10 μg/mL。将该DAPI溶液加入细胞沉淀中，重悬成浓度为107 个细胞/mL的细胞悬液（依据步骤2.4中记录的细胞数进行调整）。</li>
	<li>将细胞悬液通过35 μm滤网帽过滤，收集至12 mm × 75 mm聚苯乙烯试管中。</li>
	<li>使用流式细胞仪分选HLA-1阴性的TIC亚群6。设门筛选活细胞（DAPI阴性），并将HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群分别收集至两个15 mL收集管中，每管预先加入4 mL RPMI 1640培养基。</li>
</ol>
3. 肿瘤起始细胞的表征
<ol>
	<li>肌球形成
	<ol>
		<li>使用α-MEM细胞培养基配制肌球生长培养基。加入补充剂，使其终浓度为B-27补充剂（1×）、N2补充剂（1×）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（20 ng/mL）、表皮生长因子（EGF）（20 ng/mL）以及青霉素/链霉素（100 IU/mL）。使用0.2 μm细胞培养滤器过滤培养基后使用。</li>
		<li>将步骤2.9中分选得到的HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群离心成团，并计数各亚群的细胞数量。</li>
		<li>将1.5 × 106个细胞加入15 mL肌球生长培养基中，配制成细胞浓度为1 × 105个细胞/mL的细胞悬液。</li>
		<li>用新鲜的肌球生长培养基对细胞进行连续稀释，分别配制15 mL浓度为104、103和102个细胞/mL的细胞悬液。然后准备四块96孔超低吸附细胞培养板，每块用于一种细胞稀释浓度。</li>
		<li>从105个细胞/mL的细胞悬液中取100 µL，加入第一块96孔超低吸附细胞培养板的每个孔中。该板每孔含有104个细胞。</li>
		<li>将另外三块96孔超低吸附细胞培养板分别用于其余三种细胞稀释浓度：104、103和102个细胞/mL。向每块96孔超低吸附细胞培养板的每个孔中加入100 µL细胞悬液。这三块培养板每孔分别含有1,000个、100个和10个细胞。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中培养。</li>
		<li>每隔三天直接向培养基中添加新的bFGF和EGF（终浓度为20 ng/mL），不更换培养基，以避免悬浮培养过程中细胞丢失。</li>
		<li>使用光学显微镜每天观察肌球形成情况，持续三周，如图2A所示。</li>
		<li>三周后，分别统计HLA-1阴性和HLA-1阳性细胞在各稀释浓度下肌球阳性孔和肌球阴性孔的数量。</li>
		<li>基于泊松概率分布13计算成球细胞频率。比较HLA-1阴性肿瘤起始细胞（TICs）与HLA-1阳性 bulk 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连续稀释肿瘤形成实验
	<ol>
		<li>计数步骤2.9中获得的HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群细胞数量。</li>
		<li>用PBS将细胞进行连续稀释，配制成浓度分别为106、105、104和103个细胞/mL的细胞悬液。每种稀释液取1 mL用于在10只小鼠中进行肿瘤形成实验。</li>
		<li>将每种稀释液的1 mL细胞悬液与1 mL基底膜基质混合（1:1）。将每种2 mL混合液置于冰上保存。</li>
		<li>使用25G注射器，将200 µL细胞与基底膜基质的混合液皮下注射至NGS小鼠的两侧 flank 部位，同一小鼠一侧注射HLA-1阴性细胞，另一侧注射HLA-1阳性细胞。每种稀释浓度使用10只小鼠。</li>
		<li>根据肿瘤生长速度，监测小鼠体内肿瘤形成情况，持续四至八周。</li>
		<li>根据不同接种细胞数量下的肿瘤形成比例，计算肿瘤起始细胞频率。比较HLA-1阴性TICs与HLA-1阳性 bulk 细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导向间充质谱系分化
	<ol>
		<li>取前期步骤（步骤3.1.9）中形成的肌球，转移至新的6孔板中。加入2.5 mL含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基，使细胞贴壁附着于培养板表面。</li>
		<li>贴壁培养两天后，将培养基由含10% FBS的α-MEM更换为含10% FBS的α-MEM与人源间充质干细胞（hMSC）生长培养基的1:1混合液。</li>
		<li>再培养两天后，更换为完全hMSC生长培养基。</li>
		<li>当细胞融合度达到90%时，吸除hMSC培养基，加入分化诱导培养基。成骨分化时，加入成骨分化培养基（在hMSC生长培养基中添加10 nM地塞米松、5 mM β-甘油磷酸钠、50 µg/mL L-抗坏血酸和10 mM氯化锂）。脂肪分化时，加入脂肪细胞分化培养基（在hMSC生长培养基中添加0.5 µM地塞米松、0.5 µM异丁基甲基黄嘌呤和50 µM吲哚美辛）。</li>
		<li>每三天更换一次分化培养基。</li>
		<li>三至四周后终止分化，用PBS洗涤细胞，吸除PBS后加入2 mL 10%甲醛溶液进行固定，室温孵育45分钟。用去离子水洗涤细胞。细胞即可用于茜素红S染色（步骤3.3.6.1）或油红O染色（步骤3.3.6.2）。
		<ol>
			<li>为检测成骨分化，进行茜素红S染色。吸除去离子水，向细胞中加入2 mL茜素红S工作液（2%茜素红S，pH 6.0），室温染色5分钟。用去离子水洗涤细胞后，在显微镜下观察染色结果。</li>
			<li>为检测脂肪分化，进行油红O染色。
			<ol>
				<li>配制油红O溶液。将300 mg油红O粉末溶于100 mL异丙醇中，配制储备液。</li>
				<li>使用前2小时内，将三份（30 mL）油红O储备液与两份（20 mL）去离子水混合，室温静置10分钟。</li>
				<li>使用前用滤器过滤工作液。</li>
				<li>吸除步骤3.3.6中处理好的细胞表面的去离子水，加入2 mL 60%异丙醇覆盖单层细胞，室温孵育2分钟。</li>
				<li>吸除异丙醇，加入2 mL油红O工作液，室温孵育5分钟。</li>
				<li>用去离子水冲洗细胞，在光学显微镜下观察染色结果。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li>
<li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li>
<li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+controversial+or+just+misunderstood%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li>
<li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li>
<li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

有若干关键步骤限制了本方案从人源肉瘤PDX模型中分离和鉴定肿瘤起始细胞的成功率。人源肉瘤包含多种不同亚型。我们观察到PDX模型的建立在很大程度上依赖于肉瘤的亚型。具有组织学上未分化表型的临床侵袭性肉瘤（例如，&#160;多形性未分化肉瘤 [成功率100%] n = 2]，去分化脂肪肉瘤[成功率100%， n = 2]，以及滑膜肉瘤[成功率100%， n = 3]）的PDX模型构建成功率较高。而具有分化表型的肉瘤（例如高分化脂肪肉瘤[成功率为0%]， n = 3]）的亚型表现出较低的PDX形成率。可能的原因是，在恶性程度较高的亚型中，肿瘤起始细胞所占比例高于恶性程度较低、分化较好的亚型。此外，我们建议在一天内完成肿瘤起始细胞的分离操作，中间不要中断，以尽量减少细胞活力的损失。
我们已发现HLA-1阴性细胞广泛存在于人类肉瘤中。但不同患者的样本之间，HLA-1阴性细胞的比例可能存在差异。通过该方法，我们已成功从HLA-1阴性细胞比例从低于0.5%到超过30%的样本中分离出肿瘤起始细胞12。重要的是，需通过成球实验和成瘤实验对HLA-1阴性细胞进行功能表征，以确认所分离的HLA-1阴性细胞具有肿瘤起始细胞特性。
然而，本文所述方案也存在局限性。既往数据显示，HLA-1 的表达受表观遗传调控，这与同一肿瘤内 HLA-1 表达存在细胞异质性的观察结果一致12。在肉瘤及其他癌症类型中已检测到 HLA-1 的基因组突变。HLA-1 基因的突变可能导致整个肿瘤细胞表面 HLA-1 完全缺失，或表达无功能的突变型 HLA-1。无论哪种情况，HLA-1 阴性均不能用于识别肿瘤内的肿瘤起始细胞（TICs）。
利用 HLA-1 作为阴性标志物，我们已成功从多种人类肉瘤亚型中分离出肿瘤起始细胞（TICs），并通过功能分析验证了结果。因此，我们能够对这些 TICs 进行包括基因表达分析在内的分子学研究，以开发靶向这些 TICs 的特异性治疗方案。

过去十年间，越来越多的证据表明人类癌症存在肿瘤内细胞异质性1。与正常组织类似，肿瘤组织包含一小部分具有成瘤能力的肿瘤起始细胞（TICs，也称为肿瘤干细胞）；而大部分肿瘤细胞则表现出分化表型2。这些TICs具有类似干细胞的特性，包括表达干细胞标志物以及具备自我更新和不对称细胞分裂的能力，因此能够启动形成具有细胞异质性的肿瘤3。近期研究表明，TICs不仅在肿瘤发生中起关键作用，还与肿瘤侵袭性4、转移5以及耐药性6密切相关。因此，深入理解TICs的生物学特性，进而开发针对这些TICs的特异性治疗策略至关重要。
基于FACS的方法已被用于通过TIC标志物（如CD133、CD24和CD441）鉴定肿瘤起始细胞（TICs）。这些标志物中的大多数也在正常干细胞中表达7。然而，目前尚无任何一种标志物能够特异性地标记TICs。这些分子在TIC恶性表型中所起的作用仍不明确。例如，CD133常因DNA甲基化而失活，因此这种肿瘤间异质性可能影响这些标志物的准确性8。ALDH1是一种同样具有维持TIC干性功能的标志物9。它在鉴定乳腺癌TICs方面似乎更为有效，但在其他肿瘤类型中的适用性仍存疑9。一些信号通路在干细胞生物学中发挥重要作用，包括Wnt（wingless相关整合位点）、TGF-β（转化生长因子β）和Hedgehog通路1。然而，要证明这些通路具有TIC特异性，并利用其活性从原发性肿瘤中分离TICs仍存在困难。因此，迫切需要发现一种可靠的新TIC标志物。
人类MHC I类分子，也称为HLA-1，是一种几乎在所有有核细胞表面表达的膜蛋白10。HLA-1作为抗原呈递分子，可被CD8 T细胞特异性识别10。当肿瘤细胞通过HLA-1呈递肿瘤抗原时，可激活CD8 T细胞的细胞毒性效应。因此，肿瘤细胞表面缺乏HLA-1可能导致其逃避免疫系统中细胞毒性CD8 T细胞的攻击。HLA-1的表达下调已在多种人类癌症中被报道，并与不良预后、转移及药物耐药性相关11。我们已证实，HLA-1在细胞表面的表达缺失可用于鉴定肉瘤以及前列腺癌中的肿瘤起始细胞（TICs）6,12。
本文详细描述了一种通过流式细胞术（FACS）从人源性肉瘤PDX模型中分离肿瘤起始细胞（TICs）的实验方案，该方法以HLA-1作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的TICs进行验证和表征。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m细胞培养滤膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 一次性离心管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m细胞滤筛</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 聚苯乙烯管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96孔超低吸附细胞培养板</td><td>康宁</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>茜素红S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0021</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>HLA-1-PE 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>hMSC 生长培养基</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>异丁基甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>同型对照抗体</td><td>Abcam</td><td>ab103534</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM α</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NSG小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>油红O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>带针头的注射器</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

从肉瘤患者来源的异种移植瘤中分离与表征肿瘤起始细胞

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

过去十年中，越来越多的证据支持肿瘤起始细胞（TICs）的存在及其重要性。研究表明，这些TICs在肿瘤的发生、转移以及耐药性中起关键作用。因此，除了目前主要针对非TICs肿瘤细胞群体的化疗策略外，开发特异性的TIC靶向治疗显得尤为重要。为了进一步理解TICs恶性行为背后的机制，本文描述了一种从人源肉瘤中分离和表征TICs的方法。在此，我们提供了一套详细的实验方案，用于建立人源肉瘤的患者来源异种移植模型（PDXs），并通过荧光激活细胞分选技术（FACS）利用人白细胞抗原I类分子（HLA-1）作为阴性标记物来分离TICs。此外，我们还阐述了如何对这些TICs进行功能学表征，包括成球形成实验和成瘤实验，并诱导其向间充质谱系分化。对PDX来源TICs的分离与表征，为发现潜在的靶向治疗药物提供了重要线索。而且，越来越多的证据表明，该方案还可进一步拓展应用于其他类型人类癌症中TICs的分离与鉴定。

建立了一种人源肉瘤PDX模型并进行染色。通过使用HLA-1抗体进行免疫组织化学染色，显示了肿瘤内的异质性。该异种移植瘤包含两个明显不同的亚群，即HLA-1阳性与阴性细胞（图1A）12。肉瘤PDX在组织学上与其原发亲本肿瘤具有相似性（图1A）。通过FACS分离获得肉瘤PDX的肿瘤起始细胞（TICs）。采用双重分选方法，从亲本细胞群体中高度富集了HLA-1阴性细胞（图1B）12。
与HLA-1阳性细胞相比，分离得到的HLA-1阴性细胞中干细胞表达的基因（如 Oct4、Nanog 和 Myc）表现出高表达水平（图1C）。Sox-9 是一种发育相关基因，据报道在其他癌症干细胞（如乳腺癌）中发挥重要作用，该基因在HLA-1阴性细胞中特异性表达（图1D）。
为验证分离得到的HLA-1阴性亚群，进行了肉瘤球形成实验以检测细胞的自我更新能力。HLA-1阴性细胞能够在初始接种量低至10个细胞的条件下形成细胞球（图1E）12。为检测其成瘤能力，进行了系列稀释成瘤实验。将相同数量的HLA-1阴性和HLA-1阳性细胞分别注射至同一只小鼠的两侧 flank 部位。结果显示，HLA-1阴性细胞具有显著更高的成瘤能力（图1F）12，而由HLA-1阴性和HLA-1阳性亚群形成的异种移植瘤均为细胞异质性肿瘤（图1H）。
我们对分离出的HLA-1阴性TICs进行了基因表达分析12与正常间充质细胞分化相关的基因在肿瘤起始细胞中表达升高12因此，我们也检测了HLA-1 TICs是否可被诱导发生终末分化，从而导致成瘤能力下降。结果显示，HLA-1阴性细胞可被诱导沿脂质生成和成骨方向分化，并呈现强烈的油红O和茜素红S染色图1G）。相比之下，HLA-1阳性细胞在相同条件下不发生分化。因此，这些结果表明了一种具有前景的分化治疗策略，可用于靶向肉瘤肿瘤起始细胞（TICs）。
<img alt="HLA-I 表达分析；显微镜图像（H&amp;E 染色、HLA-I 免疫染色）以及流式细胞术数据图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：从肿瘤内异质性肉瘤 PDX 模型中分离 HLA-I 阴性细胞。（A）通过免疫组织化学（IHC）在不同类型的人类肉瘤中发现 HLA-I 阴性细胞（箭头所示）。（a 和 b）透明细胞肉瘤。（c 和 d）多形性脂肪肉瘤。（e 和 f）平滑肌肉瘤。（g 和 h）恶性外周神经鞘膜瘤。（i 和 j）未另作说明的脂肪肉瘤。（k 和 l）去分化脂肪肉瘤。比例尺 = 100 µm。（B）肉瘤 PDX 模型在组织学上与亲本肿瘤相似（苏木精和伊红 [H&amp;E] 染色），并通过 IHC 显示 HLA-I 表达存在细胞异质性。此处展示的是代表性肉瘤 PDX 模型图像，包括透明细胞肉瘤（CCS）、去分化软骨肉瘤（DCS）和去分化脂肪肉瘤（DDL）。比例尺 = 100 µm。（C）HLA-I 阴性细胞亚群通过流式细胞术采用双次分选法进行分离。从上至下：第一次分选、第二次分选及纯度检测。分离得到的 HLA-I 阴性细胞和 HLA-I 阳性细胞随后用于功能分析，包括肿瘤形成实验。本图结果来自先前发表的研究12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="HLA-I介导的成球、小鼠研究、mRNA水平、组织学染色、显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：通过功能实验对HLA-1阴性肿瘤起始细胞（TICs）的表征。（A）成球实验显示，仅10个HLA-1阴性细胞即可形成肉瘤球。左图：肉瘤球的代表性图像。右图：成球频率；均值 ± 标准差（SD）。比例尺 = 100 µm。（B）从肉瘤患者来源异种移植模型（PDX）中分离的HLA-1阴性细胞具有高度致瘤性。图中显示的是由去分化脂肪肉瘤（DDL）中HLA-1阴性和HLA-1阳性细胞形成的肿瘤的代表性图像。将1000个HLA-1阴性或HLA-1阳性DDL细胞分别注射至同一只小鼠的两侧 flank。（C）与HLA-1阳性细胞相比，HLA-1阴性细胞中干细胞基因Oct4、Nanog和Myc的mRNA表达水平更高。数据表示均值 ± 标准差（n = 5）。（D）Oil Red O和Alizarin Red S的强阳性染色显示，肉瘤TICs可沿脂质生成和成骨分化通路发生终末分化。（E）由HLA-1阳性（左）和HLA-1阴性（右）亚群形成的PDX组织中HLA-1的免疫组织化学染色。比例尺 = 100 µm。本图结果来源于先前发表的研究12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>

我们描述了一种通过荧光激活细胞分选法从人源异种移植性肉瘤组织中分离肿瘤起始细胞的详细方案，该方法以人白细胞抗原-1（HLA-1）作为阴性标记物，并进一步对这些HLA-1阴性的肿瘤起始细胞进行验证和表征。

肿瘤起始细胞（TICs）的存在及其重要性在过去十年中已得到越来越多证据的支持。这些TICs已被……

我们发现，在一群具有干细胞特性和肿瘤起始能力的癌细胞亚群中，HLA-I 存在表观遗传学的下调。HLA-I 的下调与免疫逃逸直接相关，为癌症干细胞提供了生存优势，因此 HLA-I 阴性可作为这类细胞的准确功能性标志物。本次实验操作将由本实验室的博士后 Sudeh Izadmehr 演示。获取样本后，将组织置于无菌生物安全柜中的100毫米培养皿内，并向培养皿中加入500微升无菌PBS。使用无菌手术刀将组织机械性地切碎，直至无任何碎片大于0.1毫米。将含有组织的全部500微升PBS液体通过35微米孔径的细胞滤筛转移至50毫升锥形管中。向组织碎片中再加入 500 微升 PBS，再次切碎组织。然后将上清液通过细胞筛过滤至同一收集管中，并继续切碎组织块，直至样品完全解离。当收集完最后一部分细胞后，通过离心沉淀肿瘤细胞，并将沉淀重悬于 5 毫升红细胞裂解缓冲液中。室温孵育五分钟后，再次离心收集细胞，并用五毫升磷酸盐缓冲液洗涤沉淀。将沉淀重悬于一毫升磷酸盐缓冲液中，计数活细胞。将细胞冰上稀释至每200微升磷酸盐缓冲液含一×10⁷个细胞的浓度，再轻轻混匀加入200微升基底膜基质。然后将细胞悬液与基底膜基质混合，皮下注射到 NOD scid gamma 小鼠的侧 flank 部位，并每周两次检查注射部位肿瘤的生长情况。当肿瘤直径达到 1 厘米时，将肿瘤切成两半，取其中一半用 4% 多聚甲醛固定过夜，用于组织学分析。将另一半肿瘤按照前述方法处理，制备成单细胞悬液，并将细胞稀释至每毫升 PBS（含 5% FBS）中含 2 × 10⁶ 个细胞的浓度。将细胞置于冰上孵育30分钟，然后将细胞悬液分装至一个同型对照管和一个抗体管中。记录每管中的细胞数量，并在抗体管中加入抗-HLA抗体，在同型对照管中加入相应的同型对照抗体，两管均于冰上孵育90分钟。孵育结束后，通过离心收集两组细胞，随后用10毫升PBS离心洗涤两次。第二次洗涤后，将沉淀重悬于终浓度为每毫升10微克的DAPI溶液中，细胞浓度调整为每毫升一乘以十的七次方个细胞。随后，将每种细胞悬液通过35微米孔径的滤网过滤至各自的12乘75毫米聚苯乙烯管中。经荧光激活细胞分选后，将HLA-I阴性和阳性细胞群体分别稀释至每15毫升肌球体生长培养基中含有一乘以十的五次方个细胞的浓度。将细胞在每份15毫升新鲜肉瘤球生长培养基中依次稀释至1×10⁴、10³和10²浓度，每种稀释度取100微升细胞悬液分别加入一个96孔超低吸附细胞培养板的每个孔中。将培养板置于37°C、5% CO₂细胞培养箱中，每天通过光学显微镜观察肉瘤球形成情况，并每隔三天在不更换培养基的情况下向每孔补充新鲜的基础成纤维细胞生长因子和表皮生长因子。三周后，分别统计HLA-I阴性细胞和HLA-I阳性细胞在各稀释度下肉瘤球阳性孔与肉瘤球阴性孔的数量，以便基于泊松概率分布计算成球细胞频率。通常，来源于人类患者的肉瘤异种移植瘤包含两种不同的HLA-I阳性与阴性细胞群体，其组织学特征与亲本原发性肿瘤相似。如所示，通过对来源于肉瘤患者的异种移植瘤起始细胞进行荧光激活细胞分选，可从亲本细胞群体中有效富集大量HLA-I阴性细胞。HLA-I阴性细胞能够在初始接种量低至10个细胞的条件下形成细胞球，并且其成瘤能力高于HLA-I阳性肉瘤患者来源的异种移植瘤起始细胞。将相同数量的HLA-I阴性和阳性细胞分别皮下注射至同一只小鼠的对侧 flank，结果表明HLA-I阴性细胞具有显著更高的成瘤能力。尽管由HLA-I阴性和阳性亚群形成的异种移植瘤均为细胞异质性肿瘤。此外，对肿瘤起始细胞的基因表达分析显示，HLA-I阴性细胞表达干细胞分化标志物，并可被诱导向脂质生成和成骨方向分化，表现出强烈的油红O和茜素红S染色及培养特征。该方法可用于分离多种人类癌症中的肿瘤干细胞。通过下一代测序等分子表征手段，可能揭示可用于治疗性靶向这些细胞的共同标志物。我们的发现表明，HLA-I 的恢复是功能单位免疫细胞增强策略成功的关键步骤。

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