Name: 单细胞分辨荧光活成像在幼虫脑培养中的果蝇昼夜节律时钟 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习利用纤维蛋白基质进行果蝇幼虫脑体外培养，实现单细胞分辨率的荧光活成像技术。该方法可长期追踪神经元基因表达节律，适用于神经遗传学与昼夜节律研究。

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我们感谢 Michael Rosbash 在本方法开发初期阶段提供的指导与支持。本工作由 JST PRESTO 项目、瑞士国家科学基金会（31003A_149893 和 31003A_169548）、欧洲研究理事会（ERC-StG-311194）、诺华医学-生物医学研究基金会（13A39）以及日内瓦大学资助。

1. 在细胞培养罩内制备储备溶液
<ol>
	<li>制备400 mL优化的1x Schneider活性培养基（SAM） 离体 幼虫脑组织培养（改良自参考文献）24,25) (表1。分装至5 mL，于液氮（LN₂）中快速冷冻2)，于 -80 °C 保存。</li>
	<li>通过稀释10x储存液制备1x解剖生理盐水溶液（DSS）（改良自参考文献）26) (表2).</li>
	<li>将纤维蛋白原分装为每份10 mg，4 °C保存，仅限单次使用。 
	注意：称量纤维蛋白原时应在层流罩内进行，并佩戴手套，因其具有危害性。</li>
	<li>在SAM中配制凝血酶储存液（1500 NIH单位/mg），分装为10 µL每份，液氮速冻2 并置于 -80 °C 保存。 
	注意：操作凝血酶时需佩戴手套，因其有害。</li>
	<li>分装100倍青霉素-链霉素储备液，于-20 °C保存。</li>
	<li>将聚四氟乙烯（PTFE）膜（见材料表）裁剪成适合玻璃底培养皿内径的圆形。依次用70%乙醇和高压灭菌的去离子水冲洗。2O. 在紫外灯下于超净工作台中灭菌并干燥，置于无菌培养皿中保存。仅限一次性使用。 
	注：PTFE 是一种多孔柔性膜，可在长期记录过程中允许气体交换，并防止培养基蒸发。</li>
</ol>
2. 时间推移显微镜设置
注意：以下设置适用于配备谐振扫描器（8,000 Hz）的串联扫描倒置共聚焦显微镜（见材料表）。该系统包含高灵敏度的光电倍增检测器，结合谐振扫描器可有效避免光毒性和光漂白。显微镜环境舱（见材料表）覆盖显微镜大部分区域，可精确控制温度和湿度。
<ol>
	<li>放置一个载物台式湿度培养箱。</li>
	<li>打开温度和湿度控制器，使显微镜培养室平衡至 25 °C 和 80% 湿度。</li>
	<li>若需在持续黑暗（DD）条件下进行实验，请用不透光布料覆盖显微镜环境培养室（除非该培养室本身由不透光材料制成）。</li>
	<li>若使用水浸物镜，请将水浸式微量加液装置置于物镜上方，并使用 Autoimmersion Objective Controller 软件编程，以在延时成像期间以恒定速率添加水。 
	注意：建议使用水浸物镜配合水加液装置，或使用干式物镜进行长期活细胞成像，因为其他类型的浸没介质会逐渐干燥。</li>
	<li>将培养皿支架置于载物台上，并放入湿度培养箱内。</li>
	<li>启动显微镜软件，在第一个对话框中选择共振扫描模式。当提示初始化载物台时，选择“确定”。进入“配置”选项卡，再进入“硬件配置”，开启相应的激光线。</li>
	<li>进入“采集”选项卡，再进入“XY”面板，选择双向扫描模式并设置图像采集参数。 
	注意：此处描述的成像设置（图 2、图 3 和 视频 1）已优化用于观察特定荧光报告基因的昼夜节律表达。以下参数最符合我们的实验需求：40X 水浸物镜，8 次线平均，图像分辨率为 512 × 512。对于多色成像，当一种荧光蛋白的发射波长与另一种的激发波长重叠时（此处为黄色荧光蛋白（YFP）的发射波长与 Tomato 的激发波长重叠），需采用顺序成像模式。建议选择“Z-stack 之间”的顺序模式 &#34;in between stack&#34;，因其速度最快，且在采集 Z-stack 期间时钟神经元的移动可忽略不计。显微镜设置应根据各实验的具体目标进行相应调整。</li>
</ol>
3. 幼虫脑外植体培养的建立
注意：从解剖到脑组织外植体包埋的整个过程大约需要 30 分钟。
<ol>
	<li>在培养罩内配制试剂。
	<ol>
		<li>解冻一份凝血酶，并在室温下保存，直至包埋步骤（步骤 3.3）。仅限单次使用。</li>
		<li>在 37 °C 下快速解冻一份 SAM，随后置于冰上，仅限单次使用。</li>
		<li>将 SAM 加入 10 mg 纤维蛋白原中，使纤维蛋白原终浓度为 10 mg/mL，轻轻弹动混匀，并在 37 °C 下孵育至少 30 分钟，且在包埋步骤（步骤 3.3）期间持续孵育。仅限单次使用。 
		注意：纤维蛋白原溶液孵育时间不得超过 2 小时，否则会开始发生聚合。</li>
		<li>解冻一份 100 倍浓缩的青霉素-链霉素储备液。配制含 1 倍青霉素-链霉素的 2.5 mL SAM（SAM/抗生素）。室温保存。 
		注意：将剩余的 100 倍浓缩青霉素-链霉素储备液于 4 °C 保存，可使用一个月。</li>
		<li>从剩余的 SAM 中分装一份 500 µL 的样品，置于冰上保存。</li>
		<li>对于长期成像实验，将灭菌的真空脂涂抹于玻璃底培养皿底部的塑料部分（图 1A），并在层流通风条件下用紫外光灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中枢神经系统与腹神经索的解剖。
	<ol>
		<li>用 70% 乙醇清洁镊子和两个三孔玻璃解剖皿。在四个孔中各加入 400 µL DSS，一个孔中加入 400 µL SAM，置于冰上保存。</li>
		<li>用镊子取出含有幼虫的培养基，挑选非游走期的三龄幼虫（L3）。依次在两个盛有 DSS 的孔中清洗幼虫，然后将其置于第三个盛有 DSS 的孔中并保持在冰上，以麻醉幼虫。 
		注意：在 25 °C 条件下，L3 阶段持续约 2 天。为在生理相关的时间范围内观察脑部，我们选择使用非游走期 L3 幼虫。其他类型的时钟神经元亚群（如 l-LNvs 和 DN3s）在游走期 L3 阶段开始形成，但此时可能尚未进入节律性活动（数据未显示）。因此，尽管在此阶段仍可成像到具有节律性的时钟神经元（数据未显示），但在数据分析时必须仔细区分已具备功能的幼虫时钟神经元与正在发育的神经元。在 25 °C 条件下，非游走期 L3 幼虫大约出现在产卵后 4 至 4.5 天。若使用本方案研究昼夜节律，应在收集 L3 幼虫前，于 25 °C 下以 12 小时光照/12 小时黑暗（LD）循环同步（驯化）发育中的幼虫 3 天。</li>
		<li>使用精细镊子在第四个盛有 DSS 的孔中（未用于清洗幼虫）采用内翻法解剖幼虫脑27。
		<ol>
			<li>简要步骤：将幼虫切成两段，用一对镊子轻轻夹住口钩，用另一对镊子将体壁向内翻卷，从而暴露脑组织。剪除所有连接脑与身体其余部分的气管和神经，使脑游离。</li>
			<li>用 20 µL 移液枪（预先用 DSS 冲洗）吸取约 3 µL 含脑的 DSS 液滴，并转移至含 SAM 的孔中。重复此操作，最多可处理 7 个脑组织。 
			注意：解剖应在低温表面进行，以保持幼虫处于麻醉状态并使脑组织保持低温。例如，可将解剖皿置于连接水泵的冷却板上，循环冰水降温。每个脑组织的解剖过程约需 30 秒。重要的是保持眼/触角成虫盘附着于脑组织，并保持腹神经索完整。撕裂这些结构会损伤脑组织，降低培养质量。同时避免脑组织暴露于空气中。在吸取第一个脑组织前，应先用移液枪反复吹打含有解剖后幼虫残余物的 DSS，以防止脑组织粘附在枪头内壁。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑外植体在三维基质中的包埋与装片（约 20 分钟）。
	<ol>
		<li>将解剖后的脑组织浸入纤维蛋白原工作液中（纤维蛋白原终浓度约为 3.3 mg/mL，每脑 10.5 µL），操作如下：</li>
		<li>用同一枪头（来自步骤 3.2.3）吸取 3.5 µL SAM/抗生素。从解剖孔中吸取一个已解剖的脑组织进入同一移液枪头，但不要将枪头内的 SAM/抗生素液体排出。</li>
		<li>将脑组织及液体排至无菌培养皿盖上。再向该液滴中加入 3.5 µL SAM/抗生素和 3.5 µL 温热的纤维蛋白原/SAM 溶液（10 mg/mL）。用 20 µL 移液枪头轻轻吹打混匀液滴周围的溶液。 
		注意：此步骤使用移液枪而非镊子，可避免对脑组织造成机械刺激。</li>
		<li>从该液滴中取出 2 µL 纤维蛋白原工作液，滴加在玻璃底培养皿的盖玻片上，形成一个小圆。立即加入 0.8 µL 凝血酶，并用移液枪头迅速混匀。纤维蛋白原随即转化为纤维蛋白并开始聚合。</li>
		<li>用一对镊子夹取处于纤维蛋白原工作液中的脑组织（步骤 3.3.1），当观察到白色纤维蛋白基质形成时，将其置于基质上。将脑组织腹侧朝下放置（便于成像时钟神经元）。尽可能将其轻压至接近盖玻片。纤维蛋白凝块由多层纤维蛋白构成。选择其中一层，用轻微而轻柔的动作将其折叠覆盖在脑组织上方，注意不要使基质脱离。
		<ol>
			<li>从凝块的不同部位重复此操作 2 至 3 次，以稳定脑组织。 
			注意：使用镊子操作脑组织时，应避免使其干燥或施加物理应力。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在包埋好的脑组织上方加入 20 µL SAM/抗生素，以终止凝血酶的作用。</li>
		<li>重复上述步骤，装片其余脑组织。每个玻璃底培养皿最多可包埋 5 至 6 个脑组织。</li>
		<li>对于长期活体成像实验，在内层孔（玻璃部分）中加入 600 µL SAM/抗生素。将预先裁剪好的 PTFE 膜置于培养基上方，并将其粘附于底部塑料部分所涂的真空脂上（3.1.5）（图 1A）。</li>
		<li>对于药理学实验，向培养皿中加入 2 mL SAM/抗生素（图 1B）。 
		注意：必须避免培养基蒸发，因为培养基的渗透压对神经元的存活至关重要。因此，对于长期成像实验，必须使用 PTFE 膜密封培养皿；而对于短期实验，只要培养皿中加入 2 mL 培养基并在加湿环境中监测，可不使用密封膜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 时间序列图像采集
<ol>
	<li>将玻璃底培养皿放置于载物台顶部湿度培养箱内的培养皿支架上。</li>
	<li>进入“采集”选项卡中的 z-stack 面板，通过显微镜软件设置 z 轴切片步长（在 图2、图3 及 视频1 所示实验中为 2 µm × ~40）。将 z-stack 的起始平面设为距离盖玻片最远的层面，终止平面设为接近盖玻片的脑组织外植体表面。尽管脑组织的运动可忽略不计，仍建议在 z-stack 的起始和结束位置额外增加若干 z 轴切片。</li>
	<li>进入“标记与定位”（Mark &amp; Find）面板，设置多点图像采集。使用 40X 物镜时，一个脑半球可在单个视野内完整成像。</li>
	<li>进入“采集模式”面板，选择 xyzt 模式（z-stack 时间序列）。进入“时间采集”面板，设置所需的时间间隔和采集频率。 
	注意：应以所需的频率采集时间序列图像。需注意，长时间活细胞成像（24–72 小时）若时间间隔短于 2 小时，可能导致分裂中的神经元数量减少，可能原因是该条件会影响神经元的存活率。随着图像采集频率的提高，数据量随之增加，给数据分析与存储带来更大挑战。</li>
</ol>
5. 脑组织外植体的药理学处理与短期活体成像
注意：以下操作步骤与长期成像基本相同，但无需使用聚四氟乙烯（PTFE）膜。为避免在向培养物中添加化学物质时使脑组织暴露于蓝光下，应将显微镜置于红光暗室中。
<ol>
	<li>进入时间采集面板，设置所需的时间间隔和扫描次数，以在加药前获取基线数据。开始扫描。</li>
	<li>基线扫描完成后，抬起显微镜系统的扫描头。取下台顶式培养箱的盖子，并非常小心地取下玻璃底培养皿的盖子，注意不要移动培养皿。</li>
	<li>如有必要，移除适量的培养基。将实验溶液加入培养基中，并使用无菌巴斯德吸管轻轻、小心地混匀，避免接触脑组织外植体。 
	注意：进行PDF浴式给药时，使用2 µM PDF储备液（溶于10% DMSO中）。</li>
	<li>重新盖上玻璃底培养皿和加湿腔室的盖子，并放回扫描头。如使用遮光布，请重新将其覆盖在显微镜腔室周围。</li>
	<li>在实时扫描模式下检查脑组织是否处于原始位置，必要时进行调整。</li>
	<li>进入时间采集面板，设置所需的时间间隔和扫描次数。开始扫描。 
	注意：本实验中测试了每小时采集一次、持续最长10小时的延时成像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了对培养的幼虫脑组织进行长期荧光延时显微成像的方法。此类实验的成功取决于多种因素，包括培养物的健康状态、脑组织外植体的固定方法、报告基因的荧光强度与信噪比、时间与空间分辨率以及对外植体的可观察性。这些因素之间可能存在相互制约。例如，提高延时成像频率可能影响培养物的健康，而脑组织外植体的固定可能阻碍气体交换。因此，针对所研究的现象找到一个理想的平衡点（此处无意双关）是实验方案成功的关键。本文所述方法已优化，适用于在数小时至数天的时间尺度上监测荧光生物钟报告基因的表达，也可用于研究其他相关生物学过程 果蝇 只要关键步骤未被改变并谨慎操作，神经生物学研究即可顺利进行。
在本实验方案中，脑组织外植体被固定于纤维蛋白凝块中，从而形成一种三维基质。尽管存在其他固定方法，例如使用多聚赖氨酸或层粘连蛋白包被盖玻片，但这些方法会延缓幼虫脑的发育29，因而可能影响其生理稳健性。纤维蛋白本身是一种优良的基质，其结构足够疏松，可允许营养物质到达脑组织外植体，同时又具有足够的黏附性，使脑组织紧贴盖玻片而不被压碎<sup class="...

昼夜节律钟帮助生物体适应由地球24小时自转所产生的周期性环境变化。跨物种的昼夜节律钟分子机制通常由相互关联的转录-翻译反馈环路构成1。由含有时钟基因的神经元组成的昼夜节律起搏器回路，整合来自环境线索（如光暗周期和温度周期）传递的时间信息，从而协调多种日常生理和行为过程的节律2,3。分子节律与神经元输入和输出之间的协调对于昼夜节律回路的功能至关重要，但目前对此机制的理解仍不充分。
在黑腹果蝇（Drosophila）中，分子钟的核心是 CLOCK/CYCLE（CLK/CYC）异源二聚体，它能够激活period（per）和timeless（tim）基因的转录。PER 和 TIM 蛋白形成复合物并进入细胞核，抑制 CLK/CYC 的转录活性，从而抑制其自身基因的转录。转录后及翻译后调控机制导致了 CLK/CYC 介导的转录与 PER/TIM 介导的抑制之间存在时间延迟，由此产生约 24 小时的分子振荡1,3,4。大约 150 个含有此类分子钟的神经元构成神经环路，调控成年果蝇的昼夜节律行为5。在幼虫脑中存在一个更为简单但功能完整的昼夜节律环路，由三组钟控神经元组成：5 个腹侧侧神经元（LNvs；包括 4 个 PDF 阳性的 LNvs 和 1 个 PDF 阴性的 LNv，见下文）、2 个背侧神经元 1（DN1s）以及 2 个背侧神经元 2（DN2s）6,7。
简单的幼虫昼夜节律神经回路为研究神经元间通讯与分子生物钟机制之间的相互作用提供了一个极佳的模型。利用我们新开发的荧光报告基因PER-TDT（其表达水平和亚细胞定位可模拟PER蛋白），我们旨在表征幼虫昼夜节律神经回路中不同时钟神经元亚群内分子生物钟的动态变化8。此外，鉴于由4个LNvs神经元产生的神经肽色素扩散因子（PDF）在神经元水平上调控昼夜节律具有关键作用9,10,11，我们希望进一步探究PDF对分子生物钟的直接效应。为此，我们建立了一种方法，通过延时共聚焦显微镜连续多天监测幼虫离体脑组织中的昼夜基因表达节律。该方案还被优化用于药理学实验，以检测PDF或其他化合物对PER-TDT水平的影响。因此，该优化方案包括使离体脑组织培养体系能够接受药物处理，并提高时间分辨率，同时缩短成像持续时间。
已有研究建立了不同发育阶段的黑腹果蝇（Drosophila）脑组织的离体（ex vivo）培养方法12,13,14,15,16,17,18。尽管这些实验方案已被用于成像多种生物学现象，但其中一些方法无法兼容单细胞分辨率的成像，或无法支持超过数小时的长期培养。对果蝇（Drosophila）昼夜节律神经元进行长期活体成像的替代方法包括：利用生物发光成像技术检测分子节律19,20,21，以及结合光片显微镜进行钙离子指示剂的荧光成像22,23。虽然生物发光成像可实现更高的时间分辨率，光片显微镜也可适用于活体（in vivo）成像，但这些方法在空间分辨率方面存在局限，且需要专用的显微镜系统。
本文所述方法专为在单细胞分辨率下对全脑培养物进行多日荧光信号成像而设计。该方法简便且具有高度适应性，可应用于成年果蝇脑组织培养的成像，以及药理学实验，以研究多种不同的科学问题。 果蝇 神经生物学

<table><tbody><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>我不确定它们是否和我们实验室里的完全一样。我选择了 &quot;适用于昆虫细胞培养&quot; 在可行的情况下</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1000</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>L-(&amp;minus;)-苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-海藻糖二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9512</td><td></td></tr><tr><td>富马酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;α-酮戊二酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1128</td><td></td></tr><tr><td>非热灭活、经支原体和病毒检测的胎牛血清（FCS）</td><td>BioConcept Ltd. Amimed</td><td>2-01F30-I</td><td></td></tr><tr><td>HEPES-KOH，pH 7.4</td><td>E&amp;amp;K Scientific Products</td><td>EK-654011</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维蛋白原</td><td>Calbiochem（默克）</td><td>341573-1GM</td><td>警告：吸入、皮肤接触或吞食有害。应在层流罩下操作</td></tr><tr><td>牛血浆凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9549</td><td>警告：危害健康，需佩戴手套</td></tr><tr><td>PDF，NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td><td>Chi Scientific</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>真空润滑脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，玻璃直径 20 mm，未包被</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>康宁Falcon易握式组织培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>08-772A</td><td></td></tr><tr><td>无菌 500 mL Steritop-GP 33 mm 螺口瓶顶滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>默克密理博</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯（PTFE）薄膜</td><td>杜邦</td><td>200A 聚四氟乙烯FEP薄膜</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV 注射器滤器，0.45 μm&amp;nbsp;&amp;micro;m，PVDF，33&amp;nbsp;毫米，伽马射线灭菌</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 注射器滤器，0.22 μm&amp;nbsp;&amp;micro;m，PVDF，33&amp;nbsp;毫米，γ射线灭菌</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>三孔玻璃解剖皿</td><td>任何公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精细镊子，Dumont 5号</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>倒置式Tandem扫描器TCS SP5共聚焦显微镜，配备谐振扫描器和HyD光电倍增检测器</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度控制室</td><td>生命成像服务</td><td>CUBE &amp;amp; BOX 温度控制系统，定制设计</td><td></td></tr><tr><td>载物台湿度控制器</td><td>生命成像服务</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>水浸微分配器：分配器、扩展型微泵MP6系列和Autoimmersion物镜控制器软件</td><td>Leica microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SUM-stack 创建与 3D 校正漂移插件</td><td>ImageJ 软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 迭代去卷积</td><td>AutoQuant 和 Imaris 软件</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

昼夜节律起搏器回路协调着与环境线索（如昼夜周期）同步的节律性行为和生理输出。每个起搏神经元内的分子钟可产生基因表达的昼夜节律，进而支撑起搏器回路运作所必需的节律性神经功能。研究不同亚类起搏神经元中单个分子振荡器的特性及其与神经信号传导的相互作用，有助于深入理解昼夜节律起搏器回路的机制。本文介绍了一种延时荧光显微镜技术，用于监测培养条件下生物钟神经元中的分子钟运转情况 果蝇 幼虫大脑。该方法可实现对遗传编码的荧光昼夜节律报告分子在单细胞分辨率下的多日连续记录。该装置可结合药理学干预手段，以深入分析分子钟对各种化合物的实时响应。除昼夜节律研究外，该多功能方法还可与强大的 果蝇 基因技术为在活体脑组织中研究多种神经元或分子过程提供了可能。

此处展示了利用昼夜荧光报告系统对生物节律进行长期记录的代表性结果 离体 幼虫脑组织培养，以及PDF灌流处理对报告基因表达的活体成像结果。
在光暗循环（LD）条件下同步化后，选取表达分子钟报告基因 PER-TDT 以及由钟控神经元驱动子 Clk(856)-gal4 驱动的 UAS-mCD8::YFP 的非游走性 L3 期幼虫（图 1C）。在 LD 周期最后一个光照阶段即将转入黑暗阶段前，解剖其脑组织并建立长期培养体系（图 1A 和 2B）。随后在恒定黑暗（DD）条件下进行延时成像，每 2 小时对脑组织外植块成像一次，持续 64 小时。创建包含目标神经元的 SUM 投影图像，并在扣除背景信号后，测定对应神经元区域的平均荧光强度8</s...

本实验方案的目的是建立 离体果蝇 优化了用于通过长期荧光延时成像监测昼夜分子节律的幼虫脑组织培养方法，并探讨了该方法在药理学检测中的应用。

昼夜节律起搏器回路协调与环境线索（如昼夜周期）同步的节律性行为和生理输出。

本实验的总体目标是培养果蝇幼虫大脑，以进行多日时间序列的荧光显微成像。该方法有助于解答果蝇神经遗传学领域中的关键问题，例如特定神经元群体中发生的基因表达变化。该技术的主要优势在于，能够在数小时至数天的时间内，对活体大脑中的荧光探针实现单细胞分辨率的成像观察。准备该实验所需的试剂时，应在超净工作台内操作。需将 SAM 培养基和凝血酶各取一份解冻。凝血酶解冻后暂置一旁备用。取2.5毫升SAM样品，将剩余的SAM置于冰上并备用。然后将青霉素-链霉素加入分装的SAM中，并在室温下保存。对于长期成像实验，准备一个成像腔室，在玻璃底培养皿的孔周围塑料区域涂抹经高压灭菌的真空润滑脂。然后在生物安全柜中用紫外光对涂油的培养皿进行灭菌。接着，将一份SAM与纤维蛋白原混合，并将混合物置于37摄氏度环境中，该混合物在此条件下两小时内不会发生聚合。进行解剖时，使用70%乙醇在两个三孔玻璃解剖皿中清洁镊子。然后在四个孔中各加入 400 微升 DSS，一个孔中加入 400 微升 SAM。将解剖培养皿置于预冷的金属板上。从扩增果蝇的试剂瓶中取出含有非游走三龄幼虫的培养基，用镊子夹取最多七只幼虫，转移至一孔冷 DSS 中。然后，将幼虫依次通过四个含DSS的孔中的三个，以清洗幼虫。将幼虫置于最后一个孔中，直至进行解剖。使用第四个含DSS的孔，在其中用一对洁净的精细镊子解剖幼虫大脑。采用成熟的细胞内向外法。熟练后，每只幼虫的处理时间约为30秒。每次解剖后，使用预先用DSS冲洗过的20微升移液枪头，将脑组织连同约3微升DSS转移至装有SAM的孔中。准备最多七个脑组织进行包埋操作。将脑组织转移至工作液后，将脑组织和培养基滴加到无菌培养皿盖上。然后加入3.5 µL含抗生素的SAM，再加入3.5 µL含纤维蛋白原的预温SAM。在整个操作过程中，必须将含有纤维蛋白原的 SAM 培养基保持在 37 摄氏度。接下来，使用同一枪头轻轻吹打脑组织周围的溶液，混匀后吸取 2 µL 溶液滴加到盖玻片上，用于玻璃底培养皿。然后向液滴中加入 0.8 µL 凝血酶，并迅速混合以启动聚合反应，此时液滴将变为白色。然后，用镊子轻轻夹取脑组织，将其放置在正在聚合的纤维蛋白基质上。我认为，在脑组织转移到液滴后，不建议再添加凝血酶，因为这会使操作过程变得复杂。根据需要调整脑组织的方向，并非常轻柔地将脑组织尽可能贴近盖玻片。然后选取一层聚合的纤维蛋白，用微小而轻柔的动作将其折叠覆盖在脑组织上，避免使基质脱落。继续从凝块的不同部位取聚合的纤维蛋白层，层层折叠覆盖于脑组织上，以稳定脑组织。随后，在包埋的脑组织上滴加20微升含抗生素的SAM，以终止凝血酶的活性。采用此步骤，继续在玻璃底培养皿上包埋五到六个脑组织。对于长期成像，将包埋好的脑组织浸入含抗生素的600微升SAM中。然后将一片PTFE膜覆盖在培养基上，并将膜的边缘粘附到培养皿涂有润滑剂的部位。对于短时间实验，向培养皿中加入两毫升含抗生素的SAM，浸没脑组织，并省略聚四氟乙烯（PTFE）膜的使用。根据所述步骤，表达由时钟神经元驱动程序驱动的分子钟报告基因的脑组织，先经明暗循环同步化，随后制备为脑片培养物。长期培养在明期即将转入暗期前进行设置。在平均荧光强度图像中创建包含目标神经元的SUM-stack，随后在扣除背景后测量对应神经元区域的平均荧光强度。为了确定报告基因表达的节律性，采用最大熵谱分析和人工观察两种方法进行判断。接着，将相同基因型的幼虫分别在主观黎明后一小时或主观黄昏后一小时进行解剖。在1小时内对脑组织进行两次成像以获取基线数据。随后，在培养基中加入PDF或对照溶剂，并每小时对脑组织进行一次成像，持续六小时。在黑暗期结束后不久获取的脑组织中，LNvs神经元中的PER-TDT表达谱显示出在加入PDF后荧光强度随昼夜时间依赖性增加。这种现象也在DN1s中出现，在DN2s中也有一定程度的表现。观看本视频后，您应能充分理解如何利用纤维蛋白三维基质从黑腹果蝇幼虫制备离体脑组织培养。一旦掌握该技术，从解剖到包埋的整个操作过程约需30分钟。在开始解剖之前，先准备好成像装置，以便在包埋后立即对大脑进行成像。通过此方法，成年黑腹果蝇（Drosophila）大脑还可用于荧光延时成像培养，以回答其他科学问题。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

单细胞分辨荧光活成像在幼虫脑培养中的果蝇昼夜节律时钟

活体成像 黑腹果蝇 胚胎血细胞迁移

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。...

发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

来源： Sabado, V., 等人， Nagoshi, E. 单细胞分辨率荧光活体成像 黑腹果蝇 幼虫脑培养中的昼夜节律钟 J. Vis. Exp. (2018).

包埋 果蝇 用于昼夜节律钟神经元延时成像的脑组织三维基质培养法

本文展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜透过蛹壳直接成像细胞行为的方法。通过保持蛹壳完整，该方法能够在果蝇发育的某一难以直接研究的阶段，实现对动态细胞过程的观察与测量。...

透过黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹壳进行成像

本方案详细描述了一种用于完整幼虫大脑中活细胞成像的简化方法。活细胞成像技术对于研究不对称神经干细胞分裂以及其他神经发生和发育过程具有重要价值，能够持续揭示以往被忽视的机制。...

活体成像 黑腹果蝇 幼虫神经母细胞

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇...

活体成像 果蝇 蛹期复眼

本方案详细描述了一种用于长期培养的实验方法 离体 培养与活体成像 果蝇...

长期活体成像 果蝇 眼盘

本文描述了一种实验方案 离体 钙成像 果蝇...

离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

在此，我们描述了用于在活体样本中成像高度运动性树突丝状伪足的方法 黑腹果蝇...

延时活体成像及快速树突分支动态在发育期 Drosophila 神经元中的定量分析

本文介绍了一种用于制备、解剖、封片和成像活体离体黑腹果蝇（Drosophila...

活细胞成像 黑腹果蝇 三龄幼虫大脑

本文提供了一种详细的实验方案，用于对Drosophila卵巢微环境中生殖系干细胞（GSCs）的不对称分裂进行活体成像。我们使用了一种转基因品系，该品系普遍表达一种绿色荧光蛋白（GFP）与谱斑体蛋白Par-1的融合蛋白。...

延长活体成像果蝇雌性Drosophila melanogaster生殖系干细胞微环境

学习利用纤维蛋白基质进行果蝇幼虫脑体外培养，实现单细胞分辨率的荧光活成像技术。该方法可长期追踪神经元基因表达节律，适用于神经遗传学与昼夜节律研究。

单细胞分辨率荧光活体成像果蝇幼虫脑组织培养中的生物钟

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单细胞分辨率荧光活体成像 果蝇 幼虫脑组织培养中的生物钟

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