单细胞分辨荧光活成像在幼虫脑培养中的果蝇昼夜节律时钟
2018年1月19日
该协议的目的是建立活体果蝇幼虫脑培养优化监测昼夜节律分子节律与长期荧光时间推移成像。并对该方法在药理实验中的应用进行了探讨。
该程序的总体目标是培养果蝇幼虫大脑以进行多日延时荧光显微镜检查。这种方法可以帮助回答果蝇神经遗传学领域的关键问题，例如特定神经元群中发生的基因表达变化。该技术的主要优点是它能够在数小时到数天的过程中以单细胞分辨率在活脑中对荧光探针进行成像。
为该程序准备试剂时，请在培养罩下工作。SAM 培养基和凝血酶的等分试样都必须解冻才能开始。将凝血酶放在一边。
取 2.5 毫升等分试样的 SAM，将剩余的 SAM 放在冰上，放在一边。然后将青霉素链霉素放入等分的 SAM 中并保持在室温下。对于长期成像实验，准备一个想象室，将高压灭菌的真空润滑脂涂抹在玻璃底培养皿孔周围的塑料区域。
然后在引擎盖下用紫外线对涂油的培养皿进行消毒。现在，将等分试样的 SAM 混合到纤维蛋白原中，并将混合物转移到 37 摄氏度，在那里两个小时内它不会聚合。对于解剖，用 70% 乙醇清洁两个三孔玻璃解剖皿中的镊子。
然后用 400 微升 DSS 加载四个孔，用 400 微升 SAM 加载一个孔。将解剖盘放在冷藏盘上。从一小瓶繁殖的果蝇中，舀出一些含有非游荡的第三龄幼虫的培养基，然后用镊子将最多七只幼虫转移到冷的 DSS 井中。
然后，将幼虫穿过四个装有 DSS 的井中的三个以将其清除。将它们留在最后一个井中，直到解剖。使用 DSS 的第四个井，用一对干净的细镊子解剖幼虫大脑。
使用成熟的 inside-out 方法。熟练后，每只幼虫可以在大约 30 秒内完成加工。每次解剖后，使用用 DSS 预冲洗的 20 微升移液器吸头将大脑中约 3 微升的 DSS 转移到装满 SAM 的井中。
为嵌入程序准备最多七个大脑。将大脑转移到工作溶液中后，将大脑和培养基分配到无菌培养皿的盖子上。然后，再加入 3.5 微升含抗生素的 SAM，并加入 3.5 微升含纤维蛋白原的温热 SAM。
在整个手术过程中，将含有纤维蛋白原的 SAM 培养基保持在 37 度非常重要。接下来，用相同的移液管吸头轻轻移液，在大脑周围混合溶液，并吸出两微升溶液以沉积在玻璃底培养皿的盖玻片上。然后向液滴中加入 0.8 微升凝血酶并快速混合以初始化聚合，结果将显示为白色。
然后，用镊子轻轻地挑起大脑并将其放在聚合纤维蛋白基质上。我认为凝血酶，在大脑转移到液滴后，不建议这样做，因为它会使很多程序复杂化。根据需要确定大脑的方向，并非常轻柔地将大脑尽可能靠近盖玻片。
然后挑选一层聚合纤维蛋白，用小而轻柔的动作将其折叠在大脑顶部，不要分离基质。继续从凝块的不同部分在大脑上折叠聚合纤维蛋白层，以稳定大脑。然后将 20 微升含抗生素的 SAM 沉积在嵌入的大脑上，以停止凝血酶活性。
使用此程序，继续将 5 到 6 个大脑嵌入玻璃底培养皿中。对于长期成像，将嵌入的大脑浸入 600 微升含抗生素的 SAM 中。然后在介质上铺上一块 PTFE 膜，并将膜的边缘粘在培养皿的润滑部分。
对于短期分析，在培养皿中加入两毫升含有抗生素的 SAM，浸入大脑并省略使用 PTFE 膜。使用所描述的程序，表达由时钟神经元驱动器驱动的分子时钟报告基因的大脑在明暗中夹带，然后制备为外植体培养物。长期培养物是在光照阶段建立的，就在天黑之前。
在背景扣除后测量与神经元对应的区域的平均荧光强度中，创建一个包含感兴趣神经元的 SUM 堆栈。为了确定报告基因表达的节律性，使用了最大熵谱分析和手动检查。接下来，在主观黎明后 1 小时或主观黄昏后 1 小时解剖相同基因型的幼虫。
在一小时内对大脑进行两次成像以获得基线。然后，将 PDF 或载体添加到培养基中，每小时对大脑进行一次成像，持续 6 小时。在天黑后不久收获的大脑中，LNvs 中的 PER-TDT 表达谱显示添加 PDF 后荧光强度的日间依赖性增加时间。
这也发生在 DN1 中，在 DN2 上也发生得较小。看完这个视频后，你应该对如何使用纤维蛋白的 3D 基质从果蝇幼虫进行离体脑培养有一个很好的了解。一旦掌握，整个过程大约需要 30 分钟，从解剖到包埋。
在开始解剖之前，准备成像设置，以便在嵌入后立即对大脑进行成像。按照此程序，还可以培养成体果蝇大脑进行荧光延时成像，以回答其他问题。
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概述
本研究提出了一种建立果蝇幼虫脑体外培养的协议，旨在使用长期荧光延时成像监测昼夜分子节律。它解决了果蝇神经遗传学中的关键问题，如特定神经元群体的基因表达变化，并讨论了该方法在药理学分析中的应用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经遗传学
- 细胞培养技术
- 荧光显微镜
背景
- 果蝇幼虫被用作研究神经元机制的模型。
- 该技术能够以单细胞分辨率观察荧光。
- 关注昼夜节律和神经元群体中的基因表达。
- 整合药理学分析以研究分子反应。
研究目的
- 促进果蝇幼虫脑的长期成像。
- 研究由时钟神经元驱动的分子钟报告基因表达。
- 能够在不同光照条件下评估基因表达的节律性。
使用的方法
- 在纤维蛋白基质中果蝇幼虫脑的体外培养技术。
- 涉及果蝇幼虫脑的解剖和嵌入以进行荧光显微镜检查。
- 未提及特定的多组学工作流程。
- 从解剖到嵌入的过程大约需要30分钟。
- 该设置包括准备成像室并控制培养基的温度。
主要结果
- 成功展示了对特定神经元群体节律性表达谱的长期观察。
- PDF加入培养基导致了荧光强度随时间的依赖性增加。
- 发现显示不同神经元类型之间表达模式的差异，如LNvs和DN1s。
- 提供了对协议有效性和昼夜节律动态的全面理解。
结论
- 本研究能够以最小侵入性的方式详细追踪神经元基因表达节律。
- 该方法可能增强对果蝇昼夜生物学和神经遗传学研究的理解。
- 其影响延伸到神经元机制和药理学干预的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables longitudinal, single-cell resolution imaging of molecular oscillators in live neuronal tissue, supporting target validation in neurogenetic discovery. By capturing real-time dynamics of circadian reporters in defined cell types, it provides quantitative, reproducible readouts for mechanistic de-risking of neuronal targets. The approach bridges genetic manipulation with pharmacological response, enhancing predictive confidence in early-stage target interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional rhythms in genetically defined pacemaker neurons to validate circadian targets.
- Operational Value: Provides single-cell, longitudinal fluorescence readouts for assessing target engagement over multiple days.
- Scientific Value: Supports functional validation of neuronal signaling pathways via real-time response to pharmacological agents like PDF.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, background-subtracted fluorescence intensity measurements for rhythmicity assessment.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible embedding of larval brains in fibrin matrix for consistent imaging conditions.
- Scientific Value: Facilitates dose- and time-dependent analysis of compound effects on molecular clock dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links circadian gene expression rhythms to neuronal subtypes (LNvs, DN1s, DN2s) for biomarker-aligned target validation.
- Operational Value: Supports cross-condition comparison (e.g., subjective dawn vs. dusk) to assess rhythm robustness and compound sensitivity.
- Scientific Value: Enables entrainment and explant culture workflows that model light-regulated neuronal physiology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling hypothesis-driven interrogation of neuronal targets before lead identification.
- Discovery Biology: Supports real-time monitoring of gene expression rhythms to clarify circadian pathway function in specific neuron classes.
- Screening: Delivers standardized, quantitative fluorescence outputs for assessing compound effects on molecular clocks over time.
- Analytics: Enables maximum entropy spectral analysis and manual inspection to determine rhythmicity and phase shifts in reporter expression.
- Translational Research: Connects live imaging data to neuronal subtype-specific responses, supporting biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal imaging of neuronal processes in genetically tractable models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into neuronal clock regulation, reducing ambiguity in target function.
- Operational Value: Enables multi-day, time-lapse imaging with environmental control for consistent, reproducible data collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing time-of-day-dependent target modulation and pathway dynamics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of circadian and neurogenetic targets based on dynamic response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila larval dissection and fluorescent microscopy setup.
- Dependent on controlled incubation (37°C) for fibrin polymerization and medium stability.
- Necessitates standardized embedding and imaging protocols to minimize variability across preparations.
- Requires adaptation for different genetic drivers or reporter constructs to target specific neuronal populations.
- Limited by tissue viability over extended culture periods, necessitating timely imaging post-embedding.
