使用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀

本实验的总体目标是鉴定组蛋白修饰在特定基因组位点的富集情况。该方法有助于回答表观遗传学领域的一些关键问题，例如，影响组蛋白修饰的表观遗传调控因子发生突变后，如何改变肿瘤细胞的转录组。该技术的主要优势在于细胞无需交联处理，因而处于更接近自然的状态，这有助于提高抗体的特异性。

首先，在10厘米的培养皿中从小鼠脑组织中分离实验诱导的肿瘤。如果肿瘤表达荧光蛋白，使用荧光解剖显微镜，在0.3倍放大倍率下选择相应的荧光通道观察肿瘤。用手术刀和镊子将肿瘤组织与正常脑组织分离，并在培养皿中将肿瘤切成小块。

将解剖得到的肿瘤转移至含有300微升NSC培养基的1.5毫升离心管中，使用一次性注射器轻轻匀浆肿瘤组织。随后加入1毫升细胞解离培养基，在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，将细胞悬液通过70微米细胞滤网转移至50毫升离心管中。

然后，用25毫升NSC培养基冲洗滤网，将悬液在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于6毫升NSC培养基中，并将肿瘤细胞悬液转移至T25培养瓶中。将细胞置于37°C、含95%空气和5%二氧化碳气氛的组织培养孵育箱中培养，直至神经球形成。

收获神经球后，将每管含10⁶个神经球细胞的样品在氨基沉淀条件下以300 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并将神经球沉淀重悬于1毫升平衡盐溶液中。将悬液转移至低蛋白结合的1.5毫升微量离心管中，然后按前述条件再次离心。

接下来，倒出上清液，并将细胞沉淀重悬于 95 微升消化缓冲液中，每 1×10⁶ 个细胞加入 1:100 稀释的蛋白酶抑制剂混合物。立即用移液器轻轻吹打细胞，防止细胞结团，并避免产生气泡。然后，将 5 微升 0.1× 微球菌核酸酶与 145 微升消化缓冲液混合，每 1×10⁶ 个细胞加入 5 微升稀释后的微球菌核酸酶。

轻轻弹击离心管以混匀，并将离心管放入37摄氏度的加热金属块中，准确孵育12分钟。微球菌核酸酶消化以片段化染色质是该实验最关键的步骤。适当的染色质片段化对于获得高分辨率的染色质免疫沉淀（ChIP）结果至关重要。

为确保该步骤成功，需依次孵育多个样品，以防止过度消化。孵育12分钟后，每1×10⁶个细胞加入10微升10×微球菌核酸酶终止缓冲液。从此步骤开始，样品必须始终置于冰上。

微球菌核酸酶消化样品的Bioanalyzer分析表明，大部分DNA已被切割成单核小体、二核小体和三核小体。接下来，向每1×10⁶个细胞中加入110微升含有蛋白酶抑制剂混合液（按1:100稀释）的2×RIPA缓冲液。轻弹管壁混匀，然后在4°C、1700×g条件下离心15分钟。将含有染色质的上清液转移至普通的1.5毫升微量离心管中，并置于冰上。

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液将染色质稀释至1:1000，使每次免疫沉淀（IP）的体积为100至200微升。然后，取相当于ChIP反应体积10%的等分试样作为输入样品。通过向输入样品中加入100微升含有蛋白酶K的TE缓冲液进行处理，并在55摄氏度孵育一小时。

使用PCR纯化试剂盒纯化输入样品后，用微量分光光度计测定输入样品的浓度。将结果记录在实验记录本中。每个样品每进行一次免疫沉淀（IP），加入10微升经洗涤的蛋白A和G磁珠，在4摄氏度、20 RPM转速下旋转孵育1小时。

将样本置于磁力架上，使磁珠分离，然后将所需体积转移至新的1.5毫升离心管中。向每根离心管中加入适量抗体，再用塑料封口膜包裹管盖以防止蒸发。将样本在4°C条件下旋转孵育过夜，操作方式同前。

第二天，将离心管在2000 × g 条件下离心10秒，然后向每个免疫沉淀样品中加入10 µL磁珠，4 °C、20 RPM 条件下旋转孵育3小时。随后，将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸去上清液，然后向每个免疫沉淀样品中加入150 µL含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，4 °C、20 RPM 条件下孵育5分钟。

孵育结束后，将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸除上清液，然后向每个免疫沉淀样品中加入150微升含低浓度蛋白酶抑制剂的氯化锂缓冲液，在4摄氏度、20 RPM转速下旋转孵育5分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上使磁珠分离，然后用移液器吸除上清液。

然后，向珠子中加入150微升不含蛋白酶抑制剂的冷TE缓冲液，在4摄氏度下以20 RPM转速旋转孵育5分钟。最后一次洗涤步骤后，将样品重悬于100微升TE缓冲液中，缓冲液中添加终浓度为0.5毫克/毫升的蛋白酶K，在55摄氏度下孵育1小时。最后，使用PCR纯化试剂盒纯化氨基沉淀的DNA。

然后，为了检测免疫沉淀是否成功，使用针对阳性对照和阴性对照区域的引物进行qPCR。qPCR实验分别采用IgG ChIP DNA、组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）ChIP DNA以及组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）ChIP DNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因的引物进行扩增。代表性结果表明，Gapdh作为看家基因，仅在与活跃转录相关的H3K4me3修饰中富集，而在与染色质抑制相关的H3K27me3修饰中未见富集。

完成此操作后，还可进行 ChIP-C 等其他方法，以鉴定全基因组范围内组蛋白修饰的变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何在神经球中进行天然染色质免疫沉淀（native ChIP），以鉴定特定基因位点的组蛋白修饰。