Name: 利用小鼠脑肿瘤球的原发染色质沉淀 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习利用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀的方法，用于识别特定基因组位点的组蛋白修饰富集。该技术无需交联细胞，可保持更自然的染色质状态，从而提高抗体特异性，有助于研究表观遗传调控因子突变如何影响肿瘤细胞转录组，为胶质瘤的靶向治疗提供新见解。

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本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助 &amp;#38; 美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）资助项目 R37-NS094804、R01-NS074387、R21-NS091555，授予 M.G.C.；NIH/NINDS 资助项目 R01-NS076991、R01-NS082311 和 R01-NS096756，授予 P.R.L.；NIH/NINDS R01-EB022563；神经外科系；Leah's Happy Hearts 及 Chad Though 基金会资助 M.G.C. 和 P.R.L.。RNA 生物医学资助项目 F046166，授予 M.G.C.。F.M.M. 获 NIH/NINDS F31 资助项目 F31NS103500 支持。R.I.Z.-V. 获 NIH/NIGMS 资助项目 5T34GM007821-37 支持。

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 脑肿瘤NS的生成及培养条件。
<ol>
	<li>准备神经干细胞培养基（NSC），成分为DMEM/F12培养基、B27添加剂（1×）、N2添加剂（1×）以及抗菌试剂。在使用当天，向NSC培养基中添加人重组表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF），终浓度均为20 ng/mL。</li>
	<li>使用Sleeping Beauty转座子系统在小鼠中诱导脑肿瘤，将编码癌基因或靶向肿瘤抑制基因的shRNA的质粒注射到新生小鼠的侧脑室，以生成自发性脑肿瘤9选择一只肿瘤较大的小鼠，并通过生物发光成像确认。 
	注意：有关Sleeping Beauty转座子系统及所用质粒构建体的更详细信息，可参见Calinescu 等9.
	<ol>
		<li>为成像小鼠，使用26号针头经腹腔注射100 µL浓度为30 mg/mL的荧光素溶液。</li>
		<li>注射荧光素5分钟后，使用麻醉室，以2%异氟烷/氧气气流对动物进行麻醉。</li>
		<li>当动物被麻醉后（通常为2-3分钟），将其放入生物发光成像室，通入含2%异氟烷的氧气。若动物麻醉时间超过5分钟，需使用眼用软膏以防止麻醉期间角膜干燥。</li>
		<li>使用成像设备对小鼠进行成像 体内 具有以下参数的光学成像系统：自动曝光、大尺寸像素合并、光圈 f=1。判断为大肿瘤的参数是生物发光信号 &#62;106 光子/秒/厘米²2/sr.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在密闭容器中使用过量异氟烷吸入麻醉剂处死小鼠，通过脚趾夹捏法确认动物已麻醉后，对小鼠进行断头。</li>
	<li>提取脑组织，并按照 Calinescu 之前所述的方法进行解剖 等9.</li>
	<li>将脑组织置于一个10 cm的培养皿中。如果诱导的肿瘤表达荧光蛋白，则使用荧光体视显微镜，设置为相应的荧光通道和0.3倍放大倍数；否则，通过组织颜色和质地的差异来识别肿瘤组织。使用手术刀和镊子将肿瘤组织与正常脑组织分离。</li>
	<li>将肿瘤在培养皿中切碎成小块。将分离的肿瘤组织放入含有300 µL NSC培养基的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>使用与锥形微量离心管管壁贴合的一次性塑料研磨杵轻轻匀浆肿瘤组织。加入1 mL细胞解离液，于37 °C孵育5分钟。 
	注意：使用研杵可能会导致部分细胞死亡。如果读者希望最大限度地提高细胞活力，可省略使用研杵。</li>
	<li>将步骤1.7中的细胞悬液通过70 µm细胞滤网，并用25 mL NSC培养基冲洗滤网。</li>
	<li>在室温下以 300 x g 离心悬浮液 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 6 mL NSC 培养基中。</li>
	<li>将步骤1.9中的肿瘤细胞悬液接种至T-25培养瓶中，在37 °C、含95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中进行培养。2通常在3天后，会观察到部分死亡细胞、贴壁细胞以及一些在培养基中悬浮生长并形成神经球（NS）的细胞混合存在。</li>
	<li>将细胞悬液转移至15 mL锥形管中，使用微量移液器仅收集沉降至管底的细胞，并重新接种至T-75组织培养瓶中。</li>
	<li>以相对较高的密度（1-3 × 10⁶ 细胞/mL）培养细胞6 T-25 培养瓶中的细胞在达到汇合时进行传代。 
	注意：融合度由球体大小决定。较大的球体出现黑色中心表明其中心存在死亡细胞，提示应立即传代细胞。</li>
	<li>每三天添加一次生长因子（EGF 和 bFGF，各 20 ng/mL）。当细胞未达到汇合且培养基变为浅橙色时，更换培养基。</li>
	<li>更换培养基时，收集旧培养基，在室温下以300 × g离心5分钟，然后将细胞沉淀重悬于添加了EGF和FGF（浓度按步骤1.1规定）的NSC培养基中。 
	注意：如果类球体处于中等到高密度状态，但尚未准备好传代（类球体尺寸较小，直径 &#60; 100 µm），则可将沉淀物分装至两个培养瓶中。</li>
	<li>将细胞传代时，于室温下以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞在细胞解离培养基中于 37 °C 孵育 5 分钟。
	<ol>
		<li>加入5 mL平衡盐溶液以稀释解离培养基，在室温下以300 x g离心5分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于18 mL NSC培养基中，并将悬液均分为三份，分别加入三个T-25培养瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为冻存细胞分装物，按照步骤1.15所述方法消化细胞，并将细胞以每管1 mL分装至含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜的冻存液中。将细胞置于冰上10分钟，随后于-20 °C保存30分钟，再于-80 °C保存1天，逐步降温。次日，将细胞转移至液氮储存容器中。</li>
</ol>
2. 原位染色质免疫沉淀（Native ChIP）
<ol>
	<li>染色质制备
	<ol>
		<li>配制好衍生神经球（NS）的储备液后，将NS置于T-75培养瓶中，加入15 mL NSC培养基，在37 °C、95%空气和5% CO₂的组织培养孵箱中进行培养。2 直至NS细胞长满。一个长满的T-75培养瓶可收获3-5 × 106 细胞</li>
		<li>当细胞达到融合状态时，将NS以300 × g离心5分钟，弃去上清液，加入1 mL细胞解离液。在37 °C孵育5分钟。加入5 mL培养基，使用血细胞计数板对细胞进行计数。10. 
		注意：1 x 106 每次免疫沉淀（IP）反应需要的细胞数量。注意，必须同时设置前免疫血清或IgG对照11.</li>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，以300 × g离心5分钟，弃去上清液，用1 mL平衡盐溶液重悬神经球（NS）沉淀，并将悬液转移至低蛋白结合力的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>在300 × g条件下离心NS样品5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于95 µL消化缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，1 mM CaCl₂）中2，每1×10含0.2%聚乙二醇辛基苯基醚）6 加入高浓度蛋白酶抑制剂混合物（1:100）的细胞。立即轻轻吹打细胞悬液，防止细胞结团，并避免产生气泡。</li>
		<li>将微球菌核酸酶（MNase）重悬于50%甘油中，配制成1 mg/mL溶液（1.15单位/µL，于-20 °C保存），以下简称 &#34;1x&#34; 储备液。制备一个 &#34;0.1x&#34; 通过用50%甘油进行第二次1:9稀释来制备储备液（例如，900 µL的 &#34;1x&#34; MNase 和 100 µL 50% 甘油），于 -20 °C 保存。</li>
		<li>混合 5 µL 的 &#34;0.1x&#34; MNase 和 145 µL 消化缓冲液。酶始终需置于冰上。每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 µL 用消化缓冲液稀释的 MNase。6 细胞。轻轻弹击离心管以混匀，将离心管置于37 °C金属浴中，准确孵育12 min。每次处理一个样本，以确保孵育时间精确为12 min。</li>
		<li>每 1 × 10⁶ 个细胞加入 10 µL 10× MNase 停止缓冲液（110 mM Tris-HCl，pH 8.0，55 mM EDTA）6 细胞。从此步骤开始，样品必须始终保持在冰上。</li>
		<li>加入 110 µL &#34;2x RIPA 裂解缓冲液&#34; （280 mM NaCl，1.8% 聚乙二醇辛基苯基醚，0.2% 十二烷基硫酸钠（SDS），0.2% 脱氧胆酸钠，5 mM 乙二醇双（β-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）；4 °C 保存），每 1 × 10 添加高浓度蛋白酶抑制剂混合物（1:100）6 细胞。轻轻弹击管壁以混匀。</li>
		<li>在4 °C、1700 × g条件下，将离心管在微量离心机中离心15分钟。将上清液转移至新的普通1.5 mL微量离心管中（无需再使用低蛋白吸附的微量离心管），并置于冰上保存。弃去沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫沉淀（IP）
	<ol>
		<li>将蛋白A和蛋白G磁珠按1:1比例混合。每次免疫沉淀（IP）准备25 µL磁珠。</li>
		<li>加入1 mL RIPA缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，140 mM NaCl，1%聚乙二醇辛基苯基醚，0.1% SDS，0.1%脱氧胆酸钠；4 °C保存），并添加低浓度蛋白酶抑制剂（1:1000），洗涤磁珠。</li>
		<li>使用磁铁使磁珠与洗涤液分离，倾去洗涤液（约1分钟）。重复洗涤步骤两次。</li>
		<li>使用含有蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液将磁珠重悬至原始体积。</li>
		<li>如有需要，使用添加了蛋白酶抑制剂（1:1000）的RIPA缓冲液稀释染色质，使每次免疫沉淀（IP）的体积为100–200 µL。为每份IP所用染色质体积的10%保留作为输入样本。 
		注意：例如，如果每次免疫沉淀使用 200 µL，则应保留 20 µL 稀释后的染色质作为输入样本。若共进行四次免疫沉淀，染色质总体积应稀释至 820 µL。</li>
		<li>准备输入样品。向输入样品中加入100 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA），并添加蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，混匀后于55 °C孵育1小时。 
		注意：步骤 2.2.6–2.2.7 可与步骤 2.3.4 和 2.4.1 同时进行。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化样本，并用试剂盒提供的洗脱缓冲液洗脱，洗脱体积为50 µL。</li>
		<li>使用微量分光光度计测定输入样品的浓度，并将结果记录在实验记录本中。以试剂盒中的洗脱缓冲液作为空白对照。 
		注意：在小鼠神经球实验中，每次免疫沉淀使用约 6 µg DNA。</li>
		<li>在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，或使用标准设置将1 µL样品上样至DNA Bioanalyzer。剩余样品保存备用，用于后续实验中的input对照。</li>
		<li>加入10 µL洗涤后的蛋白A &amp;每 IP 使用 #38; G 磁珠，在 4 °C 下孵育 IP 1 小时。 
		注意：例如，加入 30 µL 蛋白 A &amp;#38; G 磁珠用于三次免疫沉淀。</li>
		<li>将样品置于磁架上，使磁珠分离。将之前确定数量的染色质转移至新的1.5 mL离心管中，完成分样。</li>
		<li>加入抗体，用塑料封口膜包裹管盖以防止蒸发。将样品在4 °C下旋转孵育过夜，转速为20 rpm。 
		注意：浓度应根据制造商的建议通过实验确定。</li>
		<li>第二天，使用小型离心机在室温下以2000 × g离心10秒。然后向每个免疫沉淀（IP）样品中加入10 µL磁珠，在4 °C、20 rpm转速下旋转孵育3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫沉淀洗涤与蛋白质消化
	<ol>
		<li>加入150 µL含有低浓度（1:1000）蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液至每次免疫沉淀样品中，于4 °C、20 rpm转速下旋转孵育5分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠充分分离。用移液器吸除上清液。重复此步骤进行五次洗涤。</li>
		<li>加入150 µL LiCl缓冲液（250 mM LiCl，10 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Na-脱氧胆酸钠；4 °C保存），并添加低浓度蛋白酶抑制剂（1:1000），分别加入各免疫沉淀（IP）样品中，于4 °C以20 rpm转速旋转孵育5分钟。将样品置于磁力架上，静置使磁珠分离。用移液器吸除上清液。</li>
		<li>加入150 µL冰冷的TE缓冲液（不含蛋白酶抑制剂），将样品在4 °C、20 rpm转速下旋转孵育5分钟。将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸除上清液。</li>
		<li>最后洗涤步骤完成后，将样品重悬于100 µL含有蛋白酶K（0.5 mg/mL）的TE缓冲液中，于55 °C孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA纯化与染色质免疫沉淀定量实时PCR（qPCR）
	<ol>
		<li>使用PCR纯化试剂盒纯化免疫沉淀的DNA。向每个样品中加入试剂盒提供的DNA结合缓冲液后，将离心管置于磁力架上，等待磁珠完全聚集，随后将上清液转移至纯化柱中。按照制造商说明书操作，最后用试剂盒提供的50 µL洗脱缓冲液进行洗脱。</li>
		<li>为了检测免疫沉淀是否成功，进行qPCR。理想情况下，应针对阳性对照区域和阴性对照区域设计引物。 
		注意：例如，在使用 H3K4me3 和 H3K27me3 进行免疫沉淀实验时，qPCR 应检测以下样品：H3K4me3、H3K27me3 和 IgG ChIP DNA、input DNA，以及无模板对照（NTC），并使用针对 H3K4me3 富集区域（阳性对照）和非 H3K4me3 富集区域（阴性对照）的引物；H3K27me3 的检测 likewise 采用相同策略。</li>
		<li>遵循标准操作流程进行qPCR实验12简而言之，使用SYBR Green预混液、各0.5 µL的10 µM正向和反向引物工作浓度溶液，以及2 µL的ChIP或input DNA进行qPCR反应。使用实时荧光定量PCR系统读取板孔信号。引物序列见于 表2Hwang 提供的 Gapdh 引物序列 等被使用13.</li>
		<li>将ChIP数据相对于input进行分析， 即， 输入百分比法（% IP）14. 使用以下公式计算输入百分比： 
		调整后的输入值 = 输入值的平均ct - 对数2（DF） 
		其中 DF 为起始输入的稀释因子 
		DF = IP 总体积 / 上样体积 
		% IP = 100 × 2^(校正后的输入值 - Ct (IP)) 
		其中Ct为阈值因子。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schwartzentruber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driver+mutations+in+histone+H3.3+and+chromatin+remodelling+genes+in+paediatric+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Driver mutations in histone H3.3 and chromatin remodelling genes in paediatric glioblastoma.</a> Nature. 482 (7384), 226-231 (2012).</li>
<li>Bjerke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3.3.+mutations+drive+pediatric+glioblastoma+through+upregulation+of+MYCN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Histone H3.3. mutations drive pediatric glioblastoma through upregulation of MYCN.</a> Cancer Discov. 3 (5), 512-519 (2013).</li>
<li>Bender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+H3K27me3+and+DNA+hypomethylation+are+major+drivers+of+gene+expression+in+K27M+mutant+pediatric+high-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Reduced H3K27me3 and DNA hypomethylation are major drivers of gene expression in K27M mutant pediatric high-grade gliomas.</a> Cancer Cell. 24 (5), 660-672 (2013).</li>
<li>Maleszewska, M., Kaminska, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+glioblastoma+an+epigenetic+malignancy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Is glioblastoma an epigenetic malignancy?</a> Cancers (Basel). 5 (3), 1120-1139 (2013).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Thorne, A. W., Myers, F. A., Hebbes, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 287, 21-44 (2004).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurner%2C+B+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22">Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking</a>. , (2001).</li>
<li>Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+native+chromatin+immunoprecipitation+to+interrogate+histone+variant+protein+deposition+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediumted+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transposon mediumted integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> J Vis Exp. (96), (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+cell+number+by+hemocytometry+counting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Estimation of cell number by hemocytometry counting.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Kubista, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The real-time polymerase chain reaction.</a> Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).</li>
<li>Hwang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+separable+roles+for+EZH2+in+neurogenic+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Distinct and separable roles for EZH2 in neurogenic astroglia.</a> Elife. 3, e02439(2014).</li>
<li>Haring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization.</a> Plant Methods. 3, 11(2007).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可使用户对源自基因工程脑肿瘤的神经干细胞（NS）进行天然染色质免疫沉淀（ChIP）实验。与交联ChIP相比，该方法仅适用于与DNA紧密结合的蛋白质研究6。实验所用细胞数量可根据需要调整，方案亦可按比例放大。我们每轮免疫沉淀（IP）使用1 × 106个细胞，但天然ChIP也可少至4 × 104个细胞即可完成5。在本方案中，我们通过qPCR分析ChIP所得DNA；然而，该方案亦可与下一代测序技术结合，用于全基因组水平上的蛋白质-DNA相互作用研究。我们已成功应用此ChIP方案，分析胶质瘤癌基因对肿瘤细胞基因组特定区域组蛋白修饰沉积的影响。
进行天然染色质免疫沉淀（native ChIP）时有几个关键步骤。首先，每种细胞类型的消化条件必须通过实验经验确定。大部分染色质应为单核小体（150 bp），并伴有少量二联和三联核小体峰（图3）。我们的方案可获得超过70%的单、双或三联核小体...

表观遗传事件在胶质瘤中十分常见，可能在肿瘤发病机制中发挥重要作用。事实上，在儿童高级别胶质瘤中，编码组蛋白变体H3.3和H3.1的基因常发生突变1。这些突变影响组蛋白修饰，并产生重大的表观遗传学后果2,3。在青少年至成年患者中，则常见异柠檬酸脱氢酶基因1/2（IDH1/2）的反复突变，该突变会抑制依赖α-酮戊二酸（α-KG）的组蛋白和DNA去甲基化酶，同时还存在其他染色质调控因子（如ATRX和DAXX）的遗传学改变4。因此，研究影响表观遗传调控因子的突变如何改变染色质结构和调控性组蛋白修饰具有重要意义，这些改变继而会对肿瘤细胞的转录组产生显著影响。
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种用于评估基因组中表观遗传修饰影响的有力工具5,6,7。在天然ChIP中，染色质通过微球菌核酸酶（MNase）进行消化，然后使用针对目标蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，最后从免疫沉淀的染色质复合物中纯化DNA6。该实验过程中细胞不进行固定，因此该技术仅适用于研究与DNA紧密结合的蛋白质6。由于无需交联，有助于提高抗体的特异性，因为抗体通常是针对未固定的多肽或蛋白质制备的7。此外，由于没有交联步骤，可降低非特异性且无调控功能的瞬时蛋白-DNA相互作用被固定的概率7,8。ChIP可用于鉴定特定基因组区域中组蛋白修饰的富集情况。本文详细描述了一种在源自胶质瘤基因工程小鼠模型的神经球（NS）中进行天然ChIP的实验方案。

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent</td><td>G2946-90004</td><td>生物分析仪</td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R，制冷型</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Taconic</td><td>B6-f</td><td>C57BL/6 小鼠</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Aldrich</td><td>22350-6</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Goldbio</td><td>LucK-1g</td><td></td></tr><tr><td>DiaMag1.5 磁力架</td><td>Diagenode</td><td>B04000003</td><td>用于磁珠洗涤</td></tr><tr><td>DiaMag 旋转混合仪 EU</td><td>Diagenode</td><td>B05000001</td><td>旋转混合仪</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330-057</td><td>NSC 组分</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10001D</td><td>Protein A 磁珠</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>Protein G 磁珠</td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td>用 0.1% BSA 配制 20 &amp;mu;g/mL 储存液，并分装。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>E-4884</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>乙二醇双（&amp;beta;-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>Fast SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4385612</td><td>qPCR 试剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>用于细胞冻存</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18b</td><td>用 0.1% BSA 配制 20 &amp;mu;g/mL 储存液，并分装。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td>用于肿瘤解剖</td></tr><tr><td>甘油，分子生物学级</td><td>EMD- Millipore</td><td>356352</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>Ab8580</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Millipore</td><td>07-449</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-103</td><td>平衡盐溶液</td></tr><tr><td>Fluriso</td><td>VETone</td><td>501017</td><td>吸入性麻醉剂</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>Perkin-Elmer</td><td>124262</td><td>活体光学成像系统</td></tr><tr><td>Hyqtase</td><td>HyClon</td><td>SV3003001</td><td>细胞解离液</td></tr><tr><td>氯化锂</td><td>Sigma</td><td>L8895</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>低吸附微量离心管</td><td>Corning Costar</td><td>CLS3207</td><td>低蛋白结合微量离心管</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Fisher</td><td>21-402-903</td><td>普通微量离心管</td></tr><tr><td>微球菌核酸酶</td><td>Thermo Fisher Scientific, Affymetrix</td><td>70196Y</td><td>不同批次可能有差异；应购买足够量并分装。</td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>NSC 组分</td></tr><tr><td>正常兔 IgG</td><td>Millipore</td><td>12-372</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>Invivogen</td><td>NOL-36-063</td><td>抗菌剂，使用浓度为 0.1 mg/mL。</td></tr><tr><td>NP-40（Igepal CA-630）</td><td>Sigma</td><td>18896-50ML</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>Kimble Kontes 研磨杵</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749515-0000</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>用纯水配制成 10 mg/mL 储存液；分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>DNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>10007-16</td><td>用于肿瘤解剖</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR</td><td>0241-5KG</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D670-25G</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma</td><td>L-4390</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Bp152-1</td><td>缓冲液试剂</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP 151-500</td><td>聚乙二醇辛基苯基醚</td></tr><tr><td>标准小型离心机</td><td>Fisherbrand</td><td>12-006-901</td><td>标准小型离心机</td></tr><tr><td>SZX16 显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>荧光体视显微镜</td></tr><tr><td>ViiA 7 快速 96 孔实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Applied Biosystems</td><td>4453535</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr></tbody></table>

使用小鼠脑肿瘤神经球进行天然染色质免疫沉淀

Native Chromatin Immunoprecipitation Using Murine Brain Tumor Neurospheres

表观遗传修饰可能参与胶质瘤的发生和发展。癌基因和肿瘤抑制基因的启动子及调控区域的甲基化和乙酰化改变可导致基因表达的变化，并在脑肿瘤的发病机制中发挥重要作用。天然染色质免疫沉淀（ChIP）是一种常用技术，可用于检测与DNA紧密结合的修饰或其他蛋白质。与交联ChIP不同，在天然ChIP中，细胞不经过甲醛处理以共价连接蛋白质与DNA。这种方法具有优势，因为有时交联会固定那些仅短暂与DNA相互作用、在基因调控中并无功能意义的蛋白质。此外，抗体通常是针对未固定的肽段产生的，因此在天然ChIP中抗体的特异性更高。然而，需要注意的是，天然ChIP仅适用于研究组蛋白或其他与DNA紧密结合的蛋白质。本方案描述了在小鼠脑肿瘤神经球上进行的天然染色质免疫沉淀实验。

从表达Katushka的脑肿瘤细胞中生成的肿瘤NS的示意图如下所示 图1. 图2 是整个ChIP技术的示意图。 图3 显示了脑肿瘤NS的染色质经MNase消化12分钟后得到的代表性结果，主要产生单核小体、二核小体和三核小体。ChIP完成后，可对ChIP和input DNA样本进行qPCR分析。 图4 显示了针对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）的ChIP qPCR实验的代表性数据。Gapdh是一种看家基因，其启动子区域富含H3K4me3修饰，该修饰与活跃转录相关。结果显示，Gapdh在H3K4me3修饰中富集，而在与染色质抑制区域相关的H3K27me3修饰中无富集。
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表观遗传机制在胶质瘤中经常发生改变。染色质免疫沉淀可用于研究胶质瘤中由组蛋白修饰变化引起的遗传改变后果，这些修饰调控染色质结构和基因转录。本方案描述了对小鼠脑肿瘤神经球进行的天然染色质免疫沉淀实验。

表观遗传学修饰可能参与胶质瘤的发生与发展。启动子及调控区域的甲基化和乙酰化改变……

本实验的总体目标是鉴定组蛋白修饰在特定基因组位点的富集情况。该方法有助于回答表观遗传学领域的一些关键问题，例如，影响组蛋白修饰的表观遗传调控因子发生突变后，如何改变肿瘤细胞的转录组。该技术的主要优势在于细胞无需交联处理，因而处于更接近自然的状态，这有助于提高抗体的特异性。首先，在10厘米的培养皿中从小鼠脑组织中分离实验诱导的肿瘤。如果肿瘤表达荧光蛋白，使用荧光解剖显微镜，在0.3倍放大倍率下选择相应的荧光通道观察肿瘤。用手术刀和镊子将肿瘤组织与正常脑组织分离，并在培养皿中将肿瘤切成小块。将解剖得到的肿瘤转移至含有300微升NSC培养基的1.5毫升离心管中，使用一次性注射器轻轻匀浆肿瘤组织。随后加入1毫升细胞解离培养基，在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，将细胞悬液通过70微米细胞滤网转移至50毫升离心管中。然后，用25毫升NSC培养基冲洗滤网，将悬液在室温下以300 × g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于6毫升NSC培养基中，并将肿瘤细胞悬液转移至T25培养瓶中。将细胞置于37°C、含95%空气和5%二氧化碳气氛的组织培养孵育箱中培养，直至神经球形成。收获神经球后，将每管含10⁶个神经球细胞的样品在氨基沉淀条件下以300 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并将神经球沉淀重悬于1毫升平衡盐溶液中。将悬液转移至低蛋白结合的1.5毫升微量离心管中，然后按前述条件再次离心。接下来，倒出上清液，并将细胞沉淀重悬于 95 微升消化缓冲液中，每 1×10⁶ 个细胞加入 1:100 稀释的蛋白酶抑制剂混合物。立即用移液器轻轻吹打细胞，防止细胞结团，并避免产生气泡。然后，将 5 微升 0.1× 微球菌核酸酶与 145 微升消化缓冲液混合，每 1×10⁶ 个细胞加入 5 微升稀释后的微球菌核酸酶。轻轻弹击离心管以混匀，并将离心管放入37摄氏度的加热金属块中，准确孵育12分钟。微球菌核酸酶消化以片段化染色质是该实验最关键的步骤。适当的染色质片段化对于获得高分辨率的染色质免疫沉淀（ChIP）结果至关重要。为确保该步骤成功，需依次孵育多个样品，以防止过度消化。孵育12分钟后，每1×10⁶个细胞加入10微升10×微球菌核酸酶终止缓冲液。从此步骤开始，样品必须始终置于冰上。微球菌核酸酶消化样品的Bioanalyzer分析表明，大部分DNA已被切割成单核小体、二核小体和三核小体。接下来，向每1×10⁶个细胞中加入110微升含有蛋白酶抑制剂混合液（按1:100稀释）的2×RIPA缓冲液。轻弹管壁混匀，然后在4°C、1700×g条件下离心15分钟。将含有染色质的上清液转移至普通的1.5毫升微量离心管中，并置于冰上。使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液将染色质稀释至1:1000，使每次免疫沉淀（IP）的体积为100至200微升。然后，取相当于ChIP反应体积10%的等分试样作为输入样品。通过向输入样品中加入100微升含有蛋白酶K的TE缓冲液进行处理，并在55摄氏度孵育一小时。使用PCR纯化试剂盒纯化输入样品后，用微量分光光度计测定输入样品的浓度。将结果记录在实验记录本中。每个样品每进行一次免疫沉淀（IP），加入10微升经洗涤的蛋白A和G磁珠，在4摄氏度、20 RPM转速下旋转孵育1小时。将样本置于磁力架上，使磁珠分离，然后将所需体积转移至新的1.5毫升离心管中。向每根离心管中加入适量抗体，再用塑料封口膜包裹管盖以防止蒸发。将样本在4°C条件下旋转孵育过夜，操作方式同前。第二天，将离心管在2000 × g 条件下离心10秒，然后向每个免疫沉淀样品中加入10 µL磁珠，4 °C、20 RPM 条件下旋转孵育3小时。随后，将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸去上清液，然后向每个免疫沉淀样品中加入150 µL含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，4 °C、20 RPM 条件下孵育5分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上，使磁珠分离。用移液器吸除上清液，然后向每个免疫沉淀样品中加入150微升含低浓度蛋白酶抑制剂的氯化锂缓冲液，在4摄氏度、20 RPM转速下旋转孵育5分钟。孵育结束后，将样品置于磁力架上使磁珠分离，然后用移液器吸除上清液。然后，向珠子中加入150微升不含蛋白酶抑制剂的冷TE缓冲液，在4摄氏度下以20 RPM转速旋转孵育5分钟。最后一次洗涤步骤后，将样品重悬于100微升TE缓冲液中，缓冲液中添加终浓度为0.5毫克/毫升的蛋白酶K，在55摄氏度下孵育1小时。最后，使用PCR纯化试剂盒纯化氨基沉淀的DNA。然后，为了检测免疫沉淀是否成功，使用针对阳性对照和阴性对照区域的引物进行qPCR。qPCR实验分别采用IgG ChIP DNA、组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）ChIP DNA以及组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）ChIP DNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因的引物进行扩增。代表性结果表明，Gapdh作为看家基因，仅在与活跃转录相关的H3K4me3修饰中富集，而在与染色质抑制相关的H3K27me3修饰中未见富集。完成此操作后，还可进行 ChIP-C 等其他方法，以鉴定全基因组范围内组蛋白修饰的变化。观看本视频后，您应能够充分理解如何在神经球中进行天然染色质免疫沉淀（native ChIP），以鉴定特定基因位点的组蛋白修饰。

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