活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

该光转化技术的总体目标是区分单个动物体内单个细胞与其它荧光标记细胞群体。该方法有助于回答发育生物学领域的关键问题，并使我们能够随时间推移可视化单个细胞的迁移过程。该技术的主要优势在于其侵入性极小，既可用于标记单个细胞，也可用于标记较大的细胞群体。

此外，用户可以选择特定的兴趣区域，并对目标区域进行光转化。在按照文本方案将表达光转化蛋白的转基因斑马鱼雌雄交配并收集卵子后，使用配备488纳米光源和GFP滤光片的体视显微镜筛选24小时受精龄（hpf）的胚胎。使用针或镊子手动去除胚胎的绒毛膜。

在微波炉中制备5 mL 0.8%低熔点琼脂糖溶液。待琼脂糖冷却至不烫手时，将3至4条经麻醉的转基因sox10:eos阳性48 hpf斑马鱼置于直径10 mm玻璃盖玻片底培养皿的中央。加入约1 mm厚或足以覆盖盖玻片表面的琼脂糖溶液。

然后，使用探针针将鱼体侧向排列，并根据需要进行调整，同时等待琼脂糖凝固，大约需要两分钟。琼脂糖凝固两分钟后，缓慢向培养皿中加入含有0.02%氨基苯甲酸酯三卡因的胚胎培养基，直至琼脂糖和培养皿的底面完全浸没。进行共聚焦显微镜观察时，打开共聚焦软件，并选择采集和对焦窗口。

进行预转换成像时，在采集窗口和采集设置下拉选项卡中选择成像参数。此处调用实验室特定的层扫描设置，即斑马鱼成像。将样本放置在共聚焦显微镜上，并使用粗调和微调旋钮将其调至焦点。

然后打开对焦窗口，定位到目标区域，例如背根神经节。在滤光片组菜单中，选择 c488 激光，将曝光时间设为 300 毫秒，激光功率设为 5，增益设为 75。接下来，在采集类型部分，勾选 3D 选项。

在3D捕获部分，选择“使用当前位置”，并勾选“围绕当前位置的范围”。在同一部分中，将范围设置为35，平面数设置为36，步长设置为1。选择当前位置后，点击捕获窗口底部的“开始”以获取图像。

在进行光转换过程之前，务必反复检查激光参数。当转换窗口打开时，有时需要重新调整转换设置。在采集窗口中，于采集窗口设置的下拉选项卡内，选择针对实验室的特定转换成像设置。

此处调用实验室特定设置“fish ablate full chip”。在滤镜菜单设置中，选择 c488 和 c541 激光器。将曝光时间设为 300 毫秒，激光功率设为 5，增强值设为 75，这样可在不引起光漂白或毒性的前提下产生足够的荧光信号。

在焦点窗口中，单击光操控选项卡，将激光堆栈功率设置为2，然后单击“运行”。将光栅块大小更改为1，然后单击“设置”。接着将双击大小更改为4，激光线更改为v405。

接下来，在捕获窗口中打开高级捕获设置。选择光操作选项卡，将双击重复次数更改为两次，然后单击确定。在聚焦窗口中选择 xy 选项卡。

在光操控选项卡中，仔细检查激光参数。然后设置激光参数，以实现目标细胞的光转化，同时避免周围细胞发生光转化。在采集类型下，勾选时间序列复选框，然后点击开始。

活细胞延时成像窗口打开后，选择顶部工具栏中的圆形工具。在细胞最中心的区域绘制一个圆形，然后右键单击所绘制的圆形，选择“FRAP Region”（荧光漂白恢复区域），并等待三秒钟。当所选区域变暗后，单击“停止采集”。

如果对多个动物进行成像，请返回对焦菜单中的 xy 选项卡，选择位置二，然后重复光转化步骤。如需转化一群细胞，请按照方案和激光参数操作，打开时间序列成像窗口。

现在，不再绘制圆形来对目标区域进行光漂白恢复（FRAP），而是使用线条工具在目标区域上画一条线。然后，使用刚刚演示过的相同参数对该区域进行光漂白恢复。当所有时间点的图像采集完成后，在采集窗口的“捕获设置”下拉选项卡中，选择本视频前面所述的实验室特异性标准图像序列设置。

选择 c488 激光器，并将曝光时间设为 300 毫秒，激光功率设为 5，增强值设为 75。选择 c541 激光器，并将曝光时间设为 500 毫秒，激光功率设为 10，增强值设为 75。在采集类型部分，勾选 3D 选项。

在3D捕获部分，选择使用当前位置，并勾选围绕当前位置的范围。在同一部分中，将范围设置为35，平面数设置为36，步长设置为1。可根据所需的成像深度适当增加或减少范围数值。

如果 xy 焦点选项卡中存在多个点，则在采集窗口中选择多点列表选项；否则选择当前位置。最后，在采集窗口底部点击“开始”以获取图像。

这些图示显示了来自转基因斑马鱼视网膜神经节中单个光转化前的细胞，该细胞在 sox10 调控序列的控制下表达光可转化的 eos 蛋白。经过光转化后，eos 明显存在于目标区域，而邻近细胞则未被标记。为了展示该光转化技术的应用价值，使用一条线状光对脊髓腹侧的一群细胞进行了紫外光照射。

随后，拍摄图像以显示线性区域中光转化后的 eos 蛋白。未经过光转化的 eos 蛋白则在所有其他区域可见。光转化数小时后，再次拍摄相同的图像，结果显示光转化后的 eos 阳性细胞分散分布在脊髓区域，包括背侧和腹侧位置。

这一发现与以下假设一致：腹侧脊髓细胞被重新定位至背侧位置。若操作得当，掌握该技术后可在30至45分钟内完成。在进行该操作时，重要的是要记得在光转化后采集图像，以确认目标区域确实经历了光转化。

完成此操作后，可进行其他方法，如延时成像，以观察细胞随时间的迁移和动态变化。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何在荧光标记的细胞群体中识别单个细胞。请务必注意，使用紫外光可能具有极高危险性，在执行此操作时应始终采取必要的防护措施。

例如，切勿直接凝视光源。