活完好斑马鱼的单细胞 Photoconversion

这种光转化技术的总体目标是将单个动物中的单个细胞与其他荧光细胞群区分开来。这种方法可以帮助回答该领域的关键开发问题，并使我们能够可视化单细胞迁移随时间的变化。该技术的主要优点是它是微创的，可用于标记单个细胞或更大的群体。

此外，用户可以选择特定的感兴趣区域并对所需的目标进行照片转换。在与表达光转化蛋白的雄性和雌性转基因斑马鱼交配并根据文本方案收集卵后，使用具有 488 纳米光源和 GFP 滤光片组的解剖显微镜筛选 24 个 hpf 胚胎。使用针或镊子手动去绒毛膜胚胎。

在微波炉中制备 5 毫升 0.8% 低熔点琼脂糖溶液。一旦琼脂糖冷却到触摸，将 3 到 4 条麻醉的转基因 sox10 eos 阳性 48 hpf 鱼放在 10 毫米玻璃盖玻片底部培养皿的中心。加入大约 1 毫米或足够的琼脂糖以覆盖盖玻片的表面。

然后，用探针将鱼放在两侧，根据需要进行调整，同时琼脂糖凝固，这大约需要两分钟。琼脂糖凝固 2 分钟后，向培养皿中缓慢加入含有 0.02% 氨基苯甲酸酯三卡因的胚胎培养基，直到琼脂和培养皿的底面被淹没。要进行共聚焦显微镜，请打开共聚焦软件并选择捕获和聚焦窗口。

要执行转换前成像，请在 capture window 和 capture setting 下拉选项卡下，选择成像参数。以下是特定于实验室的堆栈设置，称为 fish imaging。将标本放在共聚焦显微镜上，并使用粗调和微调旋钮使其聚焦。

然后打开焦点窗口并找到所需的感兴趣区域，例如背根神经节。在滤镜设置菜单下，选择 c488 激光器，将曝光设置为 300 毫秒，将激光功率设置为 5，并将增强设置为 75。接下来，在 capture type 部分下，选中 3D 框。

在 3D capture （3D 捕获） 部分中，选择 Use current position（使用当前位置），然后选中 range around current（当前位置附近）。在同一部分中，将范围设置为 35，将平面数设置为 36，并将步长设置为 1。选择当前位置，然后单击捕获窗口底部的 start 以获取图像。

在光转换过程之前，请务必仔细检查激光参数。有时，当转化窗口打开时，需要重新调整转化设置。在捕获窗口中，在捕获窗口设置下拉选项卡下，选择特定于实验室的转换成像设置。

此处，特定于实验室的设置称为 fish ablate full chip。在过滤器菜单集下，选择 c488 和 c541 激光器。将曝光设置为 300 毫秒，激光功率为 5，增强设置为 75，这将产生足够的荧光信号而不会引起光漂白或毒性。

在焦点窗口中，单击 photomanipulation 选项卡，将 laserstack 功率更改为 2，然后单击 go。将栅格块大小更改为 1，然后单击 set。然后将双击大小更改为 4，并将激光线更改为 v405。

接下来，在捕获窗口中打开高级捕获设置。选择 photomanipulation 选项卡，将双击重复次数更改为 2，然后单击 okay（确定）。在焦点窗口中选择 xy 选项卡。

在 photomanipulation 选项卡中，仔细检查激光参数。然后，设置激光设置以光转化感兴趣的细胞，而无需对周围的细胞进行光转化。在 capture type （捕获类型） 下，选中 Timelapse （延时摄影） 框，然后单击 start （开始）。

实时延时窗口打开后，选择顶部工具栏上的圆形工具。在单元格的最中心区域绘制一个圆圈，然后右键单击绘制的圆圈，选择 FRAP Region（FRAP 区域），并等待 3 秒钟。当它单击 Stop capture 时，所选区域应变得更暗。

如果对多只动物进行成像，请返回对焦菜单中的 xy 选项卡并选择位置 2。然后，重复 photoconversion。要转换细胞群，请按照协议和激光测光计打开延时窗口。

现在，不要画一个圆来 FRAP 感兴趣区域，而是使用线条工具在感兴趣区域上画一条线。然后，使用刚刚演示的相同参数对区域进行 FRAP。对所有点进行光转换后，在捕获窗口的捕获设置下拉选项卡下，选择本视频前面所述的特定于实验室的标准堆栈设置。

选择 c488 激光器，将曝光设置为 300 毫秒，将激光功率设置为 5，并将增强设置为 75。选择 c541 激光器，将曝光设置为 500 毫秒，将激光功率设置为 10，将增强设置为 75。在 capture type 部分下，选中 3D 框。

在 3D capture （3D 捕获） 部分中，选择 Use current position（使用当前位置），然后选中 range around current（当前位置附近）。在同一部分中，将范围设置为 35，将平面数设置为 36，并将步长设置为 1。范围编号可能会增加或减少，以适应所需的成像深度。

如果 xy 焦点选项卡中有乘点，请在捕捉窗口中选择多点列表选项。如果没有，请选择 Current Location。最后，在捕获窗口的底部，单击 Start 开始 获取图像。

这些面板显示了转基因斑马鱼神经节内的单个前光转换细胞，在 sox10 调节序列的控制下表达可光转化的 eos 蛋白。光转化后，eos 明显存在于感兴趣区域内，而没有标记相邻细胞。为了证明这种光转化技术的实用性，使用一条线将脊髓腹侧的细胞群暴露在紫外线下。

之后，拍摄图像显示线区域中的光转化 eos 蛋白。非光转化的 eos 蛋白在所有其他区域都可见。光转化数小时后，拍摄了相同的图像，显示光转化的 eos 阳性细胞散布在整个脊髓区域的背侧和腹侧位置。

这一发现与腹侧脊髓细胞重新定位到背侧位置的假设一致。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 30 到 45 分钟内完成。在尝试此过程时，请务必记住拍摄转换后图像，以确认您感兴趣的区域确实经历了光转换。

按照此程序，可以执行其他方法，例如延时成像，以观察细胞迁移和动态随时间的变化。观看此视频后，您应该对如何区分荧光细胞群中的单个细胞有很好的了解。不要忘记，使用紫外线工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取必要的预防措施。

例如，永远不要直视光线。