Name: 活完好斑马鱼的单细胞 Photoconversion (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学习利用紫外光照射对表达Eos荧光蛋白的斑马鱼进行单细胞光转换技术，实现活体单细胞标记与迁移追踪。该方法微创且可精确定位目标区域，为发育生物学研究提供重要工具。

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感谢 Bernard Kulemaka 和 Smith 实验室成员提供的有益评论和试剂指导，感谢 3i 公司的 Sam Connell 和 Brent Redford 解答成像相关问题，感谢 Deborah Bang、Karen Heed 和 Kay Stewart 对斑马鱼的饲养与护理。本研究得到了圣母大学、Elizabeth 和 Michael Gallagher 家庭、Alfred P. Sloan 基金会、圣母大学斑马鱼研究中心以及圣母大学干细胞与再生医学中心的支持。所有动物实验均依照圣母大学 IACUC 的规定，在 Cody Smith 博士的指导下进行。

所有动物实验均经圣母大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 斑马鱼样本的制备
<ol>
	<li>按照标准操作规程，将一条成年雄性与一条成年雌性 Tg(可转换蛋白) 鱼放入一个交配室中13。本研究中使用 Tg(sox10:eos) 鱼系9，因实验条件可及，但其他表达光转换蛋白的转基因品系亦可等效使用。建议设置多个交配室，以防鱼类未产卵。让鱼在交配室中过夜。</li>
	<li>次日早晨，将受精卵收集至 100 mm 培养皿中。待卵发育至受精后 24 小时（hpf）再进行筛选。</li>
	<li>若上述亲鱼为转基因杂合子，则在解剖显微镜下使用 488 nm 光源和 GFP 滤光片组合，筛选 24 hpf 培养皿中的 Tg(sox10:eos)+ 胚胎。分离出 Tg(sox10:eos)+ 胚胎，并继续培养至 48 hpf。</li>
	<li>使用针或镊子手动去除胚胎的卵膜。</li>
	<li>制备 5 mL 0.8% 低熔点琼脂糖溶液，并用微波炉加热溶解。
	<ol>
		<li>待琼脂糖冷却至可触碰温度后，将 3–4 条经麻醉处理的 Tg(sox10:eos)+ 48 hpf 鱼置于 10 mm 玻璃底培养皿中央。</li>
		<li>加入足量琼脂糖覆盖盖玻片表面，约 1 mL。使用探针针调整鱼体侧卧位置。待琼脂糖凝固以确保动物固定到位。在琼脂糖凝固过程中可能需要持续调整斑马鱼的位置14。凝固过程约需 2 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>琼脂糖凝固约 2 分钟后，缓慢向培养皿中加入含有 0.02% 氨基苯甲酸酯（Tricaine）的胚胎培养基，直至琼脂糖底部及培养皿完全浸没，体积约为 3 mL。</li>
</ol>
2. 显微镜安装与转换前成像
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜软件，选择采集和对焦窗口 [图1]。在采集窗口下，从采集设置下拉菜单中选择实验室专用的转换成像设置 [图1]。此处，实验室专用设置名为 &#34;Fish Imaging.&#34;</li>
	<li>将样本放置在共聚焦显微镜载物台上，使用粗调和微调旋钮进行对焦。</li>
	<li>打开对焦窗口，定位目标区域（例如背根神经节）。</li>
	<li>在滤光片设置菜单中选择 c488&#160; 激光。将曝光时间设为 300 ms，激光功率设为 5，增益设为 75 [图2]。</li>
	<li>在 采集类型 部分勾选 3D 选项。在 3D 采集 部分，选择 使用当前位置 并勾选 围绕当前位置。在同一部分中，将范围设为 35，平面数设为 36，步进大小设为 1。可根据成像区域的深度适当增加或减少范围。对于脊髓，通常设置 35–40 层堆栈即可满足需求 [图5]。</li>
	<li>选择当前位置 [图5]。</li>
	<li>点击采集窗口底部的“开始”按钮以获取图像。</li>
</ol>
3. 单细胞光转化
<ol>
	<li>打开共聚焦软件，选择采集和对焦窗口 [图1]。在采集窗口下，从采集设置下拉菜单中选择实验室特定的转化成像设置 [图1]。此处，实验室特定的设置名为 &#34;Fish ablate full chip.&#34;</li>
	<li>在滤光片设置菜单中选择 c488 和 c541 激光。如果未使用相同的显微镜软件，请找到用于选择不同激光的菜单，并选择 488 nm 和 541 nm 激光。将曝光时间设为 300 ms，激光功率设为 5，增益设为 75 [图2]。这些激光参数的选择基于在不引起光漂白或光毒性的前提下产生足够的荧光信号。若观察到光毒性或光漂白现象，请降低激光功率或曝光时间。</li>
	<li>打开对焦窗口，并点击对焦窗口中的光操作选项卡。相应调整激光参数。将激光堆栈功率改为 2，然后点击 Go。将扫描块大小（Raster block size）改为 1，然后点击 Set。将双击大小（Double-click size）改为 4。将激光线改为 v405 [图3]。</li>
	<li>在采集窗口中打开高级采集设置。选择光操作选项卡，并将双击重复次数（Double-click repetitions）改为 2。点击确定 [图4]。</li>
	<li>在对焦窗口中选择 XY 选项卡。再次检查步骤 2 中光操作选项卡中的激光参数 [图3，图4]。设置激光参数，以实现对目标细胞的光转化，同时避免周围细胞发生光转化。
	<ol>
		<li>若相邻细胞出现光转化，请降低激光功率；若目标细胞未发生光转化，可适当提高激光功率。理想情况下，应将激光功率设置为仅转化目标区域，而不影响周围区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在采集类型下勾选时间序列（timelapse）选项，然后点击 Start [图6A]。</li>
	<li>当实时时间序列窗口打开后，在顶部工具栏中选择圆形工具 [图7]。</li>
	<li>在细胞最中心区域绘制一个圆。右键点击所绘制的圆，选择 FRAP 区域，并等待 3 秒。所选区域应变暗 [图8]。点击 停止采集。</li>
	<li>若需对多个动物进行成像，请返回对焦菜单中的 XY 选项卡，并选择位置 2，然后重复步骤 4.1–4.6。</li>
	<li>若需转化一群细胞，请按照步骤 4.1–4.4 的方案和激光参数操作，但不要使用圆形工具标记 FRAP 区域，而应改用线条工具。在目标区域上绘制一条线，并使用上述相同参数对该区域进行 FRAP 操作。</li>
</ol>
4. 光转化后成像
<ol>
	<li>所有点完成光转化后，选择转换前成像步骤3中所述的实验室特定标准图像堆栈设置。该设置位于采集窗口的捕获设置下拉选项卡中 [图5]。</li>
	<li>选择c488激光器，将曝光时间设为300 ms，激光功率设为5，增益设为75 [图2]。</li>
	<li>在与c488激光器相同的菜单下选择c541激光器。将曝光时间设为500 ms，激光功率设为10，增益设为75 [图9]。</li>
	<li>在采集类型部分勾选3D选项。在3D采集部分，选择使用当前位置并勾选“围绕当前位置的范围”。在同一部分中，将范围设为35，平面数设为36，步长设为1。可根据所需的成像深度适当增加或减少范围数值 [图5]。</li>
	<li>如果XY焦点选项卡中存在多个点，则在采集窗口中选择多点列表选项；否则选择当前位置。</li>
	<li>点击采集窗口底部的“开始”按钮以获取图像。</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
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<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在复杂的组织中，不同类型的细胞会组织成特定的区域。近年来，已有技术被用于标记这些大型组织结构中的单个细胞1,2,3。本文展示了两种可用于可视化复杂组织内单个细胞相互作用以及细胞群体相互作用的技术。光转化技术的优势在于研究人员能够对细胞进行空间特异性的标记。借助具备在较大成像窗口内选择性照射较小成像区域功能的显微镜，可以对单个细胞或单个细胞区域进行区别于其他细胞的标记。目前已有多种可光转化蛋白被引入科研领域，使该技术得到更广泛的应用7。由于能够在细胞内对蛋白进行光转化，研究人员已利用该技术或类似方法研究细胞迁移、细胞分化以及神经环路分析。
尽管软件和特定激光参数与我们实验室的条件相关，但本文展示了利用光转化蛋白 Eos 在神经节内区分单个细胞的通用能力。遗憾的是，大多数可用于驱动荧光蛋白表达的遗传调控区域在发育早期阶段会在神经节内广泛表达。这很可能是因...

多种不同的细胞相互作用，共同构建并维持复杂的动物和植物组织。这些细胞常常相互交错，在单细胞水平上难以与邻近细胞区分，除非使用需要组织固定的高分辨率显微镜技术。然而，为了理解这些组织如何形成、维持以及发生病变，至关重要的是研究组织内单个细胞随时间推移的相互作用方式。理想情况下，这类实验需要以非侵入性的方式对组织内的单个细胞进行标记，且无需固定步骤。目前，科学家已开发出多种技术来实现这一目标1,2,3,4。
水母绿色荧光蛋白（GFP）的发现与应用是一种令人振奋的方法，使得在组织环境中对特定细胞进行标记成为可能1。通过使用细胞特异性启动子，可以在遗传水平上选择性地标记特定的细胞亚群1。另一种方法是利用病毒诱导GFP表达，从而实现用户选定的GFP表达模式3,4。尽管这些方法非常有用，但基于遗传手段的GFP表达无法在组织内的特定细胞亚群中实现用户指定的表达；而病毒介导的GFP表达虽然具有优势，却可能具有侵入性。随着GFP衍生物的开发以及诸如Brainbow等巧妙技术的出现，能够在组织中更稀疏地表达不同的荧光蛋白，从而使得在复杂组织中观察单个细胞及其相互作用成为可能2,5。然而，这些方法对细胞的标记是随机的。如果实验需要对由研究者明确定义的单个细胞或细胞群体进行可视化，则这些方法存在局限性。对于此类实验，若能拥有一种可遗传表达的荧光蛋白，并可通过操作在单细胞水平上将其与其他荧光或非荧光细胞区分开来，将具有显著优势。
为了实现这一目标并可视化复杂活体组织中单个细胞的细胞生物学行为，科学界采用对不同荧光蛋白进行单细胞光转化的技术6,7,8。通过基因调控表达一种光可转化蛋白（例如，eos、kaede等），该蛋白在紫外光（488 nm）照射下会从绿色荧光转变为红色荧光，从而可将单个细胞与其周围荧光标记的邻近细胞区分开来6,7,8。该方法利用连接在共聚焦显微镜上的装置，将激光束引导至一个衍射极限范围内的特定区域。借助该技术，我们可以按照用户自定义的方式标记单个细胞或较大规模的细胞群体9,10,11。与通过病毒载体向单细胞注射GFP相比，该技术侵入性极小。作为概念验证，我们展示了可在周围神经系统中的神经节内对单个细胞进行光转化，也可对位于脊髓腹侧等较大范围的细胞群体进行光转化9,10,11,12。随后，我们可在24小时后观察这些光转化后的细胞群体，以深入了解其在发育过程中的迁移与分化行为。

<table><tbody><tr><td>&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;Tg(&lt;em&gt;sox10:eos&lt;/em&gt;)&lt;/font&gt;&lt;font class=&quot;字体0&quot;&gt; 斑马鱼个体&lt;/font&gt;</td><td></td><td></td><td>鱼类由圣母大学鱼类设施提供并进行杂交繁殖</td></tr><tr><td>100 X 15 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>胚胎培养基</td><td></td><td></td><td>胚胎培养基由圣母大学鱼类养殖 facility 每周配制并提供，包含 5 L RO 水、30 μL 亚甲蓝和 200 mL 盐母液。</td></tr><tr><td>0.8% 低熔点琼脂糖</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 × 10 mm 玻璃盖玻片底培养皿</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>解剖针探头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002% 3-氨基苯甲酸酯（Tricaine）</td><td>Fluka 分析级</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>配备GFP滤光片的荧光解剖显微镜</td><td>蔡司 Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备激发GFP和RFP滤光片组的激光共聚焦显微镜</td><td>3i 转盘共聚焦显微镜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于光转化的紫外光源（激光）</td><td>405 nm 激光器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 软件</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

动物和植物组织由不同类型的细胞群体组成。这些细胞通过随时间相互作用来构建并维持组织，当其功能受到干扰时可能导致疾病。科学家已开发出巧妙的技术，通过在部分细胞中表达荧光蛋白，来研究完整组织内细胞的特性及其自然动态。然而，在某些情况下，实验需要对组织内的细胞进行更精确的可视化观察，有时需达到单个细胞或特定细胞群体的水平。为了实现对细胞群体中单个细胞的可视化，科学家采用了荧光蛋白的单细胞光转化技术。为演示该技术，本文展示了如何将紫外光定向照射至完整活体斑马鱼中表达Eos蛋白的特定细胞，随后在24小时后成像观察这些发生光转化的Eos+细胞在组织中的变化情况。本文描述了两种技术：单细胞光转化和细胞群体的光转化。这些技术可用于可视化细胞间的相互作用、细胞命运与分化过程以及细胞迁移行为，因而适用于多种生物学问题的研究。

荧光蛋白的光转化可用于标记组织内不同的细胞6。为演示此技术，使用了Tg(sox10:eos)鱼类9，使其在sox10调控序列驱动下表达可光转化蛋白Eos。在48 hpf时，先将Tg(sox10:eos)动物固定，然后成像以检测可能发生的非特异性光转化。随后观察到Eos未光转化的荧光信号，而Eos光转化后的荧光信号较弱（图10）。实验过程中将动物置于黑暗环境中，以确保非特异性光转化降至最低。接着，利用共聚焦显微镜系统对感兴趣区域进行紫外光照射。为确认单个细胞因紫外光照射而发生光转化，我们采集了覆盖光转化区域的z轴层扫图像。结果一致表明，成功实现了光转化：在感兴趣区域外几乎未检测到未转化的Eos信号，而在感兴趣区域内则明显存在光转化后的Eos信号。最终图像显示，神经节内一个细胞被明确地标记出来，与其邻近细胞清晰区分（图10</s...

本文介绍了一种通过紫外光照射活体动物中表达荧光蛋白Eos的特定区域，实现细胞光转化的实验方案。

动物和植物组织由不同类型的细胞群体构成。这些细胞在时间进程中相互作用，以构建并维持组织结构，并可能引发……

该光转化技术的总体目标是区分单个动物体内单个细胞与其它荧光标记细胞群体。该方法有助于回答发育生物学领域的关键问题，并使我们能够随时间推移可视化单个细胞的迁移过程。该技术的主要优势在于其侵入性极小，既可用于标记单个细胞，也可用于标记较大的细胞群体。此外，用户可以选择特定的兴趣区域，并对目标区域进行光转化。在按照文本方案将表达光转化蛋白的转基因斑马鱼雌雄交配并收集卵子后，使用配备488纳米光源和GFP滤光片的体视显微镜筛选24小时受精龄（hpf）的胚胎。使用针或镊子手动去除胚胎的绒毛膜。在微波炉中制备5 mL 0.8%低熔点琼脂糖溶液。待琼脂糖冷却至不烫手时，将3至4条经麻醉的转基因sox10:eos阳性48 hpf斑马鱼置于直径10 mm玻璃盖玻片底培养皿的中央。加入约1 mm厚或足以覆盖盖玻片表面的琼脂糖溶液。然后，使用探针针将鱼体侧向排列，并根据需要进行调整，同时等待琼脂糖凝固，大约需要两分钟。琼脂糖凝固两分钟后，缓慢向培养皿中加入含有0.02%氨基苯甲酸酯三卡因的胚胎培养基，直至琼脂糖和培养皿的底面完全浸没。进行共聚焦显微镜观察时，打开共聚焦软件，并选择采集和对焦窗口。进行预转换成像时，在采集窗口和采集设置下拉选项卡中选择成像参数。此处调用实验室特定的层扫描设置，即斑马鱼成像。将样本放置在共聚焦显微镜上，并使用粗调和微调旋钮将其调至焦点。然后打开对焦窗口，定位到目标区域，例如背根神经节。在滤光片组菜单中，选择 c488 激光，将曝光时间设为 300 毫秒，激光功率设为 5，增益设为 75。接下来，在采集类型部分，勾选 3D 选项。在3D捕获部分，选择“使用当前位置”，并勾选“围绕当前位置的范围”。在同一部分中，将范围设置为35，平面数设置为36，步长设置为1。选择当前位置后，点击捕获窗口底部的“开始”以获取图像。在进行光转换过程之前，务必反复检查激光参数。当转换窗口打开时，有时需要重新调整转换设置。在采集窗口中，于采集窗口设置的下拉选项卡内，选择针对实验室的特定转换成像设置。此处调用实验室特定设置“fish ablate full chip”。在滤镜菜单设置中，选择 c488 和 c541 激光器。将曝光时间设为 300 毫秒，激光功率设为 5，增强值设为 75，这样可在不引起光漂白或毒性的前提下产生足够的荧光信号。在焦点窗口中，单击光操控选项卡，将激光堆栈功率设置为2，然后单击“运行”。将光栅块大小更改为1，然后单击“设置”。接着将双击大小更改为4，激光线更改为v405。接下来，在捕获窗口中打开高级捕获设置。选择光操作选项卡，将双击重复次数更改为两次，然后单击确定。在聚焦窗口中选择 xy 选项卡。在光操控选项卡中，仔细检查激光参数。然后设置激光参数，以实现目标细胞的光转化，同时避免周围细胞发生光转化。在采集类型下，勾选时间序列复选框，然后点击开始。活细胞延时成像窗口打开后，选择顶部工具栏中的圆形工具。在细胞最中心的区域绘制一个圆形，然后右键单击所绘制的圆形，选择“FRAP Region”（荧光漂白恢复区域），并等待三秒钟。当所选区域变暗后，单击“停止采集”。如果对多个动物进行成像，请返回对焦菜单中的 xy 选项卡，选择位置二，然后重复光转化步骤。如需转化一群细胞，请按照方案和激光参数操作，打开时间序列成像窗口。现在，不再绘制圆形来对目标区域进行光漂白恢复（FRAP），而是使用线条工具在目标区域上画一条线。然后，使用刚刚演示过的相同参数对该区域进行光漂白恢复。当所有时间点的图像采集完成后，在采集窗口的“捕获设置”下拉选项卡中，选择本视频前面所述的实验室特异性标准图像序列设置。选择 c488 激光器，并将曝光时间设为 300 毫秒，激光功率设为 5，增强值设为 75。选择 c541 激光器，并将曝光时间设为 500 毫秒，激光功率设为 10，增强值设为 75。在采集类型部分，勾选 3D 选项。在3D捕获部分，选择使用当前位置，并勾选围绕当前位置的范围。在同一部分中，将范围设置为35，平面数设置为36，步长设置为1。可根据所需的成像深度适当增加或减少范围数值。如果 xy 焦点选项卡中存在多个点，则在采集窗口中选择多点列表选项；否则选择当前位置。最后，在采集窗口底部点击“开始”以获取图像。这些图示显示了来自转基因斑马鱼视网膜神经节中单个光转化前的细胞，该细胞在 sox10 调控序列的控制下表达光可转化的 eos 蛋白。经过光转化后，eos 明显存在于目标区域，而邻近细胞则未被标记。为了展示该光转化技术的应用价值，使用一条线状光对脊髓腹侧的一群细胞进行了紫外光照射。随后，拍摄图像以显示线性区域中光转化后的 eos 蛋白。未经过光转化的 eos 蛋白则在所有其他区域可见。光转化数小时后，再次拍摄相同的图像，结果显示光转化后的 eos 阳性细胞分散分布在脊髓区域，包括背侧和腹侧位置。这一发现与以下假设一致：腹侧脊髓细胞被重新定位至背侧位置。若操作得当，掌握该技术后可在30至45分钟内完成。在进行该操作时，重要的是要记得在光转化后采集图像，以确认目标区域确实经历了光转化。完成此操作后，可进行其他方法，如延时成像，以观察细胞随时间的迁移和动态变化。观看本视频后，您应能够很好地掌握如何在荧光标记的细胞群体中识别单个细胞。请务必注意，使用紫外光可能具有极高危险性，在执行此操作时应始终采取必要的防护措施。例如，切勿直接凝视光源。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

活完好斑马鱼的单细胞 Photoconversion

多光子显微镜能够调控低能量光子，实现深层光学穿透并降低光毒性。我们介绍了该技术在斑马鱼胚胎活细胞标记中的应用。该方案可轻松适用于多种光响应分子的光诱导实验。...

活体斑马鱼胚胎中的双光子诱导光激活

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

本文描述了一种利用钛宝石飞秒激光振荡器的双光子吸收效应，对含有笼锁型荧光蛋白的单个细胞进行光激活的方法。为了对光激活的细胞进行命运图谱绘制，采用免疫组织化学技术。该技术可应用于任何类型的细胞。...

斑马鱼单细胞命运图谱绘制

本文介绍了一种在活体斑马鱼胚胎中对光转化荧光蛋白（PCFPs）进行光激活转换，并在发育过程中的特定时间点追踪已光转化蛋白的方法。该方法可用于监测活体脊椎动物个体发育过程中不同发育事件所涉及的细胞生物学过程。...

利用光转化蛋白在斑马鱼发育过程中进行细胞示踪

本视频展示了利用表达光可转换绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼幼鱼追踪白细胞募集的过程。通过将红色荧光染料标记的细菌预先注射到内耳囊中并诱导光转换，可观察白细胞在体内的迁移、吞噬及扩散过程，从而深入了解免疫反应动态。...

基于光转化的细菌感染转基因斑马鱼中白细胞追踪

研究癌前细胞进展的早期事件及其与先天免疫细胞的相互作用，对于理解与治疗癌症至关重要。本文描述了一种条件性诱导上皮细胞转化的方法，并对表达HRASG12V的斑马鱼幼鱼皮肤细胞与先天免疫细胞之间的相互作用进行后续活体成像。...

利用可诱导的Gal4/UAS表达系统对幼年斑马鱼皮肤中先天免疫细胞与癌前细胞相互作用进行活体成像

成像细胞器及其他亚细胞结构的动态行为 体内 可以揭示它们在生理和疾病状态下的功能。本文介绍了对两种细胞器——中心体和线粒体——进行遗传标记的方法，并利用宽场显微镜和共聚焦显微镜对活体斑马鱼胚胎中这些细胞器的动态行为进行成像。...

活体斑马鱼胚胎中亚细胞结构的成像

我们建立了光转换PSmOrange系统，作为一种强大、直接且成本低廉的工具，用于 体内...

利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

斑马鱼视网膜再生的研究主要采用固定视网膜组织进行。然而，再生反应过程中会发生诸如核间期迁移（INM）等动态过程，这些过程需要通过活细胞成像来探究其潜在机制。本文中，我们描述了利用多光子显微镜实时监测核间期迁移（INM）的培养与成像条件。...

成年转基因斑马鱼视网膜外植体的培养及其通过多光子显微镜进行的活细胞成像

本方案描述了一种在活体斑马鱼胚胎的心内膜细胞中对Kaede荧光蛋白进行光转化的方法，该方法可用于追踪心内膜细胞在房室管及房室心脏瓣膜发育过程中的动态变化。...

通过细胞光转化追踪斑马鱼胚胎中的心内膜组织运动

我们介绍了一种高效且易于使用的方案，用于制备斑马鱼胚胎的原代细胞培养物，以进行转染和活细胞成像；同时提供了一种从成年斑马鱼脑组织制备原代细胞的方案。...

斑马鱼原代细胞的培养与转染

学习利用紫外光照射对表达Eos荧光蛋白的斑马鱼进行单细胞光转换技术，实现活体单细胞标记与迁移追踪。该方法微创且可精确定位目标区域，为发育生物学研究提供重要工具。

活体完整斑马鱼中的单细胞光转化

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