小鼠脂肪组织的采集和 RNA 分析处理

该程序的总体目标是确保从不同小鼠中充分收集白色脂肪组织库的样本，并从组织中分离出大量优质 RNA。这种方法可以回答代谢、生物化学和分子生物学领域的关键问题，例如，与治疗或转基因小鼠脂肪组织中的基因表达有关。该技术的主要优点是它允许从通常 RNA 含量较低的脂肪组织中分离出大量优质 RNA。

演示该程序的是我实验室的研究助理 Emilie Pepin。对小鼠实施安乐死后，根据文本协议切开白线上的皮肤，然后从胸腔中部朝右臂切开两个约 2 厘米的切口，靠近右后肢上方的生殖器官。拉伸打开的皮肤的一角，并使用 22 号针将其固定在垫子上。

然后，固定另一个角落。使用尽可能平贴皮肤的手术剪刀，对腹部皮下脂肪 （SCF） 进行钝性解剖，然后将其转移到一块预先切割的铝箔上。对动物的左侧重复解剖。

然后，将收集的左右脂肪垫拉入铝箔中，并使用液氮冷冻样品。要进入内脏脂肪组织，请沿白线切开腹肌。然后，从生殖器向鼠标两侧的背部在腹部肌肉上切开一个切口。

生殖器官周围的脂肪是性腺周围脂肪，或 PGF。将左右脂肪垫从附睾、睾丸和导管上拆下，并将其转移到预先标记的铝箔上。然后，将样品冷冻在液氮中。

从左侧开始，通过将肠道从腹腔移动到右侧来暴露肾脏。这里看到的围绕肾脏和肾上腺的脂肪组织是肾周脂肪或 PRF。在收集 PRF 之前分离并去除肾上腺。

这可能很乏味，因为它们比脂肪组织更粉红色。现在，将 PRF 与后肌肉壁分离并切开输尿管，即将 PRF 和肾脏与身体其他部分分开的肾动脉和静脉。然后，通过切割和去除肾包膜将 PRF 从肾脏中分离出来。

分离右侧 PRF 后，将样品与左侧的组织一起转移到铝箔上，并使用液氮冷冻样品。根据文本方案，在液氮中冷却 1.5 毫升不含 RNase 的锥形管、研钵和研杵以及抹刀。将脂肪组织样本放入研钵中，然后用几层牛皮纸将研杵从液氮中取出，放入研钵中。

用纸握住杵，用锤子敲击杵顶部一两次。接下来，通过旋转运动研磨样品，直到获得细粉。然后，取出研杵，从液氮中取出刮刀，用它将样品转移到相应的预冷 1.5 毫升锥形管中。

将刮刀浸回液氮中，以防止样品熔化。此外，将锥形管放在干冰上，以防止样品解冻。用研磨样品填充锥形管至约 2/3 容量，以获得足够的 RNA 产量。

然后，根据文本方案准备剩余的样品。在化学罩下，穿着实验室外套、手套和安全眼镜，从液氮中取出研磨样品。慢慢打开试管，加入 500 微升苯酚溶液。

关闭管盖并以最大速度涡旋约 5 秒钟，然后缓慢小心地打开管子以释放氮气中的压力。将听到从管中流出的空气的声音。将另外 500 微升苯酚溶液移液到试管中。

然后，涡旋并像以前一样慢慢打开它。涡旋样品直至完全溶解。然后，在处理其他样品之前，打开试管以释放压力。

处理完所有样品后，以最大速度短暂涡旋，并在室温下孵育 5 分钟。将试管在 12， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟。然后，将试管恢复到室温。

为避免污染，对于每个样品，使用带有过滤尖端的 P1000 移液器，通过刺穿试管侧面附近的脂质相，从中间粉红色层中分离出尽可能多的 RNA。将 RNA 分配到新的锥形管中，不要接触管的侧面，以防止转移尖端外部的脂质。向每个样品中加入 200 μL 纯氯仿，倒置混合试管 15 秒。

然后，在室温下孵育样品 10 分钟后，将试管在 12， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 15 分钟，并将试管恢复到室温。对于每个样品，使用 P1000 移液器和过滤吸头将尽可能多的含水性透明 RNA 的顶部相转移到第二组相应的锥形管中。接下来，向每个样品中加入 500 微升 100% 异丙醇，倒置混合试管 15 秒。

然后，将样品在室温下孵育 10 分钟。将试管在 12， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，然后将试管恢复到室温。将异丙醇从每根试管中倒出，将其丢弃。

现在，向每个样品中加入 1 毫升 75% 乙醇，并以最大速度短暂涡旋试管。然后，将样品在 7， 500 倍 G 和 4 摄氏度下离心 5 分钟。离心样品并使其达到室温后，倒置每个试管并在牛皮纸上轻敲以去除任何残留的乙醇，以丢弃 75% 乙醇。

盖上盖子，将 RNA 沉淀风干约 15 至 20 分钟。评估 RNA 沉淀的大小后，向每个样品中加入 10 至 25 μL 不含 RNase 的水。将样品在 60 摄氏度的加热块中孵育 5 分钟。

然后，短暂涡旋试管。将样品在同一个加热块中再孵育 5 分钟。然后，快速旋转所有样品并立即将它们放在冰上。

根据文本方案对脂肪组织中的基因表达进行 RT-PCR。正如预期的那样，与正常饮食的同窝小鼠相比，高脂肪饮食的小鼠体重增加和体重增加。与正常饮食小鼠相比，肥胖小鼠的 PGF 、 PRF 和 SCF 重量增加了两倍多。

该表显示，对于每个白色脂肪组织，通过苯酚溶液分离 RNA 产生的样品的 OD260 与 OD280 约为 2.0，这被认为是 RNA 的纯度。从该条形图中可以看出，实时 PCR 数据显示，与正常饮食小鼠相比，肥胖小鼠的 PGF、PRF 和 SCF 中的瘦素 mRNA 表达显著升高。在瘦素 mRNA 表达中观察到的差异不是由于 s16 的变异引起的，s16 是用于使两组小鼠之间的结果正常化的参考基因，因为 CT 值没有改变。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住在 RNA 提取过程中在无 RNase 的环境中工作。按照此程序，可以执行其他方法，如实时 PCR 扩增，以回答基因表达修饰等其他问题。

发展后，这项技术为新陈代谢领域的研究人员探索与啮齿动物肥胖和糖尿病相关的脂肪组织调节铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何分离不同的脂肪垫并从中分离 RNA 有了很好的了解。不要忘记，使用苯酚溶液可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿着实验服和手套。