Name: 小鼠脂肪组织的采集和 RNA 分析处理 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习从小鼠白色脂肪组织采集到高质量RNA提取的完整实验流程，适用于代谢、生物化学和分子生物学研究。该方法可解决脂肪组织RNA含量低导致的提取难题，为基因表达分析提供可靠技术支撑。

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本工作由加拿大糖尿病协会资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

高脂饮食喂养后，与正常饮食喂养的小鼠相比，肥胖小鼠的体重和白色脂肪组织重量均增加。使用苯酚溶液提取的RNA具有良好的纯度。瘦素（leptin）是一种主要由脂肪组织产生的脂肪因子，已知其与脂肪质量呈正相关16。正如预期，随着脂肪质量的增加，肥胖小鼠中瘦素mRNA的表达也相应升高。
该方法包含若干关键步骤。其中最主要的一步是避免不同白色脂肪组织储存部位之间的交叉污染，因为已知不同的脂肪组织储存部位具有不同的功能2,5。污染可能导致后续应用中产生误导性结果。此外，由于脂肪暴露于空气中后容易干燥，因此若需称重，建议在不同小鼠之间以规律且一致的速度收集白色脂肪组织，否则脂肪垫的总重量可能不准确。为了获得高质量和高得率的RNA，遵循近期发表的MIQE指南具有重要意义17。特别是，在研磨过程中将样品制成极细的粉末，有助于最大化得率，从而在RNA提取过程中增加组织粉末与苯酚溶液之间的接触...

肥胖是一种全球性流行病，可能导致2型糖尿病等并发症1。饮食诱导的肥胖动物模型和基因修饰动物模型常被用于肥胖及其相关并发症的研究。传统上，白色脂肪组织被认为是储存多余能量的场所，主要由脂质构成，而棕色脂肪组织则将能量转化为热量2,3。脂肪组织具有动态特性，其体积会随着食物摄入量和体力活动等多种因素的变化而发生扩张或收缩。因此，为了确定导致这些变化的影响因素，必须进行充分的脂肪组织采集与处理4。
在白色脂肪组织中，皮下脂肪库和内脏脂肪库具有不同的特性（如解剖定位和功能）是普遍公认的2,5。因此，为了避免出现相互矛盾的结果或较大的变异性，在采集脂肪垫时需注意避免不同脂肪库之间的交叉污染。
此外，从小鼠白色脂肪组织中分离RNA或蛋白质时存在三个主要挑战。首先，在肥胖小鼠中收集脂肪垫并非易事，因为不同白色脂肪储存部位之间的边界并不总是清晰可辨，这与其他器官（如肾脏和心脏）不同。6第二，由于脂肪组织含有较高的脂质，在提取RNA或蛋白质时，脂质会在上层形成一层漂浮物，阻碍对样本的直接接触。第三，与棕色脂肪组织或其他组织相比，白色脂肪组织的RNA和蛋白质含量显著较低，这在使用幼龄小鼠、饲喂正常（N）饮食的小鼠以及预期脂肪质量较低的小鼠时尤为突出，成为主要关注问题。即 基因敲除模型、药物处理、运动训练等7,8.
因此，选择合适的方法从脂肪组织中分离RNA至关重要。除酚/氯仿抽提法外，另一种方法是使用商业化试剂盒。这类试剂盒通常基于初始的酚抽提步骤，随后通过离心柱进行RNA纯化9。然而，这些试剂盒通常成本较高，获得的RNA得率较低，且RNA质量可能不稳定，但操作更省时。相比之下，本文所述酚溶液/氯仿抽提法最大的优势在于可从同一样本中同时分离RNA、DNA和蛋白质10。由于小鼠脂肪垫通常体积较小，提取的RNA和蛋白质量较少（尤其是在瘦型小鼠模型中），这些方案能够最大限度地从少量样本中获取更多数据。
本文的目的是详细描述一种方法，以确保从小鼠的三个白色脂肪组织库中充分采集样本，并获得高质量和足量的RNA。按照本方案获得的RNA可用于进行实时PCR检测。本方案不适用于从原代培养的脂肪细胞中分离RNA。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X TE 溶液（10 mM Tris-HCl 和 1 mM EDTA&amp;bull;Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，pH 8.0）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>26 G 针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>金属浴（干式加热器）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（1 U/&amp;micro;l）&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) 荧光染料&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>滤芯吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子&amp;nbsp;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>锤子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高脂啮齿类动物饲料</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇&amp;nbsp;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>瘦素正向PCR引物（5&amp;rsquo;-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3&amp;rsquo;）10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>瘦素反向PCR引物（5&amp;rsquo;-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3&amp;rsquo;）10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maxima 逆转录酶（酶及5x缓冲液）</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>纳米纯水（即超纯水）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁腈检查手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁腈手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常啮齿类动物饲料</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯酚溶液（TRIzol）&amp;nbsp;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>预先标记的铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英分光光度计比色皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR管条架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR管条架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>随机六聚体&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>实时PCR Rotor Gene系统&amp;nbsp;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler</td><td></td></tr><tr><td>带制冷功能的台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的1.5 mL离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无RNase的1.5 mL螺口管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无RNase的PCR管条（0.2 mL）及管盖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无RNase水&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR仪</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR管条（0.1 mL）及管盖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16正向PCR引物（5&amp;rsquo;-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3&amp;rsquo;）10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16反向PCR引物（5&amp;rsquo;-ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3&amp;rsquo;）10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢研钵和研杵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术垫</td><td>自制，由泡沫板包裹一次性吸水垫制成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪&amp;nbsp;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>热循环仪&amp;nbsp;</td><td>Biometra</td><td>Thermocycler</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>药匙</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脂肪组织采集与rna分析前处理

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

与其他组织相比，白色脂肪组织含有较少的RNA和蛋白质，因此在进行实时PCR和Western Blot等下游应用时面临挑战，因其主要成分为脂质。从脂肪组织样本中提取RNA也较为困难，需要额外步骤以避免脂质干扰。本文介绍了一种从小鼠中采集三种解剖位置不同的白色脂肪组织、处理样本并进行RNA提取的实验方法。我们进一步描述了cDNA的合成以及利用实时PCR进行基因表达分析的实验步骤。本方案可有效减少采集过程中动物毛发和血液对脂肪组织的污染，以及不同脂肪组织之间的交叉污染。该方法经过优化，能够确保提取RNA的数量和质量满足要求。本方案可广泛应用于各类需要获取小鼠脂肪组织样本进行常规实验（如实时PCR）的动物模型，但不适用于原代脂肪细胞培养中的RNA提取。

按照解剖程序，从两组小鼠（正常饮食组和高脂饮食组）中采集了三种白色脂肪组织并称重。与正常饮食组小鼠相比，高脂饮食组小鼠的最终体重和体重增加均显著升高（表1）。此外，与正常饮食组相比，肥胖小鼠的前列腺周围脂肪（PGF）、肾周脂肪（PRF）和皮下脂肪（SCF）重量均增加了2倍以上。
在对分离的RNA进行任何实验之前，需按照步骤4.9所述评估其纯度。对于每份白色脂肪组织，采用酚溶液法提取RNA所得样品质量合格，其OD260/OD280比值约为2.0，符合RNA纯度标准（表2）。实时PCR结果显示，与正常饮食（N饮食）小鼠相比，肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF中瘦素（leptin）mRNA表达水平显著升高（图4A）。事实上，两组小鼠之间leptin mRNA表达的差异并非源于用于结果标准化的参照基因s...

本文的目的是介绍一种从小鼠体内采集不同白色脂肪组织、处理脂肪样本并提取RNA的逐步操作流程。

小鼠脂肪组织采集与RNA分析前处理

与其他组织相比，白色脂肪组织在实时荧光定量 PCR 等下游应用中的 RNA 和蛋白质含量显著较低。

本实验的总体目标是从不同小鼠中充分采集白色脂肪组织样本，并从组织中分离出大量高质量的RNA。该方法可用于解答代谢学、生物化学和分子生物学领域中的关键问题，例如经处理或基因修饰小鼠脂肪组织中的基因表达情况。该技术的主要优势在于，它能够从通常RNA含量较低的脂肪组织中分离出大量高质量的RNA。演示该操作的是来自我实验室的研究助理 Emilie Pepin。在处死小鼠后，按照文本方案沿腹白线切开皮肤，然后从胸廓中部向右前肢方向以及靠近右后肢上方的生殖器官附近各做一条长约两厘米的切口。拉伸打开后的一角皮肤，并用22号针头将其固定在垫上。然后，固定住另一个角。将手术剪尽可能平贴于皮肤，进行腹部皮下脂肪（SCF）的钝性分离，随后将其转移至预先剪好的铝箔片上。对动物左侧重复上述分离操作。然后，将左右两侧收集的脂肪垫一同放入铝箔中，并使用液氮冷冻样品。为了获取内脏脂肪组织，沿腹白线切开腹肌。接着，从生殖器部位向小鼠背部方向，在两侧腹肌上分别做切口。生殖器官周围的脂肪称为性腺周围脂肪（perigonadal fat，PGF）。将左右两侧的脂肪垫从附睾、睾丸和输精管上分离下来，转移至预先标记好的铝箔中，随后将样品置于液氮中冷冻。从左侧开始，将肠道移向右侧腹腔，以暴露肾脏。此处可见围绕肾脏和肾上腺的脂肪组织为肾周脂肪（perirenal fat，PRF）。在收集PRF之前，先分离并去除肾上腺。这一步可能较为繁琐，因为 PRF 略微比脂肪组织更偏粉红色。接下来，从背部肌肉壁上分离 PRF，并切断输尿管、肾动脉和肾静脉，从而将 PRF 和肾脏与身体其余部分分离。随后，通过切开并去除肾包膜，将 PRF 与肾脏分离。分离出右侧PRF后，将样本连同左侧组织一起转移至铝箔上，并用液氮冷冻样本。根据文本方案，将1.5毫升无RNase的锥形管、研钵、研杵和刮勺预先在液氮中预冷。将脂肪组织样本放入研钵中，然后用几层牛皮纸将研杵从液氮中取出，并将其插入研钵中。 用纸握住研杵的同时，使用锤子敲击研杵顶部一至两次。接着，以旋转动作研磨样品，直至获得细粉。然后，取出研杵，从液氮中取出刮勺，并用其将样品转移至相应预冷的 1.5 毫升锥形管中。不时将刮勺重新浸入液氮中，以防止样品融化。同时，将锥形管置于干冰上，以防止样品解冻。为获得足够的RNA产量，将研磨后的样品填充至锥形管约2/3的容量。 然后，根据文本方案制备其余样品。在化学通风橱内操作，并穿戴实验服、手套和护目镜，从液氮中取出一份研磨后的样品。缓慢打开离心管，加入 500 µL 苯酚溶液。盖上离心管盖，最大速度涡旋约五秒钟，然后缓慢而小心地打开离心管以释放氮气压力。此时可听到气体从管中逸出的声音。用移液器向管中再加入500 µL酚溶液。然后，涡旋混匀并像之前一样缓慢打开。涡旋样品直至完全溶解。随后，在处理其他样品前打开管盖以释放压力。所有样品处理完毕后，在最大转速下短暂涡旋振荡，并在室温下孵育5分钟。在4°C、12,000 ×g 条件下离心10分钟。然后将离心管恢复至室温。为避免污染，针对每个样本，使用带滤芯吸头的P1000移液器，从管壁附近刺穿脂质层，尽可能从中间的粉红色层中分离出RNA。将RNA转移至新的离心管中时，避免触碰管壁，以防将吸头外表面附着的脂质带入。向每个样本中加入200 µL纯氯仿，然后通过倒置混匀管子15秒。随后，将样品在室温下孵育10分钟，然后在4°C条件下以12,000 × g离心15分钟，并将离心管重新放回室温。对于每个样品，使用P1000移液器和滤芯吸头，尽可能多地将含有RNA的透明水相上层转移至对应的第二组锥形管中。接着，向每个样品中加入500 µL的100%异丙醇，并通过倒置混匀15秒。然后，将样品在室温下孵育10分钟。在4°C条件下以12,000 × g离心10分钟，随后将离心管恢复至室温。通过倾倒弃去异丙醇。现在，向每个样品中加入 1 毫升 75% 乙醇，并在最大转速下短暂涡旋振荡试管。然后，在 7,500 ×g 和 4°C 条件下离心 5 分钟。离心结束后，将样品恢复至室温，通过倒置每根试管并轻轻敲击棕色滤纸以去除残留的 75% 乙醇。打开管盖，将RNA沉淀在室温下晾干约15至20分钟。根据RNA沉淀的大小，向每个样品中加入10至25微升无RNase的水。将样品置于60摄氏度的加热块中孵育5分钟。然后，短暂涡旋振荡各管。将样品在同一加热块中再孵育5分钟。随后，迅速离心所有样品，并立即置于冰上。根据文本方案对脂肪组织中的基因表达进行RT-PCR检测。与正常饮食的小鼠相比，高脂饮食小鼠的体重和体重增加均显著升高。这些变化伴随肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF重量较正常饮食小鼠增加两倍以上。该表格显示，对于每种白色脂肪组织，使用苯酚溶液进行RNA提取所获得的样品，其OD260与OD280的比值约为2.0，表明RNA纯度较高。如本柱状图所示，实时PCR结果显示，与正常饮食小鼠相比，肥胖小鼠的PGF、PRF和SCF组织中瘦素（leptin）mRNA的表达水平显著升高。瘦素mRNA表达水平的差异并非由于用于两组小鼠结果归一化的参考基因s16发生变异所致，因为CT值未发生改变。一旦掌握，若操作得当，该技术可在四小时内完成。在进行此实验过程中，需特别注意在RNA提取步骤中始终于无RNase的环境中操作。完成本实验后，可进一步采用其他方法（如实时PCR扩增）来回答更多科学问题，例如基因表达的改变。该技术建立后，为代谢领域研究人员探索与肥胖症和糖尿病相关的啮齿类动物脂肪组织调控机制开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离不同脂肪垫并从中提取RNA。请注意，使用苯酚溶液具有极高危险性，操作过程中务必采取佩戴实验服和手套等防护措施。

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

小鼠脂肪组织的采集和 RNA 分析处理

我们报告了一种从小鼠胰腺中分离高完整性RNA的方案，该组织富含核糖核酸酶。...

从小鼠胰腺中分离RNA：一种富含核糖核酸酶的组织

收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg...

单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

本文介绍了一种可重复的激光显微切割（LCM）实验方案，用于分离小梁网（TM）组织以进行后续RNA分析。对小梁网基因表达变化的分析能力将有助于理解与小梁网相关眼病的潜在分子机制。...

从小鼠眼球中激光捕获显微切割高纯度小梁网用于基因表达分析

已建立一种激光捕获显微切割（LCM）方案，用于从骨细胞中获取足量且高质量的RNA，以进行基因表达分析。本研究主要针对小鼠股骨切片。然而，此处报道的LCM方案也可用于研究任何硬组织细胞中的基因表达。...

一种可从新鲜冷冻小鼠骨组织中获得高质量RNA的激光捕获显微切割方案

开发了一种使用液氮冷冻研磨机处理小鼠足爪的低温粉碎方法，以提高从组织中提取的RNA或蛋白质的得率和质量，并实现对与炎症反应相关的分子谱的分析。...

一种用于胶原诱导性关节炎模型中小鼠足爪组织炎症分子通路分析的冷冻研磨处理方案

本实验方案描述了利用廉价且常见的工具采集离散的冷冻脑区，以获得高质量蛋白质和RNA的方法。...

用于后续分析的冷冻啮齿类动物脑区采集

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。...

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

本方案提供了一种高效的胶原酶消化方法，可在单次操作中从人内脏脂肪中分离出有活力的脂肪细胞和基质血管组分（SVF）细胞，包括从脂肪细胞中提取高质量RNA的方法，以及通过多种膜结合标志物染色，利用流式细胞术对SVF来源的巨噬细胞进行表型鉴定。...

从适合RNA分析和巨噬细胞表型鉴定的人类内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分

本文提供了一种实用的小鼠锁骨上棕色脂肪组织解剖及其组织学与基因表达分析的操作流程。...

小鼠锁骨上棕色脂肪组织的解剖、组织学处理及基因表达分析

本方案描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从经多聚甲醛固定、OCT包埋的小鼠肝组织中分离特定组织学区域RNA的方法，可用于靶向性的下游基因表达分析。...

激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织

学习从小鼠白色脂肪组织采集到高质量RNA提取的完整实验流程，适用于代谢、生物化学和分子生物学研究。该方法可解决脂肪组织RNA含量低导致的提取难题，为基因表达分析提供可靠技术支撑。

小鼠脂肪组织采集与RNA分析前处理

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