Name: 肠上皮细胞通透性的体外及体内测定方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学习使用上皮电阻仪和FITC-葡聚糖灌胃法测定小鼠肠上皮细胞通透性，评估体外和体内肠道屏障功能。该方法有助于研究炎症性肠病及开发胃肠道疾病的治疗策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢哈佛医学院布莱根妇女医院的Jerrold R. Turner博士在完成本研究过程中提供的慷慨帮助。本工作由国家自然科学基金委员会（资助编号&#160;81470804,&#160;31401229 和 81200620）、江苏省自然科学基金（项目编号&#160;BK20180838 和 BK20140319）、江苏省研究生科研创新计划项目（项目编号 KYLX16-0116）、苏州大学高级研究项目（项目编号 SDY2015_06）以及克罗恩病 &amp;#38; 结肠炎基金会研究奖学金（资助编号 310801）。

本研究已获苏州大学剑桥-苏大基因资源中心（CAM-SU）动物护理与使用方案的批准。
1. 在多孔聚碳酸酯膜上接种和培养 Caco-2bbe 细胞
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于T75培养瓶中培养细胞。根据细胞密度定期更换培养基。 
	注意：为了获得最佳的铺板效果，细胞应快速分裂并呈扁平的“煎蛋状”，这表明细胞处于生长阶段。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时，将培养瓶从培养箱中取出，吸去培养基。用1-2 mL无钙、镁的无菌PBS冲洗残留培养基。2+。用移液管加入1.5 mL胰蛋白酶-EDTA至培养瓶中，轻轻摇晃培养瓶；然后将培养瓶放入 37 °C 孵育20分钟，期间不摇动。</li>
	<li>在细胞进行胰蛋白酶消化的同时，将含有孔隙聚碳酸酯膜的插件（孔径大小， 0.4 µm；表面积，0.33 cm²2；参见 材料表) 加入24孔板中。在基底室（膜的下层空间）加入1.0 mL培养基。</li>
	<li>将5 mL培养基加入培养瓶中，用力将细胞反复吹打瓶壁5-10次，以获得松散的单个细胞或2-3个细胞组成的细胞团。</li>
	<li>将0.166 mL细胞（达到1:8稀释比例）接种至顶端室（膜的上层空间）。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育 37 °C 长达3周。
	<ol>
		<li>每周三次通过压力泵小心吸出每个孔基底室中的培养基。轻柔地向每个插入物的顶室滴加1 mL培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用上皮细胞测量仪（伏特/欧姆）测量跨上皮电阻
注意：在聚碳酸酯膜上培养约 3 周后，Caco-2BBe 细胞即可进行跨上皮电阻（TER）测量。
<ol>
	<li>进行细胞因子研究时，检测前一天，将基础培养基更换为含 10 ng/mL IFNγ 的培养基。实验当天，将培养基更换为含 2.5 或 7.5 ng/mL TNF 的 HBSS。 
	注意：IFNγ 处理可增加肿瘤坏死因子受体 2（TNFR2）的表达16.</li>
	<li>为校准仪表，将校正电极插入输入端口，并选择“欧姆”模式。使用螺丝刀调节R Adj螺丝，直至仪表显示读数为1,000 Ω。</li>
	<li>将电极置于70%乙醇中消毒15–30分钟，然后静置晾干15秒。用实验所用的细胞培养基冲洗电极。</li>
	<li>打开电源，选择“欧姆”模式。将电极桥的长端小心插入基底室，短端插入顶室。确保较长的电极接触培养皿底部，而较短的电极位于培养基液面以下但高于组织培养插件表面。保持电极垂直。</li>
	<li>测量样品插件和空白插件的电阻即， 在细胞因子处理后的0、1、2、3、4小时，记录不含细胞但含有HBSS的培养小室的电阻值。</li>
	<li>为确保不同板式之间的结果一致性，计算电阻与有效膜面积的乘积： 
	<img alt="单位面积电阻公式：Ω·cm² = 电阻 (Ω) × 有效膜面积 (cm²)。" src="/files/ftp_upload/57032/57032eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程"> 
	对于 24 孔插件，有效膜面积为 0.33 cm²2.</li>
</ol>
3. 右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导结肠炎的小鼠模型
<ol>
	<li>将DSS加入经高压灭菌的水中，使其终浓度为3.5%（wt/vol）。</li>
	<li>对8周龄雄性C57BL/6小鼠给予3.5% DSS饮水，持续共7天。对照组小鼠给予不含DSS的普通饮用水。
	<ol>
		<li>在第7天后，将含DSS的饮水更换为普通饮用水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每天称量小鼠体重，并评估每只小鼠的临床评分。将每只小鼠的体重归一化为其初始体重。根据疾病严重程度，通过四个参数定义评分标准：直肠脱垂（0–2分）、粪便性状（0–2分）、出血情况（0–2分）和活动能力（0–2分）5。将上述各项得分相加，得到最终临床评分。</li>
	<li>为分析结肠组织的组织病理学状况，在DSS处理后第7天，通过腹腔（i.p.）注射1.2%（vol/vol）Avertin（剂量为0.6 mL/10 g体重）处死小鼠。制备100% Avertin储备液的方法：将10 g 2,2,2-三溴乙醇与10 mL叔戊醇混合，避光保存于4°C。使用时将100%储备液用水稀释至2%。</li>
	<li>分离结肠和盲肠，并测量结肠长度5。</li>
	<li>从远端结肠切取0.5 cm长的组织片段，置于含有10 mL 10%福尔马林的15 mL离心管中，固定过夜。用梯度乙醇（75%、95%和100%）及二甲苯洗涤固定后的组织。将组织包埋于石蜡中，切取6 mm厚切片用于苏木精-伊红染色8。</li>
</ol>
4. 测定DSS诱导结肠炎小鼠的上皮屏障通透性
<ol>
	<li>在开始给予DSS后的第7天测定屏障通透性。</li>
	<li>检测当天，禁食小鼠3小时。</li>
	<li>将灌胃针进行高压灭菌以确保无菌，随后向小鼠灌胃150 µL含80 mg/mL 4 kDa FITC-葡聚糖的无菌水溶液，并保留未使用的FITC-葡聚糖用于血清采集后的标准曲线测定。称量小鼠体重以用于通透性计算。 
	注意：FITC-葡聚糖溶液应使用水配制。</li>
	<li>使用剪刀剪取约1 cm长的尾部组织，将100 µL血液从尾部收集至血清采集管中。在室温下以10,000 × g离心10分钟处理采集的血液。</li>
	<li>用纯水将血清按1:4比例稀释。为制作标准曲线，将未使用的FITC-葡聚糖用纯水依次稀释为1:300、1:1,000、1:3,000、1:10,000、1:30,000、1:100,000、1:300,000、1:1,000,000和1:3,000,000。将100 µL/孔的血清样本和标准曲线样本加入96孔板中。</li>
	<li>使用酶标仪在485 nm激发波长和528 nm发射波长下读取荧光值。根据标准曲线计算通透性数值，并乘以4以校正稀释倍数。</li>
	<li>将FITC-葡聚糖的浓度除以小鼠体重进行归一化处理（此步骤有助于校正因小鼠疾病或体重下降导致的FITC-葡聚糖递送差异）。</li>
</ol>

<ol><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target?</a> Nature reviews. Gastroenterology & hepatology. 14, 9-21 (2017).</li>
<li>Clarke, H., Soler, A. P., Mullin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+activation+leads+to+dephosphorylation+of+occludin+and+tight+junction+permeability+increase+in+LLC-PK1+epithelial+cell+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C activation leads to dephosphorylation of occludin and tight junction permeability increase in LLC-PK1 epithelial cell sheets.</a> J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3187-3196 (2000).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differentiation-dependent+splice+variant+of+myosin+light+chain+kinase%2C+MLCK1%2C+regulates+epithelial+tight+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A differentiation-dependent splice variant of myosin light chain kinase, MLCK1, regulates epithelial tight junction permeability.</a> J.Biol. Chem. 279, 55506-55513 (2004).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNFR2+activates+MLCK-dependent+tight+junction+dysregulation+to+cause+apoptosis-mediated+barrier+loss+and+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis.</a> Gastroenterology. 145, 407-415 (2013).</li>
<li>Su, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+epithelial+tight+junction+dysfunction+causes+immune+activation+and+contributes+to+development+of+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Targeted epithelial tight junction dysfunction causes immune activation and contributes to development of experimental colitis.</a> Gastroenterology. 136, 551-563 (2009).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+isoform+expression+and+subcellular+distribution+of+MYPT1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Characterization of isoform expression and subcellular distribution of MYPT1 in intestinal epithelial cells.</a> Gene. 588, 1-6 (2016).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+contractile+phenotypes+of+intestinal+smooth+muscle+in+mice+deficient+in+myosin+phosphatase+target+subunit+1%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Altered contractile phenotypes of intestinal smooth muscle in mice deficient in myosin phosphatase target subunit 1.</a> Gastroenterology. 144, e1451-e1455 (2013).</li>
<li>He, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+light+chain+kinase+is+central+to+smooth+muscle+contraction+and+required+for+gastrointestinal+motility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Myosin light chain kinase is central to smooth muscle contraction and required for gastrointestinal motility in mice.</a> Gastroenterology. 135, 610-620 (2008).</li>
<li>Li, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+regulatory+light+chain+phosphorylation+is+associated+with+leiomyosarcoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Myosin regulatory light chain phosphorylation is associated with leiomyosarcoma development.</a> Biomed. Pharmacother. 92, 810-818 (2017).</li>
<li>Clayburgh, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+myosin+light+chain+kinase-dependent+barrier+dysfunction+mediates+T+cell+activation-induced+diarrhea+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Epithelial myosin light chain kinase-dependent barrier dysfunction mediates T cell activation-induced diarrhea in vivo.</a> J. Clin. Invest. 115, 2702-2715 (2005).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> Am. J. Pathol. 166, 409-419 (2005).</li>
<li>Ye, D., Ma, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+that+mediate+basal+and+tumour+necrosis+factor-alpha-induced+regulation+of+myosin+light+chain+kinase+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms that mediate basal and tumour necrosis factor-alpha-induced regulation of myosin light chain kinase gene activity.</a> J. Cell Mol. Med. 12, 1331-1346 (2008).</li>
<li>Turner, J. R., Buschmann, M. M., Romero-Calvo, I., Sailer, A., Shen, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25263012">The role of molecular remodeling in differential regulation of tight junction 300 permeability.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 36, 204-212 (2014).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J. Lab. Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN-gamma-induced+TNFR2+expression+is+required+for+TNF-dependent+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IFN-gamma-induced TNFR2 expression is required for TNF-dependent intestinal epithelial barrier dysfunction.</a> Gastroenterology. 131, 1153-1163 (2006).</li>
<li>Peterson, M. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enterocyte-like+brush+border+cytoskeleton+of+the+C2BBe+clones+of+the+human+intestinal+cell+line+Caco-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enterocyte-like brush border cytoskeleton of the C2BBe clones of the human intestinal cell line Caco-2.</a> J. Cell Sci. 102 (Pt 3), 581-600 (1992).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+intestinal+permeability+and+bacterial+translocation+during+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.</a> J. Immunol. Methods. 421, 44-53 (2015).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

该实验方案中有多个关键步骤。始终使用Caco-2BBe（表达刷状缘的）细胞进行TER测定，该细胞系是从Caco-2细胞系中筛选出的、能够表达刷状缘蛋白的亚系。当Caco-2BBe细胞完全分化后（汇合后培养约3周），会呈现出绒毛状吸收性表型17。在测定过程中必须避免污染，并对电极进行灭菌处理。由于该操作为非无菌操作，大多数情况下测定时间不得超过8小时。在测量过程中，我们确定了插入物内外两个点之间的电阻值。由于细胞状态的差异，不同位点的电阻测量值有时可能存在显著差异；这是该方法的主要局限性之一。然而，这种变异可通过统计学方法及其他方法显著降低。TER方法也可应用于其他细胞类型，例如用于评估肺上皮细胞和血管内皮细胞的屏障完整性。此外，TER测定还可用于药物毒性研究。
给予可通过扩散进入肠上皮的不可消化大分子，可用于评估肠道通透性。该方法的优点在于可在体检测肠道的屏障功能。可使用的标记物有多种类型，包括放射性同位素、聚乙二醇和糖类18。然而，为精确测量通透性，需考虑若干因素：（...

肠上皮细胞不仅负责营养物质的吸收，还构成重要的屏障，以抵御病原微生物和微生物毒素的侵袭。这种肠道屏障功能由紧密连接通透性和上皮细胞完整性所调控1,2,3，上皮屏障功能的失调与炎症性肠病（IBD）相关。毗邻连接的肌动球蛋白环（PAMR）位于细胞内，紧邻紧密连接。PAMR的收缩由肌球蛋白轻链（MLC）调控，对调节紧密连接通透性至关重要4,5,6,7,8,9,10。肿瘤坏死因子（TNF）通过上调肠上皮MLC激酶（MLCK）的表达并诱导闭合蛋白（occludin）内化，在肠道屏障功能丧失中起核心作用11,12,13。
Na+ 和 Cl- 等离子可通过细胞旁路中的孔道或渗漏途径跨过上皮层14。在一种&#34;高通透性&#34;上皮中，跨上皮电阻（TER）的变化主要反映了紧密连接通透性的改变。TER 测量是一种常用的电生理学方法，通过测定细胞单层的阻抗来定量评估紧密连接对 Na+ 和 Cl- 的通透性。已有多种细胞类型被用于 TER 测量，包括肠上皮细胞、肺上皮细胞和血管内皮细胞。该方法的优点在于其非侵入性，可用于实时监测活细胞。此外，TER 测量技术在药物毒性研究中也具有重要应用价值15。
Caco-2BBe 细胞是一种人源结肠腺癌上皮细胞，其结构和功能类似于分化的 小肠上皮细胞：例如，这些细胞具有微绒毛以及与小肠刷状缘相关的酶。因此，培养的 Caco-2BBe 单层细胞被用作一种 体外 用于检测屏障功能的模型
在小鼠中，研究肠道旁细胞通透性的一种方法是通过检测荧光素异硫氰酸盐-葡聚糖（FITC-dextran）从肠腔进入血液的能力。因此，可通过将FITC-dextran直接灌胃给予小鼠，并测定血液中的荧光强度来评估肠道通透性。以下方案描述了两种简单的方法，分别用于体外（in vitro）和体内（in vivo）评估肠上皮通透性。

<table><tbody><tr><td>22 G 灌胃针</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC-葡聚糖</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>Avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>黑色荧光检测用 96 孔板</td><td>Fisher</td><td>14-245-197A</td><td></td></tr><tr><td>C57/B6 小鼠</td><td>南京大学南京生物医药研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caco-2BBe 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2102</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖硫酸钠</td><td>MP Biomedicals</td><td>2160110</td><td></td></tr><tr><td>含高糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>上皮电阻（伏特/欧姆）测量仪</td><td>Millicell-ERS</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管（15 mL）</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>荧光计</td><td>Biotek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td></td><td></td><td>138 mM NaCl, 0.3 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5.0 mM KCl, 0.3 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 15.0 mM HEPES, 1.3 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 25 mM 葡萄糖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IFNg</td><td>PeproTech</td><td>315-05-20</td><td></td></tr><tr><td>模块化组织包埋中心</td><td>Leica</td><td>EG1150H</td><td></td></tr><tr><td>血清采集管</td><td>Sarstedt</td><td>41.1378.005</td><td></td></tr><tr><td>T75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>TNF</td><td>PeproTech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma</td><td>A6330-1CS</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜（Transwell）</td><td>Costar</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>压力泵</td><td>AUTOSCIENCE</td><td>AP-9925</td><td></td></tr><tr><td>旋转切片机</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 与 体内 评估肠上皮细胞通透性的方法

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

肠道屏障可防御致病微生物和微生物毒素。其功能受紧密连接通透性和上皮细胞完整性的调控，肠道屏障功能的破坏可促进胃肠道及全身性疾病的发展。本文介绍了两种测量肠上皮通透性的简单方法。体外实验中，将Caco-2BBe细胞以单层形式接种于组织培养板孔中，使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）测量跨上皮电阻（TER）。该方法因操作简便且可重复性好而具有较高可靠性。体内实验中，通过口服灌胃给予小鼠4 kDa荧光素异硫氰酸酯（FITC）-葡聚糖，随后检测采集的小鼠血清样本中FITC-葡聚糖的浓度，以评估上皮通透性。口服灌胃可提供精确的给药剂量，因此是体内测量肠道通透性的首选方法。综上所述，这两种方法可分别用于体外和体内测量肠上皮通透性，进而用于研究疾病与屏障功能之间的关联。

在培养条件下，Caco-2BBe 细胞以单层形式生长，并逐渐分化为具有刷状缘的成熟吸收性肠上皮细胞。在本方案中，将 Caco-2BBe 细胞以高密度接种于聚碳酸酯膜上，接种后一天细胞即达到 100% 汇合度。然而，此时细胞仍处于未分化状态：为实现细胞的完全分化，需每 2–3 天更换一次培养基，持续 3 周。通过细胞核和 F-肌动蛋白染色，可显示未分化细胞与分化细胞之间的差异。在未分化细胞中可清晰观察到张力纤维。与未分化细胞相比，分化后的细胞体积更小，细胞核更大，且张力纤维更少（图 1）。
TNF 通过依赖 MLCK 的紧密连接调节在肠道屏障功能丧失中起核心作用。检测了不同时间点未处理或经 TNF 处理细胞的 TER。如图 2所示，TNF 以剂量依赖性方式显著降低 Caco-2BBe 单层细胞的 TER，表明 TNF 增加了上皮通透性。...

本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.

肠道屏障可防御病原微生物及微生物毒素。其功能受紧密连接通透性的调控，并且……

本实验的总体目标是通过体外和体内测量肠道上皮细胞的通透性，研究由上皮屏障功能障碍引起的疾病。该方法有助于解答肠道屏障功能领域的关键问题，例如与炎症性肠病相关的问题。该技术的主要优势在于，可同时在体外和体内评估肠道上皮细胞的通透性。该技术的应用意义延伸至胃肠道疾病的治疗或诊断，因为肠上皮屏障功能障碍与这些疾病相关。尽管该方法可深入揭示肠道屏障功能，也可应用于其他系统，例如药物毒性研究及其他细胞类型的屏障完整性评估。对该方法进行可视化演示至关重要，因为某些步骤较难掌握。现在可以通过文字描述来理解该方法的准确操作步骤。首先，在T75培养瓶中用培养基培养Caco-2bbe细胞。根据细胞密度定期更换培养基。当细胞融合度达到80%时，移除培养基，并用1-2毫升不含钙的无菌PBS洗涤细胞。加入1.5毫升胰蛋白酶-EDTA溶液，轻轻摇动培养瓶。随后，将其放入37°C培养箱中孵育20分钟，期间不进行摇动。在细胞进行胰蛋白酶消化的同时，将含有多孔聚碳酸酯膜的插入式培养小室放入24孔板中。然后向基础室（即膜的下方空间）加入1毫升培养基。向培养瓶中加入5毫升培养基，并用力吹打细胞5至10次，使其紧贴瓶壁内侧，从而将细胞团分散为松散的单个细胞或由两到三个细胞组成的细胞团。将0.166毫升的细胞接种至膜的上腔（即顶侧室）。随后在37°C条件下培养板子，最长培养三周。每周三次通过压力泵小心地从每个孔的基底室吸取培养基，以对细胞进行换液喂养。然后向每个小室的顶腔中缓慢滴加一毫升培养基。进行细胞因子研究时，在跨上皮电阻（TER）测量前一天，将基础培养基更换为含有每毫升10纳克干扰素γ的培养基。实验当天，将培养基更换为含有每毫升2.5或7.5纳克肿瘤坏死因子（TNF）的HBSS。校正仪表时，将校正电极插入输入端口并选择欧姆模式。然后使用螺丝刀调节R调节螺丝，直至仪表显示读数为1,000欧姆。将电极在70%乙醇中消毒15至30分钟，随后静置晾干15秒。然后用实验用细胞培养基冲洗电极。接着打开电源，选择欧姆模式。保持电极垂直，小心地将电极桥的长端放入基底室中，确保其接触培养皿。然后将短端放入顶室中，确保其位于培养基液面以下，但高于组织培养小室。在细胞因子处理后的0、1、2、3和4小时，分别测量样品组和空白对照组小室的电阻值，随后记录电阻。为确保不同板型之间的一致性，需计算电阻与有效膜面积的乘积，如上所示。对于24孔插入式培养板，其有效膜面积为0.33平方厘米。为诱导结肠炎，将DSS加入经高压灭菌的水中，使其终浓度为3.5%（质量/体积）。然后使用DSS溶液替换8周龄雄性C57黑六小鼠笼内饮用水，持续七天。对照组小鼠给予不含DSS的正常饮用水。第七天后，将DSS水更换为正常饮用水。每天称量小鼠体重，并根据疾病严重程度的四个参数评估临床评分：直肠脱垂、粪便性状、出血和活动情况。将这四个参数的评分相加，得到最终的临床评分。为分析DSS处理后7天的结肠组织病理学状况，按照文本方案实施小鼠安乐死后，分离结肠和盲肠，并测量结肠长度。从远端结肠切取0.5厘米长的组织片段，置于含有10毫升10%福尔马林的15毫升离心管中，固定过夜。用梯度乙醇和二甲苯洗涤固定后的组织，随后将组织包埋于石蜡中，并切取6毫米厚的切片用于苏木精-伊红染色。为了测量DSS诱导小鼠的上皮屏障通透性，在开始给予DSS后的第七天，将小鼠禁食三小时。高压灭菌灌胃针以确保无菌，然后使用150微升浓度为每毫升80毫克的4千道尔顿FITC-葡聚糖无菌水溶液对小鼠进行灌胃，并保留未使用的FITC-葡聚糖，以便在血清收集后用于测定标准曲线。接下来，称量小鼠体重以计算通透性。4小时后，通过腹腔注射麻醉小鼠，通过检查反射消失和胡须无运动来确认麻醉效果。然后将小鼠置于加热板上5分钟。使用剪刀剪下约1厘米长的尾部组织，并从尾部采集100 µL血液至血清收集管中。在室温下以10,000 × g离心收集的血液10分钟。用纯水将血清按1:4比例稀释。然后，为绘制标准曲线，使用纯水配制未使用的FITC葡聚糖稀释液。向96孔板的每个孔中加入100微升血清和标准曲线样品。使用酶标仪，在激发波长485和发射波长528的条件下读取荧光值。根据标准曲线计算通透性数值，并乘以4以校正稀释倍数。将FITC葡聚糖的浓度除以体重以标准化数值。这有助于在小鼠生病并出现体重减轻时，校正FITC葡聚糖递送量的差异。此处所示的Caco-2bbe细胞经细胞核和F-肌动蛋白染色标记，以显示未分化细胞与分化细胞之间的差异。未分化的细胞中可明显观察到应力纤维。与未分化的细胞相比，分化的细胞体积更小，细胞核更大，且应力纤维较少。TNF 通过依赖 MLCK 的紧密连接调节，在肠道屏障功能丧失中起核心作用。如图所示，TNF 以剂量依赖性方式显著降低 Caco-2bbe 单层细胞的跨上皮电阻（TER），表明 TNF 可增加上皮通透性。与初始体重相比，经 DSS 处理的小鼠体重显著下降。结肠炎严重程度通过直肠脱垂、粪便性状、出血情况和活动状态进行评分。经苏木精和伊红染色的结肠组织横切面显示，DSS处理小鼠出现结肠黏膜损伤。此外，DSS处理小鼠的结肠隐窝长度以及结肠本身的长度均缩短。最后，与对照小鼠相比，DSS处理小鼠中FITC葡聚糖染色水平约升高了两倍。在进行该实验操作时，重要的是要牢记通过标准化操作流程并运用统计学方法来尽量减少误差。该技术建立后，为研究肠道屏障功能的科研人员探索模式生物和细胞系中的胃肠道疾病奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过测量跨上皮电阻（TER）、灌胃给予FITC葡聚糖以及观察形态学和组织化学变化来评估肠道上皮通透性。

in-vitro-vivo-approaches-to-determine-intestinal-epithelial-cell

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肠上皮细胞通透性的体外及体内测定方法

本方案描述了使用离体肠组织制备物或“肠囊”作为肠道屏障功能的离体模型。ex vivo...

体外 肠道囊泡法评估胃肠道疾病模型中的黏膜通透性

目前对炎症性肠病（IBD）的治疗旨在缓解疾病症状，但可能引起严重副作用。因此，研究人员正在利用动物结肠炎模型探索替代性治疗策略。本文将介绍如何在结肠炎模型中分析膳食补充剂对临床IBD症状的有益作用。...

分析营养补充剂在实验性结肠炎期间对肠道上皮屏障功能的有益作用

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

人肠道类器官上皮屏障通透性的实时测量

营养物质、肠道微生物代谢物和药物进入循环系统的过程受到肠-血屏障（GBB）的调控。本文介绍一种直接测定GBB通透性的方法。...

一个 在体 内 评估肠道-血液屏障及肠道微生物产物肝脏代谢的方法

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。...

基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

肠道上皮屏障功能和免疫反应失调是炎症性肠病的特征，但由于缺乏生理相关模型，这些特征迄今研究尚不充分。本文介绍一种小鼠肠道环模型，该模型利用血供良好且外置于体外的肠段，在活体条件下研究黏膜通透性和白细胞募集。...

利用标准化肠段模型对小鼠肠道通透性及中性粒细胞跨上皮迁移进行功能评估

本方案详细描述了从胎儿肠道组织建立类肠体（enteroid）这一三维肠道模型的过程。采用上皮生物标志物的免疫荧光成像对模型进行了表征。通过显微注射技术将细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide）施加于上皮顶端，可诱导上皮通透性增加，其程度呈剂量依赖性，并通过荧光标记葡聚糖的渗漏情况进行测定。...

检测胎儿组织来源类肠体的上皮通透性

本实验方案介绍了一种利用顶端朝外的肠类器官模型中荧光黄染料测定肠道通透性的方法。该方法可用于评估模拟坏死性小肠结肠炎等炎症性肠病的肠类器官的细胞旁通透性。...

利用荧光素黄在顶膜外翻肠类器官模型中测定肠道通透性

本文描述了用于在整体动物和细胞水平上可视化MG53介导的细胞膜修复动态过程的实验方案。这些方法可用于研究质膜再封闭的细胞生物学及再生医学。...

利用MG53介导的细胞膜修复可视化 体内 和 体外 系统

学习使用上皮电阻仪和FITC-葡聚糖灌胃法测定小鼠肠上皮细胞通透性，评估体外和体内肠道屏障功能。该方法有助于研究炎症性肠病及开发胃肠道疾病的治疗策略。

体外与体内评估肠上皮细胞通透性的方法

探索更多视频

体外 与 体内 评估肠上皮细胞通透性的方法

探索更多视频

体外与体内评估肠上皮细胞通透性的方法