小鼠髓系前体32D/G-CSF-R细胞的增殖与分化

本实验的总体目标是通过过表达或沉默目的基因，对小鼠髓系32D-G-CSF-R细胞进行遗传修饰，并确定这些改变对该细胞系增殖和中性粒细胞分化的影响。该方法有助于回答血液学领域中的关键问题，例如目的蛋白如何参与髓系前体细胞的生长与分化。该细胞系的主要优势在于其具有无限增殖能力，易于进行遗传操作，成本相对较低，并且能够在某些实验方法中实现所需的生物学简化。今天演示该实验步骤的是我实验室的博士研究生Petr Danek。

配制250毫升RPMI-1640培养基，添加10%经热灭活的胎牛血清和10纳克/毫升的小鼠白细胞介素-3。然后配制50毫升分化培养基。

在直径16厘米的培养皿中，将Bosc23细胞的单细胞悬液接种于18毫升添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中。培养约24小时，直至细胞融合度达到80%。随后，将MSCV逆转录病毒载体、PCL-eco包装载体、聚乙烯亚胺（poly-ethylenimine）和不含抗生素的低血清培养基混合。将该混合物在室温下的超净工作台中孵育20分钟。接着，小心弃去Bosc23细胞的原有培养基，更换为16毫升预热至37摄氏度、添加了2%胎牛血清的DMEM培养基。随后，将逆转录病毒混合液逐滴加入Bosc23细胞中。最后，将细胞在37摄氏度条件下孵育4小时。

孵育结束后，吸除 Bosc23 细胞培养基，加入 18 毫升预热的含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基。将细胞在 37°C 条件下继续孵育 48 小时。使用 25 毫升血清移液管将含有 Bosc23 病毒的培养基转移至 50 毫升锥形管中。将锥形管置于 4°C 保存。随后向 Bosc23 细胞中加入 18 毫升预热的含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，并继续培养细胞 24 小时。

在4 °C条件下，以1,500 × g离心病毒上清液10分钟。随后将病毒分装，并用液氮速冻，于-80 °C保存。

在六孔板的每个孔中，加入三毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，接种NIH/3T3细胞，用于滴定一种病毒。在37°C条件下培养过夜。次日，用预热但未涡旋振荡病毒颗粒的培养基稀释病毒。吸除NIH/3T3细胞中的培养液，每孔加入一毫升稀释后的病毒液。在37°C下继续孵育过夜。第二天，小心吸除稀释的病毒液，每孔更换为两毫升含10%胎牛血清的DMEM培养基，再次于37°C培养过夜。孵育结束后，吸除旧培养基，更换为含两微克每毫升嘌呤霉素的DMEM培养基。此后每隔三天继续培养细胞，或在培养基变黄时即更换为含嘌呤霉素的新鲜培养基。

感染后第10至12天，吸去孔中的培养基，并用磷酸盐缓冲液轻轻洗涤。然后在室温下加入1毫升结晶紫溶液染色2分钟。染色后，用磷酸盐缓冲液小心洗涤两次。在显微镜下计数每个孔中出现的蓝色菌落数量。

将32D-G-CSF-R细胞接种至六孔板中。加入病毒，感染复数介于10至40之间。然后向细胞中加入polybrene，使其终浓度为8微克/毫升，并在37°C下孵育6小时。孵育结束后，将细胞收集至15毫升离心管中，在4°C下以450 × g离心5分钟。32D细胞若生长浓度超过每毫升100万个细胞，可能部分丧失其分化能力，因此及时传代细胞并避免过度生长极为重要。

弃去上清液，将细胞重悬于含有6毫升RPMI-1640培养基的T25培养瓶中，该培养基添加了10%经热灭活的胎牛血清和10纳克/毫升的小鼠白细胞介素-3。于37°C孵育细胞48小时。

用不含细胞因子的 RPMI-1640 培养基将 32D-G-CSF-R 细胞洗涤两次。然后在第 0 天将细胞接种于 24 孔板中，每孔加入 1 毫升分化培养基，于 37 摄氏度培养过夜。细胞需要 7 至 9 天分化为成熟的粒细胞。随后使用台盼蓝染色计数细胞数量，以排除死细胞。

由于IL-3可能抑制分化过程，因此在将细胞培养于GCSF之前，彻底清除细胞中残留的该细胞因子至关重要。

将细胞置于带有必要适配器的离心机中，在玻璃载玻片上以20 × g离心5分钟。随后在室温下用甲醇固定细胞5分钟，并让细胞自然干燥。按照制造商的说明书，使用May-Grunwald Giemsa染色法对细胞进行染色。染色完成后，使用40倍物镜观察摄取染料的细胞。

根据细胞形态，对染色后的细胞中原始细胞、中间分化细胞以及成熟粒细胞的数量进行定量分析。

此处显示的是 32D-G-CSF-R 细胞在含白细胞介素-3 和粒细胞集落刺激因子的培养基中增殖情况的图示。横轴表示处理天数，纵轴表示以对数尺度表示的细胞数量。黑色曲线显示细胞在含白细胞介素-3 的培养基中培养时的增殖情况。蓝色曲线显示细胞在含粒细胞集落刺激因子的培养基中培养时增殖能力下降。

图中显示了具有代表性的饼状图和瑞氏-吉姆萨染色结果，展示了在含粒细胞集落刺激因子的培养基中 32D-G-CSF-R 细胞的比例及分化形态。饼状图显示了经粒细胞集落刺激因子处理后第 0、2、4 和 6 天时原始细胞、中间分化阶段细胞和中性粒细胞所占的比例。第 0 天的吉姆萨染色细胞具有较大的特征性细胞核和深色的细胞质；至第 6 天，细胞核体积缩小，细胞质扩大但着色变浅。

图中所示为典型的饼状图，显示在含有粒细胞集落刺激因子的培养基中，用BCR-ABL融合蛋白转导后，原始细胞比例高于用对照MSCV载体转导的情况。下图中的吉姆萨染色代表性地展示了用对照载体或BCR-ABL融合蛋白转导后的细胞形态。

在第6天，经MSCV对照载体转导的细胞发生了中性粒细胞分化，而BCR-ABL转导的细胞则主要表现为原始细胞，未见成熟中性粒细胞。

掌握该技术后，若操作得当，可在两天内完成。在进行该实验时，务必记住将32D-G-CSF受体细胞培养在指定浓度条件下。完成该步骤后，还可开展迁移实验和存活实验等其他方法，以回答更多科学问题。观看本视频后，您应能够充分掌握32D-G-CSF受体细胞系的操作，包括利用慢病毒和逆转录病毒转导进行基因操作、细胞扩增、分化，以及对这些细胞增殖和分化状态的评估。请务必注意，操作病毒具有潜在危险性，实验过程中应始终采取预防措施，例如佩戴手套和护目镜。