Name: Trichostatin a 和维生素 C 的组合治疗提高体细胞细胞核移植克隆小鼠的效率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解利用曲古抑菌素A和维生素C组合处理提高体细胞核移植克隆小鼠效率的优化方法。该技术通过改进胚胎培养条件，为发育生物学研究及濒危物种保护提供了实用且可重复的实验方案。

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本工作得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（JP15H06753、JP16H01321、JP16H01222、JP17H05045）以及住友财团基础科学研究项目资助（150810）的支持，以上经费均授予 K.M.。近畿大学研究基金（15-I-2，授予 K.M. 和 M.A.）。M.O. 感谢英国癌症研究基金会（Cancer Research UK，编号 C6946/A24843）和惠康信托基金（Wellcome Trust，编号 203144/Z/16/Z）提供的核心支持。&#160; 我们感谢 N. Backes-Kamimura 女士和 J. Horvat 先生对本文的校对。

所有动物实验均遵循近畿大学关于实验动物护理和使用的指导方针。
1. 培养基的制备
<ol>
	<li>准备用于胚胎培养的改良KSOM（mKSOM）培养基，其成分为：95 mM NaCl、2.5 mM KCl、0.35 mM KH2PO4、0.2 mM MgSO4 · 7H2O、1.71 mM CaCl2 · 2H2O、0.2 mM D(+)-葡萄糖、0.2 mM 丙酮酸钠、1.0 mM L-谷氨酰胺、1.0 g/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、25.07 mM NaHCO3、10 mM DL-乳酸钠、0.05 g/L 青霉素和0.05 g/L 链霉素，溶于无菌水中。</li>
	<li>准备用于胚胎操作的HEPES缓冲CZB（HCZB）培养基，其成分为：81.5 mM NaCl、4.8 mM KCl、1.7 mM CaCl2 · 2H2O、1.18 mM MgSO4 · 7H2O、1.18 mM KH2PO4、0.11 mM EDTA · 2Na、36.1 mM DL-乳酸钠、5.55 mM D(+)-葡萄糖、0.025 g/mL 青霉素、0.035 g/L 链霉素、0.014 mM 酚红、1.0 g/L 聚乙烯醇、5.0 mM NaHCO3 和20.0 mM HEPES钠盐，溶于无菌水中。</li>
	<li>准备卵母细胞激活用激活培养基：在mKSOM培养基中添加50 nM TSA、2 mM EGTA、5 µg/mL 细胞松弛素B（CB）和5 mM SrCl2。</li>
</ol>
2. 去离子牛血清白蛋白（dBSA）的制备
<ol>
	<li>在室温下将 1.2 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 10 mL 无菌水中（终浓度为 12%）。</li>
	<li>在室温下，向上述制备的 12% BSA 无菌水溶液中加入约 0.12 g 混合离子交换树脂珠，并轻轻搅拌。</li>
	<li>当树脂珠颜色由蓝绿色变为金黄色时，用移液器收集上清液，然后更换为新的树脂珠（图 1）。 
	注意：通常仅需更换一次树脂珠，但可能需要多次更换才能完成去离子过程。作为参考，若树脂珠颜色不再由蓝绿色变为金黄色，表明离子交换已完成。</li>
	<li>确认树脂珠无颜色变化后，回收溶液。 
	注意：若回收的溶液变浑浊，需进行离心处理以防止滤膜堵塞（175 × g，5 分钟）。</li>
	<li>向回收的溶液中添加 250 µL 10.5% NaHCO3。 
	注意：此步骤旨在使 dBSA 溶液的 pH 条件达到中性，但 NaHCO3 可根据需要省略。</li>
	<li>使用 0.45-µm 滤膜对上清液进行除菌过滤，并于 -20 °C 保存作为 dBSA 储存液。</li>
</ol>
3. 卵母细胞采集
注意：所有小鼠均饲养于光照可控且配备空调的房间内。
<ol>
	<li>对每只8至10周龄的B6D2F1雌性小鼠进行超数排卵处理：腹腔注射7.5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48小时后注射7.5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）。</li>
	<li>在hCG注射后14至16小时，通过颈椎脱位实施安乐死。采用标准解剖技术切开腹部以暴露生殖道13。简要步骤如下：捏起皮肤，用剪刀在腹中线做一小的横向切口。牢固抓住切口上下方的皮肤并向头尾方向拉开。用剪刀剪开腹膜，将肠管移开，确认子宫角、输卵管和卵巢的存在。</li>
	<li>使用小型直剪和镊子摘除输卵管，将其置于滤纸上以擦去表面血液，随后放入矿物油中。然后用解剖针切开输卵管的壶腹部，将来自壶腹部的卵丘-卵母细胞复合体转移至含有0.1%透明质酸酶的200 µL HCZB培养基液滴中，在加热板上孵育5分钟。 
	警告：在含0.1%透明质酸酶的HCZB培养基中暴露超过10分钟会对卵母细胞造成不利影响。</li>
	<li>在体视显微镜下确认卵丘细胞已从卵丘-卵母细胞复合体中释放后，将仍带有部分残留卵丘细胞的第二次减数分裂中期（MII期）卵母细胞转移至含0.3% dBSA的mKSOM培养基中。随后，使用内径&#60;100 µm的移液器反复吹打，将MII期卵母细胞在含0.3% dBSA的mKSOM培养基中清洗四次，以去除残留的卵丘细胞。 
	注意：使用小口径移液器有助于卵丘细胞的去除。</li>
	<li>将MII期卵母细胞置于含0.3% dBSA的mKSOM培养基中，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育，直至去核操作。 
	注意：建议使用直径略大于卵母细胞的小型移液器。</li>
</ol>
4. 核移植供体细胞的制备
<ol>
	<li>完成步骤 3.3 - 3.5 后，从卵丘-卵母细胞复合体中分离出裸卵母细胞。在体视显微镜下，用移液器将卵丘-卵母细胞复合体中分散出的少量（约 2 µL）卵丘细胞从含 0.1% 透明质酸酶的 HCZB 培养基转移至含 6% dBSA 的 HCZB 培养基中。</li>
	<li>将卵丘细胞置于含 6% dBSA 的 HCZB 培养基中，并放置于 37 °C 的预热板上，待后续用于体细胞核移植（SCNT）时使用。 
	注意：当使用成纤维细胞（例如，小鼠胎儿成纤维细胞）作为供体细胞时，需将细胞从组织培养皿上脱离，并离心形成细胞沉淀。随后将细胞沉淀重悬于含 6% dBSA 的 HCZB 培养基中。</li>
</ol>
5. 卵母细胞去核
<ol>
	<li>通过将0.9 g PVP加入10 mL HCZB培养基中配制9% PVP培养基，4 °C冰箱中保存过夜，然后使用0.45 µm滤器过滤除菌。</li>
	<li>配制CB储备液（浓度为1 mg/mL）：将5 mg CB加入5 mL二甲基亚砜（DMSO）中。用HCZB培养基稀释CB储备液（终浓度为5 µg/mL），作为去核溶液使用。</li>
	<li>用含有5 µg/mL CB（去核溶液）的20 µL HCZB培养基，通过无菌移液管（内径：150 µm至200 µm）反复吸入和推出，清洗Mll期卵母细胞。重复洗涤五次。开始去核操作前，将卵母细胞置于去核溶液中，在加热板上静置约10分钟。</li>
	<li>按照图示准备去核室 图 2A将Mll卵母细胞通过移液管（内径：150 µm至200 µm）吸入和吹出的方式转移至去核 chamber 中；加入4 µL去核液，并用矿物油覆盖 chamber。 
	注意：可以使用60 mm培养皿的盖子代替小室。</li>
	<li>在室温下，于显微镜（400倍）下观察并识别MII期卵母细胞中的纺锤体和染色体。将具有明显第一极体的MII期卵母细胞进行定向，使纺锤体与染色体的位置位于3点或9点方向。图2B使用持卵管和显微注射针进行固定和操作。 
	注意：所使用的显微镜总放大倍数为400倍。物镜数值孔径（N.A）分别为5倍/0.12和40倍/0.55。移液管的压电脉冲驱动可实现对透明带的快速穿孔。此外，配备激光系统（例如，XYClone）也可用于替代压电驱动系统对透明带进行钻孔。</li>
	<li>将压电脉冲强度设置为 3 - 6，使用压电脉冲驱动的显微操作针（内径 7 - 8 µm 平头尖端）钻至透明带。在透明带上打开孔洞后，将纺锤体和染色体连同极少量细胞质完全去核图2C). 
	注意：在此过程中，由于培养基中不含 BSA，卵母细胞 tends to 紧密附着于培养皿底部或移液器上1410分钟内必须完成去核操作，并将去核卵母细胞放回培养箱。一次去核操作可处理的卵母细胞数量宜在10至20个之间。若卵母细胞数量较多，需重复进行去核步骤。</li>
	<li>在可见光下确认细胞质中无染色体图 2C，中段），然后用不含CB的含0.3% dBSA的mKSOM培养基充分洗涤去核卵母细胞。将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育2 直至细胞融合。 
	注意：去核后，从卵质中移除的细胞质含有纺锤体和染色体。</li>
</ol>
6. 供体细胞与去核卵母细胞的融合
<ol>
	<li>HVJ-E 的制备
	<ol>
		<li>向冻干的 HVJ-E（来自试剂盒，参见材料表）中加入 260 µL 冰冷的 HVJ-E 悬浮液，上下吹打至完全悬浮。 
		注意：冻干的 HVJ-E 已按适当剂量预先分装于瓶中，HVJ-E 悬浮液 260 µL 也包含在试剂盒内。</li>
		<li>将 HVJ-E 溶液分装为每份 5 µL，然后于 -80 °C 保存，直至进行细胞融合。 
		注意：HVJ-E 对温度敏感，操作时应始终置于冰上。实验结束后，应将 HVJ-E 相关材料和容器进行高压灭菌处理，以彻底灭活病毒组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞融合
	<ol>
		<li>使用前，立即用 20 µL 细胞融合缓冲液稀释 5 µL HVJ-E 溶液。稀释后的 HVJ-E 溶液置于冰上待用。 
		注意：细胞融合缓冲液包含在 HVJ-E 试剂盒中。</li>
		<li>按图 3A所示准备细胞融合腔室。使用移液管（内径：150 µm 至 200 µm）将去核卵母细胞转移至细胞融合腔室中的 HCZB 培养基内；分别加入 4 µL 各种溶液（含 6% BSA 的 HCZB 培养基用于供体细胞、HVJ-E 溶液、HCZB 培养基、含 9% PVP 的 HCZB 培养基），并在腔室上方覆盖约 1 mL 矿物油。 
		注意：每次细胞融合操作中，转移至腔室中进行操作的去核卵母细胞数量宜为 5 至 30 个。若需处理更多卵母细胞，可重复进行细胞融合操作。如无专用腔室，也可使用 60 mm 培养皿盖替代。</li>
		<li>将去核卵母细胞置于室温下、HCZB 培养基中，在显微镜 400X 放大倍数下观察。使用显微操作移液管（内径 6–7 µm，平口尖端）吸取供体细胞，并将其排入 HVJ-E 悬浮液中。</li>
		<li>随后，用含 HVJ-E 的悬浮液逐个吸取卵丘细胞，使其彼此充分分离，以便进行连续的细胞融合操作。同时用固定移液管将去核卵母细胞固定在 HCZB 培养基中。使用显微操作移液管配合压电脉冲（强度 3–6，速度 2–3）钻穿透明带。</li>
		<li>在透明带打孔后，将一个卵丘细胞紧密贴附于卵母细胞膜表面，同时加入体积为卵丘细胞体积 5 倍的 HVJ-E 悬浮液，注意不要穿透卵母细胞膜。 
		注意：用于卵丘细胞的显微操作移液管应制备为内径 6–7 µm 的平口尖端。为保证细胞顺利释放，移液管需定期使用含 9% PVP 的培养基清洗。步骤 6.2.3 至 6.2.5 必须在 10 分钟内完成，否则细胞融合效率将下降。HVJ-E 的膜融合活性可被高压灭菌、去垢剂处理或 70% 乙醇灭活。实验结束后，HVJ-E 溶液必须妥善处理。</li>
		<li>完成细胞融合操作后，立即将卵母细胞转移至含 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中，并置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 重构卵母细胞的激活及曲古抑菌素A与维生素C处理
<ol>
	<li>TSA 的制备
	<ol>
		<li>将 5 mM TSA 溶液分装为每份 3 µL，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>取 2.5 µL 的 5 mM TSA 储存液加入 1 mL DMSO 中（终浓度为 12.5 µM）。</li>
		<li>将 8 µL 的 12.5 µM TSA 储存液加入 2 mL 激活培养基和 mKSOM 培养基中（终浓度为 50 nM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VC 的制备
	<ol>
		<li>将 1 mg VC 溶于 1 mL 无菌无内毒素水中，于 -20 °C 保存。</li>
		<li>将 VC 储存液加入 mKSOM 培养基中（终浓度为 10 µg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重构卵母细胞的激活
	<ol>
		<li>细胞融合后 1 小时，使用显微镜（400X）观察重构卵母细胞中的早熟染色体凝集（PCC）现象（图 3B）。</li>
		<li>将重构卵母细胞转移至含有 TSA 的激活培养基中（见步骤 1.3），在 37 °C、5% CO2 的空气环境中孵育 6 小时（图 3C）。观察体细胞核移植（SCNT）胚胎中原核的形成，随后在含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中继续进行 2 小时的 TSA 处理（图 2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将经 TSA 处理的胚胎转移至添加 VC 的 mKSOM 培养基中，孵育 7 小时，如 图 3D 所示。</li>
	<li>VC 处理 7 小时后，将经 VC 处理的胚胎转移至含有 0.3% dBSA 的 mKSOM 培养基中，在 37 °C、5% CO2 的空气环境中继续孵育 4 天。 
	注意：为获得克隆小鼠，应在假孕雌性小鼠（MCH(ICR)）发现阴道栓的当天（假孕 0.5 天）将形态正常的 2-细胞期胚胎移植至其输卵管中15。19.5 天后通过剖腹产记录着床部位数量及出生仔鼠数量。</li>
</ol>

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<li>Shi, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichostatin+A+%28TSA%29+improves+the+development+of+rabbit-rabbit+intraspecies+cloned+embryos%2C+but+not+rabbit-human+interspecies+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Trichostatin A (TSA) improves the development of rabbit-rabbit intraspecies cloned embryos, but not rabbit-human interspecies cloned embryos.</a> Dev Dyn. 237 (3), 640-648 (2008).</li>
<li>Esteban, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+enhances+the+generation+of+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Vitamin C enhances the generation of mouse and human induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 71-79 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

综上所述，这些结果表明，本文介绍的体细胞核移植（SCNT）方法能够减少技术难度，在无需进行遗传修饰和补充mRNA的情况下提高SCNT效率（表1，表2），并确保克隆胚胎的稳定生产。由于更高的存活率和简化的操作流程，该方法使我们能够比传统方法重建更多的SCNT胚胎。在本实验方案中，一个关键步骤是细胞融合。为了成功获得克隆小鼠，必须确保在细胞融合过程中维持方案中所述适量的HVJ-E，并且在步骤6.2.3至6.2.5期间，卵母细胞需在10分钟内放回培养箱。由于一次可在操作移液管中同时吸取20至30个供体细胞与HVJ-E，因此单次操作所获得的卵母细胞数量多于现有方法。最终，我们可在10分钟内重建约20至30个卵母细胞。即使处理大批量卵母细胞（100个或更多），通过重复步骤6.2.3至6.2.5，细胞融合过程也应在一小时或更短时间内完成。本文所展示的方法与技术可作为技术要求简化的高效实验方案。
目前，体细胞核移植（SCNT）胚胎发育背后的分子机制仍不清楚。这种改进的SCNT方法有助于研究此类重编程机制，因为该方法仅通过一次实验即可产生大量克隆胚胎。该方法使用细胞膜完整的体细胞进行细胞融合。因此，此方法可能适用于其他类型的细胞，例如尾尖细胞16、塞尔托利细胞（sertoli cells）17和胚胎干细胞（ES细胞）18。当使用传统SCNT方法将相对较大的细胞（如尾尖细胞）直接注射到卵母细胞胞质中时，获得存活胚胎的技术难度会进一步增加。此外，相对坚硬的细胞（如塞尔托利细胞）难以通过移液操作破碎以进行注射。考虑到这些不同类型的细胞，利用HVJ-E进行细胞融合的方法显得更为简便且高效。尽管HVJ-E的价值与安全性已得到充分证实19,20，但在农业或生物医学目的的克隆动物生产中，仍有必要重新评估使用HVJ-E的可行性。
此外，最近有研究团队成功利用尿液细胞培育出克隆小鼠21。为了拯救濒危哺乳动物物种，今后采用无创方式获取的细胞（例如尿液细胞）进行体细胞核移植（SCNT）将是理想策略。更近的一项研究中，另一团队已直接利用抗原特异性CD4+ T细胞成功生成克隆小鼠22。值得探讨的是，该方法是否也可高效应用于此类细胞的克隆小鼠制备。此外，已有报道表明Latrunculin A在抑制SCNT卵母细胞去核及孤雌激活过程中肌动蛋白聚合方面，是一种优于细胞松弛素B的替代试剂23。未来的研究或将揭示，使用Latrunculin A处理是否能进一步提高克隆后代的生成效率。另外，曲古抑菌素A（TSA）处理已在小鼠、猪24和兔25中通过调整处理时间、持续时长和浓度而成功应用。此外，维生素C（VC）不仅可促进猪SCNT胚胎的发育10，还能提高人类和小鼠诱导多能干细胞（iPS细胞）的生成效率26。因此，可以合理推测TSA与VC处理也有望应用于其他哺乳动物物种，但可能需要针对不同物种优化TSA和VC的处理时间。
总之，该方法可以通过简单的操作实现具有实用水平效率的克隆小鼠制备。因此，本研究的结果可能使我们能够利用体细胞核移植（SCNT）技术来保存珍稀动物的遗传资源，并深入理解细胞核重编程及早期胚胎发育的分子机制。

体细胞核移植（SCNT）技术能够利用单个体细胞或细胞核，将其转移至去核卵母细胞中，从而实现克隆动物的制备。SCNT技术的目的之一是从克隆胚胎中建立核移植胚胎干细胞（NT-ESCs）系。1998年，Wakayama et al. 首次报道成功培育出名为“Cumulina”的克隆小鼠1。自那时起，小鼠克隆技术得到了广泛研究，人们对体细胞核重编程机制也获得了许多重要认识。然而，该技术涉及大量显微操作步骤，掌握难度较高，通常需要超过3个月的 intensive 培训2。
利用体细胞核移植技术（SCNT）制备克隆小鼠的方法已从最初的火奴鲁鲁法1、电融合法3发展到日本血凝病毒（HVJ）介导的细胞融合法4。然而，将细胞核直接注射穿过细胞膜的方法往往会对卵母细胞的存活产生不利影响。电融合法效率较低，因为每个细胞膜的硬度不同，难以确定最佳操作条件。使用HVJ的操作较为繁琐，因其需要特殊的设备以确保研究人员和实验动物的安全。近年来，在体细胞核移植过程中，已开始使用HVJ-E来实现供体细胞与卵母细胞胞质的融合5。HVJ-E仅保留了膜融合能力，而不再具有病毒的增殖或感染能力。HVJ的基因组RNA在HVJ-E中已被完全灭活。因此，使用HVJ-E有助于在SCNT过程中更简便地进行细胞融合操作。
已有数项研究表明，使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理体细胞核移植（SCNT）胚胎，可显著提高活仔出生率，使其从不足1%提升至6.5%6,7。TSA处理通过修饰SCNT胚胎中的组蛋白标记，加速重编程过程8。最近研究发现，向SCNT胚胎中注射特定mRNA——组蛋白赖氨酸去甲基化酶亚家族4（KDM4），可去除重编程抵抗区域等位点上的组蛋白H3第9位赖氨酸（H3K9）三甲基化修饰，从而促进克隆小鼠胚胎的发育9。与此同时，维生素C（VC）作为一种组蛋白修饰因子，也可降低H3K9的三甲基化水平10。此外，VC还能促进猪SCNT胚胎的发育10。据报道，向SCNT胚胎中注射去脂牛血清白蛋白（dBSA）亦可改善胚胎发育能力11。
我们先前发现，小分子化合物TSA和VC与dBSA联合使用可显著促进体细胞核移植（SCNT）胚胎的发育12。本文详细描述了此前报道的小鼠SCNT方法，该方法具有高效且操作简便的特点12。我们还介绍了HVJ-E的处理方法。这些技术可帮助发育生物学与生殖生物学领域的众多研究人员利用该SCNT方法保存遗传资源或制备基因修饰动物。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>28-2270-5</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-03542</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>165-04242</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>137-00402</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>039-00431</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>D(+)-葡萄糖</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>041-00595</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>199-03062</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>G3126</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>168-17042</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31213-15</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>DL-乳酸钠</td><td>Nacalai tesque, Inc.</td><td>31605-72</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222637671 (GTIN-13)</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Meiji Seika Pharma Co., Ltd.</td><td>4987222665643 (GTIN-13)</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>无菌水，无内毒素</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>196-15645</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>EDTA &amp;middot; 2Na</td><td>Dojindo Lab.</td><td>345-01865</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P0290</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>HEPES 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3784</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>P8136</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A3311</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>BT AG 501-X8 (D) 树脂</td><td>Bio-Rad Lab., Inc.</td><td>143-7425</td><td>用于 dBSA 的制备</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>H3506</td><td>用于卵母细胞和卵丘细胞的收集</td></tr><tr><td>细胞松弛素 B</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>034-17554</td><td>用于去核和卵母细胞激活</td></tr><tr><td>Piezo 微操作仪</td><td>Prime tech, Co., Ltd.</td><td>PMM-150FU</td><td>用于显微操作</td></tr><tr><td>HVJ 包膜细胞融合试剂盒 GenomONE-CF</td><td>Ishihara sangyo kaisha, Ltd.</td><td>CF001</td><td>包含 0.5 mL HVJ-E 悬浮液和 10 mL 细胞融合缓冲液，用于细胞融合</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>193-09442</td><td>用于卵母细胞激活</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>E8145</td><td>用于卵母细胞激活</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>045-24511</td><td>用作溶剂</td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>T1952</td><td>用于与 SCNT 胚胎共孵育</td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>A5960</td><td>用于与 SCNT 胚胎共孵育</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich, Co., Lcc.</td><td>M8410</td><td>用于覆盖培养基</td></tr></tbody></table>

联合使用曲古抑菌素a与维生素c可提高体细胞核移植克隆小鼠的效率

Combinational Treatment of Trichostatin A and Vitamin C Improves the Efficiency of Cloning Mice by Somatic Cell Nuclear Transfer

体细胞核移植（SCNT）为直接利用供体细胞产生克隆动物提供了独特的机会，但该技术需要熟练的操作技巧。此外，自成功获得克隆动物（尤其是小鼠）以来，克隆效率一直较低。已有许多研究尝试提高克隆效率，其中组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）已被广泛用于提升克隆效率。本文报道了一种在小鼠中显著改进的克隆方法。该体细胞核移植方法利用日本血凝病毒包膜（HVJ-E），实现了简便的操作。此外，联合使用两种小分子化合物TSA和维生素C（VC）以及去离子化牛血清白蛋白（dBSA）的处理策略，对胚胎发育具有显著促进作用。该方法无需额外注射或基因操作，因此是一种简单且适用于实际应用的技术。该方法有望成为研究人员从培养细胞中制备基因修饰动物的一种技术上可行的途径。此外，它也可能成为通过克隆技术拯救濒危动物的有效手段。

为了制备克隆小鼠胚胎，采用了卵丘细胞和胎儿成纤维细胞。重构卵母细胞的数量以及卵母细胞激活后发育至2细胞阶段的情况如表所示 表1在所有条件下，均观察到极高的原核形成率（89%至100%）和发育至2细胞阶段的比例（77%至89%）。部分来源于卵丘细胞并发育至2细胞阶段的克隆胚胎被移植至假孕雌性小鼠的输卵管中。通过TSA和VC的连续处理，72枚移植胚胎中由三只妊娠雌性产下6只克隆后代图4据报道，采用该体细胞核移植（SCNT）程序，约有15%的克隆胚胎能够发育至足月12此外，在其他机构进行的克隆2细胞胚胎移植已获得9%至15%的活产率，其发育效果优于仅对克隆胚胎进行单一TSA处理。此外，TSA与VC联合处理显著提高了克隆效率 体外 胚胎发育至囊胚阶段（表2, P &lt;0.05，Student's t检验）。这些 体外 发育数据表明，TSA和VC的促进作用不受小鼠品系或细胞类型的限制。这些结果提示，该SCNT方法可增强克隆胚胎的发育能力。
<img alt="离子交换示意图：使用 BSA 和树脂的颜色变化指示交换完成。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：脱盐牛血清白蛋白（dBSA）的制备。 
图中展示了制备dBSA溶液的逐步操作流程。离子交换的程度可通过树脂珠的颜色变化来判断。左上方图示显示，将1.2 g BSA溶解于10 mL无菌水中，室温下进行。BSA完全溶解后，加入离子交换树脂珠（右上方）。当BSA溶液与离子交换树脂珠的混合物颜色由蓝绿色变为金黄色时（右下方），应更换为新的树脂珠。左下方图示显示树脂珠颜色保持蓝绿色不变，表明离子交换过程已完成。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="体外受精示意图：极体、纺锤体分析、显微镜检查、胚胎发育研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：去核操作流程。 
(A) 去核腔室示意图。卵母细胞的去核操作在含CB的HCZB培养基中进行。对于压电驱动系统，使用一滴9% PVP培养基来准备去核用的玻璃移液管。液滴表面覆盖矿物油。(B) 示意图与显微图像显示去核前纺锤体与染色体的位置。黑色箭头：纺锤体与染色体。红色箭头：第一极体。(C) 示意图与显微图像显示成功的去核结果。黑色箭头：纺锤体与染色体。红色箭头：第一极体。蓝色箭头：透明带上的孔洞。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="卵母细胞激活过程示意图；PCC，原核形成；细胞培养设置及时间线步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：体细胞核移植胚胎的细胞融合程序及培养条件。 
(A) 细胞融合室的示意图。细胞融合在含有6% dBSA的HCZB培养基中进行。使用一滴9% PVP培养基制备用于细胞融合的玻璃移液管。液滴表面覆盖矿物油。(B) 细胞融合后1小时形成的早熟染色体凝集的示意图及显微图像（黑色箭头所示）。(C) 激活后6小时形成的原核结构的示意图及显微图像（黑色箭头所示）。(D) SCNT胚胎经TSA、VC和dBSA处理的方案示意图。绿色箭头表示TSA处理，随后在含有0.3% dBSA的mKSOM培养基中（蓝色箭头）孵育VC（黄色箭头）。箭头指示更换培养基的时间点。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类胎儿及胎盘组织的胚胎发育阶段，实验研究设置" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57036/57036fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：妊娠19.5天后剖宫产刚取出的卵丘细胞所获得的克隆后代。 
第一行显示的是胎盘。此处展示的克隆后代来自一次核移植实验，由三只代孕母体产生。这些胎盘的大小比正常情况下产生的胎盘大1.5到2倍。 体外 受精 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57036/57036fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组</td>
			<td>供体细胞类型</td>
			<td colspan="2">小鼠品系</td>
			<td>使用卵母细胞数量</td>
			<td>融合卵母细胞数</td>
			<td>显示早熟染色体凝集的卵母细胞数</td>
			<td>显示原核形成的卵母细胞数（%）</td>
			<td>形成原核的卵母细胞数 
			至2细胞胚胎（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA，VC</td>
			<td>卵丘</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>81 (99)</td>
			<td>72 (89)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未处理</td>
			<td>卵丘</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>84</td>
			<td>82</td>
			<td>82</td>
			<td>82 (100)</td>
			<td>68 (83)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA，VC</td>
			<td>胎儿成纤维细胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>202</td>
			<td>171</td>
			<td>169</td>
			<td>151 (89)</td>
			<td>124 (82)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未处理</td>
			<td>胎儿成纤维细胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>201</td>
			<td>171</td>
			<td>147</td>
			<td>142 (97)</td>
			<td>109 (77)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：TSA和VC处理对 体外 克隆小鼠胚胎发育至2细胞阶段。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">组别</td>
			<td rowspan="2">供体细胞类型</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">小鼠品系</td>
			<td rowspan="2">使用的2细胞胚胎数</td>
			<td colspan="3">发育至各阶段的2细胞胚胎数（%）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4细胞期</td>
			<td>桑葚胚</td>
			<td>囊胚</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA, VC</td>
			<td>卵丘细胞</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>152</td>
			<td>152 (100)</td>
			<td>149 (98)</td>
			<td>135 (89) a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未处理</td>
			<td>卵丘细胞</td>
			<td colspan="2">C57BL/6× DBA/2</td>
			<td>83</td>
			<td>47 (57)</td>
			<td>41 (49)</td>
			<td>32 (39) b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA, VC</td>
			<td>胎儿成纤维细胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>124</td>
			<td>110 (89)</td>
			<td>101 (81)</td>
			<td>88 (71) c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未处理</td>
			<td>胎儿成纤维细胞</td>
			<td colspan="2">MCH(ICR)×MCH(ICR)</td>
			<td>109</td>
			<td>54 (50)</td>
			<td>45 (41)</td>
			<td>29 (27) d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">a-b, c-d 相同供体细胞内不同上标表示差异显著（P &lt; 0.05）</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：TSA和VC处理对 体外 克隆小鼠胚胎发育至囊胚阶段

我们介绍了一种利用曲古抑菌素A、维生素C和去离子牛血清白蛋白显著改进的小鼠克隆方法。我们展示了一种简化且可重复的方案，能够有效支持克隆胚胎的发育。因此，该方法有望成为小鼠克隆的标准化操作流程。

联合使用曲古抑菌素A与维生素C可提高体细胞核移植克隆小鼠的效率

体细胞核移植（SCNT）为直接利用供体细胞产生克隆动物提供了独特的机会，该过程需要使用……

本实验的总体目标是利用体细胞核移植技术提高重构胚胎和克隆小鼠的生产效率。该方法有助于回答基础生物学、发育生物学以及濒危动物保护领域中的关键科学问题，例如胚胎发育、核重编程以及遗传资源保护研究。该方法和技术的主要优势在于，通过简单的操作即可以实用的效率获得克隆小鼠。根据文本方案配制培养基后，将 1.2 克 BSA 溶解于 10 mL 无菌室温水中。在室温下，向 BSA 溶液中加入约 0.12 克混合离子交换树脂珠，轻轻搅拌。当珠子的颜色由蓝绿色变为金色时，使用移液器回收上清液，然后更换为新的一批珠子。确认新珠子颜色不变后，回收溶液。然后加入 250 微升 10.5% 碳酸氢钠。使用0.45微米滤器对上清液进行除菌，然后将其标记为DBSA储备液，并在-20摄氏度下保存。根据文本方案对经过超数排卵处理的雌性小鼠实施安乐死后，采用标准解剖技术切开腹部以暴露生殖道。使用小型直剪刀和镊子取出输卵管，并将其转移至一张滤纸上，擦去表面的血液。接下来，将输卵管置于矿物油中，然后使用解剖针切碎输卵管的壶腹部，并将从壶腹部释放出的卵丘-卵母细胞复合体移入含有0.1%透明质酸酶的200微升HCZB培养液滴中。将组织在加热板上孵育5分钟。在体视显微镜下确认卵丘细胞已从卵丘-卵母细胞复合体中释放，然后将仍带有部分卵丘细胞的第二次减数分裂或M2中期阶段的卵母细胞转移至含有0.3%DBSA的MKSOM培养基中。用移液器在培养基中反复吹打，将M2期卵母细胞洗涤四次，以去除残留的卵丘细胞。随后将卵母细胞置于培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至去核操作。为从卵丘-卵母细胞复合体中分离出裸卵母细胞，在体视显微镜下使用移液器将少量从卵丘-卵母细胞复合体中分散出的残留卵丘细胞转移至含6%DBSA的HCZB培养基中。将卵丘细胞置于37摄氏度的加热板上，待进行体细胞核移植（SCNT）时使用。根据文本方案配制PVP培养基和CB储备液后，使用灭菌移液器吸取含有5微克/毫升CB的20微升HCZB培养基，洗涤处于M2期的卵母细胞。重复洗涤五次后，将卵母细胞置于去核液中，在加热板上孵育10分钟。接下来，准备去核室，然后使用移液器将M2期卵母细胞转移至去核室中。加入4 µL去核液，并用矿物油覆盖去核室。在室温下通过显微镜观察，识别M2期卵母细胞的纺锤体和染色体。然后使用持卵管和显微注射针，将具有明显第一极体的卵母细胞调整方向，使纺锤体和染色体位于3:00或9:00位置。将电融合仪的脉冲强度设置为3至6，利用显微操作针在透明带表面钻孔并打开一个开口。随后吸取极少量细胞质，彻底去除纺锤体和染色体。在可见光下确认细胞质中无染色体存在，然后用含有0.3% DBSA但不含CB的MKSOM培养基彻底清洗去核卵母细胞。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育，直至细胞融合。制备HBJE时，将260微升预冷的HBJE悬浮液加入冻干的HVJ-E中，反复吹打至完全悬浮。将溶液配制成5 µL的等分试样，于-80 °C保存，直至进行细胞融合。进行细胞融合时，用20 µL细胞融合缓冲液稀释5 µL HVJ-E溶液。将稀释后的HVJ-E溶液置于冰上，待用。按照图示制备细胞融合室后，使用移液器将去核卵母细胞转移至融合室内的 HCZB 培养基中。按图示分别加入 4 微升每种溶液，并使用约 1 毫升矿物油覆盖融合室。将盛有去核卵母细胞的融合室置于显微镜下，于室温、400 倍放大条件下放置。然后使用显微操作移液管将供体细胞转移至HVJ-E悬浮液中。逐个吸取卵丘细胞，使其彼此均匀分离，以实现连续的细胞融合。接着用固定移液管将去核卵母细胞固定在HCZB培养基中，并利用显微操作移液管配合压电脉冲钻穿透明带。在透明带打孔后，用大约五倍于HVJ-E溶液体积的移液管吸取一个卵丘细胞，并将其紧贴卵母细胞膜排出，注意不要穿透细胞膜。完成细胞融合操作后，立即将卵母细胞转移至含有0.3% DBSA的MKSOM培养基中，并放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。从显微镜下将去核卵母细胞置入HCVB培养基开始，到重新放回培养箱为止，整个操作步骤需在10分钟内完成。细胞融合后，在显微镜下以400倍放大观察重构卵母细胞中是否出现染色体早熟凝集现象。将重构卵母细胞转移至含有曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）的激活培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳的空气环境中孵育6小时。观察SENT胚胎中原核的形成情况，随后在含有0.3% TBSA的MKSOM培养基中继续进行2小时的TSA处理。根据文本方案进行维生素C处理。如本表所示，经TSA和维生素C处理的克隆小鼠卵母细胞在所有条件下均表现出极高的原核形成率，并发育至二细胞阶段。部分由卵丘细胞来源的克隆胚胎发育至二细胞阶段后，被移植至假孕雌鼠的输卵管中。该图显示了通过连续使用 TSA 和维生素 C 处理，由三只妊娠雌性动物产生的 72 个移植胚胎发育而来的六只克隆后代。最后，如本研究所示，TSA 和 VC 处理显著提高了体外胚胎发育至囊胚阶段的效率。在进行该操作时，重要的是要记住所有必要的培养基和试剂都应提前准备好。该操作流程本身简单易行，充分准备的材料将确保获得预期结果。观看本视频后，您应能充分理解如何制备重构卵母细胞。

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Developmental Biology

发育生物学

Trichostatin a 和维生素 C 的组合治疗提高体细胞细胞核移植克隆小鼠的效率

本文展示了通过体细胞核移植（SCNT）进行表观遗传重编程可作为一种工具，用于构建具有预设T细胞受体（TCR）特异性的转基因小鼠模型。这些转基因小鼠在其内源性启动子的调控下，于内源性基因座表达相应的TCR。...

通过体细胞核移植技术获得的针对Toxoplasma gondii具有预定义T细胞受体特异性的转基因核小鼠

本文展示了两种截然不同的注射方法：1）脑内注射（脑室内注射）和...

通过脑室内（ICV）和静脉内（IV）注射在小鼠中递送治疗剂

诱导多能干细胞（iPSC）系的建立会产生具有不同发育潜能的细胞系，即使这些细胞系能够通过多能性的标准检测。本文介绍一种完全由iPSCs衍生小鼠的实验方案，该方法可确认iPSC系具有完全的多能性1。...

由诱导性多能干细胞衍生小鼠的制备

本研究展示了体细胞向多能性的重编程 体内 不会形成畸胎瘤。我们采用水动力尾静脉注射编码山中因子的质粒DNA来诱导 体内...

体内 通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

我们详细描述了两种基于化学方法培养小鼠胚胎干细胞的方案。这种新方法利用了促进Tet介导的氧化（通过维生素C）和抑制的协同机制 从头合成...

使用MEK抑制剂PD0325901和维生素C维持小鼠胚胎干细胞基因组低甲基化的一种替代性培养方法

本文介绍一种无需使用新设备即可提高嵌合体生产效率的实验方案。通过简单改变胚胎注射时的方位，可增加所获得胚胎的数量，并可能缩短种系传递的时间进程。...

内细胞团内注射胚胎干细胞可提高嵌合率

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本方案描述了一种在含有2i和LIF培养基的培养条件下对小鼠胚胎干细胞进行反向多转染的方法。与传统的正向转染方案相比，该方法具有更高的细胞存活率和转染效率，同时能够实现质粒比例的一锅法优化。...

一种优化的小鼠胚胎干细胞反向多转染技术用于快速探索核酸比例

本方案介绍了一种简单的微吸法技术，用于从冷冻保存的马精液中分离具有活力的体细胞（SCs）。与传统方法不同，该技术避免了长时间 体外...

一种用于从冷冻保存的马精液中分离体细胞作为克隆核供体的简易微吸管技术

了解利用曲古抑菌素A和维生素C组合处理提高体细胞核移植克隆小鼠效率的优化方法。该技术通过改进胚胎培养条件，为发育生物学研究及濒危物种保护提供了实用且可重复的实验方案。

联合使用曲古抑菌素A与维生素C可提高体细胞核移植克隆小鼠的效率

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