联合使用曲古抑菌素A与维生素C可提高体细胞核移植克隆小鼠的效率

本实验的总体目标是利用体细胞核移植技术提高重构胚胎和克隆小鼠的生产效率。该方法有助于回答基础生物学、发育生物学以及濒危动物保护领域中的关键科学问题，例如胚胎发育、核重编程以及遗传资源保护研究。

该方法和技术的主要优势在于，通过简单的操作即可以实用的效率获得克隆小鼠。根据文本方案配制培养基后，将 1.2 克 BSA 溶解于 10 mL 无菌室温水中。在室温下，向 BSA 溶液中加入约 0.12 克混合离子交换树脂珠，轻轻搅拌。

当珠子的颜色由蓝绿色变为金色时，使用移液器回收上清液，然后更换为新的一批珠子。确认新珠子颜色不变后，回收溶液。然后加入 250 微升 10.5% 碳酸氢钠。

使用0.45微米滤器对上清液进行除菌，然后将其标记为DBSA储备液，并在-20摄氏度下保存。根据文本方案对经过超数排卵处理的雌性小鼠实施安乐死后，采用标准解剖技术切开腹部以暴露生殖道。使用小型直剪刀和镊子取出输卵管，并将其转移至一张滤纸上，擦去表面的血液。

接下来，将输卵管置于矿物油中，然后使用解剖针切碎输卵管的壶腹部，并将从壶腹部释放出的卵丘-卵母细胞复合体移入含有0.1%透明质酸酶的200微升HCZB培养液滴中。将组织在加热板上孵育5分钟。在体视显微镜下确认卵丘细胞已从卵丘-卵母细胞复合体中释放，然后将仍带有部分卵丘细胞的第二次减数分裂或M2中期阶段的卵母细胞转移至含有0.3%DBSA的MKSOM培养基中。

用移液器在培养基中反复吹打，将M2期卵母细胞洗涤四次，以去除残留的卵丘细胞。随后将卵母细胞置于培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育，直至去核操作。为从卵丘-卵母细胞复合体中分离出裸卵母细胞，在体视显微镜下使用移液器将少量从卵丘-卵母细胞复合体中分散出的残留卵丘细胞转移至含6%DBSA的HCZB培养基中。

将卵丘细胞置于37摄氏度的加热板上，待进行体细胞核移植（SCNT）时使用。根据文本方案配制PVP培养基和CB储备液后，使用灭菌移液器吸取含有5微克/毫升CB的20微升HCZB培养基，洗涤处于M2期的卵母细胞。重复洗涤五次后，将卵母细胞置于去核液中，在加热板上孵育10分钟。

接下来，准备去核室，然后使用移液器将M2期卵母细胞转移至去核室中。加入4 µL去核液，并用矿物油覆盖去核室。在室温下通过显微镜观察，识别M2期卵母细胞的纺锤体和染色体。

然后使用持卵管和显微注射针，将具有明显第一极体的卵母细胞调整方向，使纺锤体和染色体位于3:00或9:00位置。将电融合仪的脉冲强度设置为3至6，利用显微操作针在透明带表面钻孔并打开一个开口。随后吸取极少量细胞质，彻底去除纺锤体和染色体。

在可见光下确认细胞质中无染色体存在，然后用含有0.3% DBSA但不含CB的MKSOM培养基彻底清洗去核卵母细胞。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育，直至细胞融合。制备HBJE时，将260微升预冷的HBJE悬浮液加入冻干的HVJ-E中，反复吹打至完全悬浮。

将溶液配制成5 µL的等分试样，于-80 °C保存，直至进行细胞融合。进行细胞融合时，用20 µL细胞融合缓冲液稀释5 µL HVJ-E溶液。将稀释后的HVJ-E溶液置于冰上，待用。

按照图示制备细胞融合室后，使用移液器将去核卵母细胞转移至融合室内的 HCZB 培养基中。按图示分别加入 4 微升每种溶液，并使用约 1 毫升矿物油覆盖融合室。将盛有去核卵母细胞的融合室置于显微镜下，于室温、400 倍放大条件下放置。

然后使用显微操作移液管将供体细胞转移至HVJ-E悬浮液中。逐个吸取卵丘细胞，使其彼此均匀分离，以实现连续的细胞融合。接着用固定移液管将去核卵母细胞固定在HCZB培养基中，并利用显微操作移液管配合压电脉冲钻穿透明带。

在透明带打孔后，用大约五倍于HVJ-E溶液体积的移液管吸取一个卵丘细胞，并将其紧贴卵母细胞膜排出，注意不要穿透细胞膜。完成细胞融合操作后，立即将卵母细胞转移至含有0.3% DBSA的MKSOM培养基中，并放入37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育1小时。从显微镜下将去核卵母细胞置入HCVB培养基开始，到重新放回培养箱为止，整个操作步骤需在10分钟内完成。

细胞融合后，在显微镜下以400倍放大观察重构卵母细胞中是否出现染色体早熟凝集现象。将重构卵母细胞转移至含有曲古抑菌素A（trichostatin A，TSA）的激活培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳的空气环境中孵育6小时。观察SENT胚胎中原核的形成情况，随后在含有0.3% TBSA的MKSOM培养基中继续进行2小时的TSA处理。

根据文本方案进行维生素C处理。如本表所示，经TSA和维生素C处理的克隆小鼠卵母细胞在所有条件下均表现出极高的原核形成率，并发育至二细胞阶段。部分由卵丘细胞来源的克隆胚胎发育至二细胞阶段后，被移植至假孕雌鼠的输卵管中。

该图显示了通过连续使用 TSA 和维生素 C 处理，由三只妊娠雌性动物产生的 72 个移植胚胎发育而来的六只克隆后代。最后，如本研究所示，TSA 和 VC 处理显著提高了体外胚胎发育至囊胚阶段的效率。在进行该操作时，重要的是要记住所有必要的培养基和试剂都应提前准备好。该操作流程本身简单易行，充分准备的材料将确保获得预期结果。

观看本视频后，您应能充分理解如何制备重构卵母细胞。