利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

由于类器官能够重现肠道上皮在体内的天然结构组织以及许多分子特征，该技术使我们能够在实验室中研究正常的生物学过程及疾病状态。该技术的主要优势在于能够利用一种高效且细胞毒性低的转导方法对类器官进行基因工程改造，从而实现对这些基因修饰类器官的功能研究。该技术的应用前景可延伸至肠道疾病的治疗，因为我们能够将肠道类器官暴露于药物或其他试剂或干预措施中。

该方法可应用于研究其他适用于类器官培养体系的发育和病理过程，例如乳腺组织，或在标准二维条件下培养的细胞。通常情况下，初次使用该方法的研究人员也能成功实现难以转导的类器官或其他细胞的转导。我们最初提出该方法的构想，源于在转导类器官和干细胞时遇到了困难。

该方法的可视化演示至关重要，因为在类器官包埋于基底膜基质进行冷冻切片的过程中，若样品处理不当，可能导致类器官结构的丧失。为了进行病毒转导而培养类器官，需将类器官细胞以每孔200 µL转导培养基接种至48孔板中，并在标准组织培养孵育箱中孵育。解冻用于转导的病毒冻存管，每孔（48孔板）转导需准备约50 µL浓缩病毒。

在1.5毫升离心管中，将病毒与12 µL磁性纳米颗粒溶液混合，在室温下孵育15分钟。15分钟后，将磁性纳米颗粒溶液与病毒的混合物加入待转导的细胞中。将48孔板置于磁板上，在标准组织培养孵育箱中孵育至少2小时。

病毒转染完成后，将每个孔中被感染的类器官细胞簇及转导培养基转移至1.5毫升离心管中。在500 × g条件下离心5分钟。用轻柔抽吸法弃去上清液，并将含有细胞沉淀的离心管置于冰上冷却5分钟。

向每管中加入 120 微升基底膜基质，通过缓慢吹打重悬沉淀。将 30 微升基质-细胞混合物滴加至新的 48 孔板中。于 37 摄氏度孵育 5 至 15 分钟，直至基质凝固。

向每个孔中加入转导培养基，在标准组织培养孵育箱中孵育三至四天。三至四天后，在10倍放大倍数的光学显微镜下观察培养物，以确认细胞簇已有序形成类器官结构。轻轻将每孔中的转导培养基更换为250 µL类器官培养ENR培养基。

将培养板放回培养箱。首先用轻柔的抽吸法去除ENR培养基，注意不要扰动基底膜基质。用500微升PBS轻轻洗涤。

通过向每孔加入一微升4%多聚甲醛溶液固定类器官，并在室温下孵育30分钟。30分钟后，用吸液法去除多聚甲醛溶液。每孔轻轻加入一微升PBS，然后用轻柔的吸液法去除PBS。

以这种方式，用 PBS 洗涤两次。弃去第二次洗涤的 PBS，并向每个样本中加入一微升 30% 蔗糖缓冲液。将固定的类器官在蔗糖溶液中于 4°C 孵育一小时，以对样本进行脱水。

用吸管吸去蔗糖缓冲液，每孔中加入足量包埋剂以覆盖基质层。室温孵育5分钟。随后，将样品置于-80摄氏度冰箱中10分钟，或直至包埋剂变为固体且呈白色。

将含有冷冻包埋剂的载板置于室温下，使包埋剂边缘轻微融化。使用解剖刀或刮匙将组织块从孔壁上分离。操作需迅速，以防包埋剂融化，用镊子取出基质包埋的组织块，并将其放入样品模具中。

用包埋剂完全填充模具。在使用组织块进行切片前，于负80摄氏度冷冻30分钟。本实验方案经过优化，首先使用与GFP连接的慢病毒载体转导肠道类器官。

在类器官发育的各个阶段均对GFP进行了可视化观察，包括早期隐窝细胞组织形成囊状结构时，以及后期类器官形成芽状结构时。成功转导的肠类器官随后经甲醛固定、冷冻切片，并通过免疫荧光成像进行分析。在此图像中，细胞核染成蓝色，绿色表示上皮细胞黏附分子，用于标记细胞边界。

红色表示溶酶体染色，用于鉴定潘氏细胞。掌握该技术后，类器官转导操作约需三小时完成，类器官冷冻切片包埋约需两个半小时完成。进行该操作时，需注意在处理基底膜基质试剂时应始终在冰上操作。

完成此操作后，可进行免疫荧光分析及其他检测蛋白质或细胞器的方法，以评估其定位或相对丰度。该技术为研究人员探索正常生物学过程及疾病状态提供了途径，既可用于体外研究，也可用于体内研究——前提是转导后的类器官或细胞可被移植到小鼠体内。观看本视频后，您应充分理解如何使用磁标记病毒对类器官进行遗传工程改造以用于冷冻切片。

请注意，操作病毒可能具有极高的危险性，进行本实验时应始终采取预防措施，例如穿戴适当的防护装备。