Name: 使用磁纳米粒子转导病毒载体进行冷冻切片的原小鼠肠道器官的遗传工程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习使用磁纳米粒子转导病毒载体对小鼠肠道类器官进行高效基因工程改造，并制备冷冻切片用于基因表达研究。该方法具有低细胞毒性，适用于发育和病理过程的功能研究。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（R01DK102943、R03CA182679、R03CA191621）、马里兰干细胞研究基金（2015-MSCRFE-1759、2017-MSCRFD-3934）、美国肺脏协会、阿勒格尼健康网络-约翰斯·霍普金斯研究基金以及霍普金斯消化系统疾病基础研究核心中心的资助。

本实验方案已获约翰斯·霍普金斯医学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。本方案改编自先前发表的方法10,11,12,13。
1. 试剂的准备
<ol>
	<li>提前数小时配制新鲜的293T培养基，并在使用前于水浴中加热至37 °C，至少预热10分钟（表1）。</li>
	<li>准备用于病毒包装的质粒DNA2,13,14（表2）。</li>
	<li>准备所有其他所需材料（材料表）。</li>
</ol>
2. 慢病毒或逆转录病毒颗粒的制备
<ol>
	<li>人胚胎肾（HEK）293T 细胞接种 （第 1 天）
	<ol>
		<li>用含 50 µg/mL 多聚-L-赖氨酸的磷酸盐缓冲液（PBS；每皿 10 mL）在室温（RT）下孵育 1 小时，对一个 150 mm 培养皿进行包被处理。</li>
		<li>吸除磷酸盐缓冲液（PBS）/多聚-L-赖氨酸溶液，并用 5 mL PBS 洗涤包被后的培养皿两次。</li>
		<li>将 293T 细胞（8–10 × 106）接种至 293T 培养基中（表 1），总体积为 15 mL。</li>
		<li>将 293T 细胞在标准组织培养孵箱中培养过夜（37 °C，5% CO2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HEK 293T 细胞转染（第 2 天）
	<ol>
		<li>当细胞融合度达到 70–80% 时进行转染（通常在接种 8–10 × 106 个细胞后约 24 小时）。</li>
		<li>使用高效方法（如商品化的阳离子脂质体试剂）配制转染混合物（表 1–2，材料表）2。
		<ol>
			<li>将慢病毒 DNA 载体12（总计约 24 µg 质粒 DNA，表 2）溶于 1.2 mL 转染培养基中，于 1.5 mL 离心管中室温（RT）孵育 5 分钟（材料表）。</li>
			<li>将转染试剂（36 μL）溶于 1.2 mL 转染培养基中（材料表），按生产商说明在 5 mL 离心管中室温孵育 5 分钟。</li>
			<li>将慢病毒试剂（步骤 2.2.2.1）加入转染试剂（步骤 2.2.2.2）中，用 5 mL 移液器缓慢吹打数次，轻轻混匀。</li>
			<li>室温孵育混合物 20 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用 5 mL 转染培养基轻柔洗涤 293T 细胞，然后更换为 10 mL 新鲜转染培养基。</li>
		<li>将 DNA-脂质复合物（来自步骤 2.2.2.3）逐滴加入 293T 细胞培养基中，并通过水平和垂直方向轻轻晃动培养皿，使 DNA-脂质复合物在各培养皿中均匀分布。</li>
		<li>在标准组织培养孵箱中孵育 6 小时（37 °C，5% CO2）。</li>
		<li>孵育结束后，弃去旧培养基，更换为 20 mL 新鲜病毒收集培养基（表 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒收集（第 3–5 天）
	<ol>
		<li>将病毒培养基收集至 50 mL 离心管中，置于 4 °C 冰箱中保存，用于后续浓缩。</li>
		<li>每 24 小时更换 20 mL 新鲜病毒收集培养基，并继续培养过夜（约 24 小时）。在接下来的两天内（第 4–5 天）重复收集培养基。</li>
		<li>确保第 5 天后收集的培养基总体积约为 60 mL（20 mL/天 × 3 天）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒浓缩（第 5 天）
	<ol>
		<li>将收集的培养基（60 mL）在 400 × g 条件下离心 5 分钟。随后将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤，以去除细胞碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取 15 mL 过滤后的病毒培养基加入离心过滤装置中（材料表），在 4 °C 条件下以 2,500 × g 离心 15 分钟，实现病毒浓缩。由于病毒无法通过滤膜，因此将被截留在过滤装置的上层腔室中。
	<ol>
		<li>吸除管中滤过液（下层腔室），将剩余病毒收集培养基上清液的另外 15 mL 加入同一离心过滤装置中，按上述条件再次离心（2,500 × g，4 °C，15 分钟），以进一步浓缩上清液中的病毒。</li>
		<li>使用同一滤器重复该过程，对单个转染培养皿收集的 60 mL 培养基进行处理，直至达到所需浓缩倍数（约 100 倍）。 
		注：通常将约 60 mL 病毒收集培养基浓缩至约 600 µL。</li>
		<li>用 1 mL 移液器从滤器上层腔室中取出浓缩后的病毒，分装至 1.5 mL 离心管中（每管 50–60 µL），于 -80 °C 保存以备后续使用。浓缩病毒颗粒可保存 6–12 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分离隐窝
<ol>
	<li>使用 CO₂ 处死小鼠2 根据当地IACUC指南。</li>
	<li>将安乐死后的动物仰卧放置，并用70%乙醇喷洒腹部进行清洗。</li>
	<li>从胸骨至腹股沟沿纵轴中线切开，先切开皮肤，再切开皮下组织。</li>
	<li>从小肠的胃端切除至盲肠端。</li>
	<li>在小肠中确定目标区域；可从十二指肠、空肠和回肠中分离隐窝。</li>
	<li>使用10 mL注射器，用隐窝分离缓冲液（预冷的含1 mM二硫苏糖醇（DTT）、1%青霉素/链霉素（不含Ca2+ 和 Mg2+）置于10 cm组织培养皿中（Table 1)</li>
	<li>在无菌玻璃板（15 cm × 15 cm）上去除肠组织周围的脂肪组织，并沿纵轴切开或“剖片”肠组织。</li>
	<li>使用细胞刮刀轻轻刮下肠上皮绒毛。</li>
	<li>将小肠切成2‒3厘米长的纵切段。</li>
	<li>使用平头镊子（116 mm）将组织转移至含有预冷PBS的15 mL离心管中。通过手动剧烈振荡约30秒（以相反方向移动试管约60次）清洗组织碎片。</li>
	<li>更换 PBS 并重复洗涤，直至 PBS 变澄清。 
	注：我们通常将片段洗涤 2‒3 次。</li>
	<li>在含有10 mL隐窝解离缓冲液的15 mL圆锥形离心管中孵育组织表1）在 4 ℃ 下离心 10 分钟 &#176;在 PBS 变澄清后，于中等速度的摇床上摇动。</li>
	<li>用手剧烈振荡试管约 30 秒（相反方向） &#8776;60 次），然后用平头镊子将组织转移至另一含有 10 mL 隐窝解离缓冲液的 15 mL 圆锥管中。将此部分置于冰上孵育。请勿将第一部分用于类器官培养，因其主要含有绒毛。</li>
	<li>重复步骤 3.11‒3.13，共 3‒4 次，每次收集组分并置于冰上。</li>
	<li>通过扫描200，选择富含最高百分比肠隐窝的组分 &#181;在倒置显微镜下（4倍物镜）观察各组分的L样品。根据先前描述的典型形态识别隐窝图1A)10. 
	注意： 它们呈圆形或椭圆形，并含有颗粒状的潘氏细胞。相比之下，绒毛为指状结构，缺乏颗粒状的潘氏细胞。图1B).</li>
	<li>将选定的组分通过40 μm细胞筛 &#181;如需获得大小相似的隐窝，可使用细胞筛。或者，如果小鼠已与EGFP-Lgr5+背景或其他可识别Lgr5+细胞的合适模型杂交，则可根据绿色荧光蛋白（GFP）通过流式细胞术分离Lgr5+干细胞2.</li>
	<li>按如下方法计数所选组分中的隐窝总数。
	<ol>
		<li>移液 50 &#181;将选定组分的 L 加入血细胞计数板，使用倒置光学显微镜（4x）计数隐窝数量。使用 48 孔板时，每孔接种约 100 个隐窝，以便进行转导实验，每个实验条件需转导 3‒6 个孔，用于基因沉默或过表达。</li>
		<li>根据每50个隐窝的数量 &#181;L，计算所需隐窝解离缓冲液体积，并将该体积转移至1.5 mL离心管中。 
		注：例如，每50个隐窝10个 &#181;L 被计数，6 x 50 &#181;L 或 300 &#181;300 个隐窝需要 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将隐窝在1.5 mL离心管中以300 x g 5分钟</li>
	<li>小心弃去上清液，用移液枪轻轻吸走上层液体，将沉淀重悬于 100 &#181;生长因子减少的基底膜基质液，置于冰上（材料表).</li>
	<li>将含有基质的隐窝接种于37 &#176;预热的48孔板（30℃） &#181;L/孔，约100个隐窝/孔）。将培养板置于标准组织培养孵育箱中孵育5–15分钟，以使基质胶凝固（37 &#176;C，5% CO₂2).</li>
	<li>每块凝胶上覆盖 250 &#181;L类器官培养（ENR）培养基（表1）并将48孔板放回标准组织培养箱（37 &#176;C，5% CO224小时后检查培养物，观察隐窝是否组织成小的、圆形的囊状结构；芽状结构将在2‒5天后形成。</li>
	<li>每隔3天轻轻更换ENR培养基。用轻柔的吸力移除旧的ENR培养基，注意更换时不要触碰基质。</li>
	<li>每4‒7天传代一次类器官培养物，方法如前所述11.</li>
</ol>
4. 类器官片段制备
<ol>
	<li>在类器官形成后（1‒2 周内）或传代后进行转导。对于单次转导实验，每种条件在 48 孔板中准备 2‒3 个孔的培养类器官，每孔约含 100‒200 个类器官，或每个实验转导条件共含 200‒600 个类器官。</li>
	<li>用 250 µL 转导培养基（表 1）替换 ENR 培养基，并在转导培养基中培养 3 天或更长时间，直至类器官呈现囊状形态。在转导培养基中加入 Wnt3a 和 ROCK 抑制剂（Y27632），以增加干细胞和潘氏细胞的数量；烟酰胺（Nic）可提高培养效率（见 表 1 中的转导培养基）。</li>
	<li>使用 1 mL 移液器及吸头，通过培养基和吹打机械性破坏类器官的圆顶状基底膜基质结构。</li>
	<li>将类器官和培养基转移至无菌的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>使用 200 µL 移液器反复吹打约 10‒15 次，进一步机械性破坏基质。</li>
	<li>在室温下以 500 × g 离心 5 分钟，收集类器官碎片。</li>
	<li>小心使用移液器弃去上清液，并将沉淀重悬于 1 mL DMEM/F12 培养基（表 1）中。</li>
	<li>加入 Dispase I（6 µL，10 mg/mL）和 DNase I（2.5 µL，10 mg/mL），用 1 mL 移液器轻轻吹打混匀。</li>
	<li>将类器官在 37 °C 下孵育 20 分钟（于 1.5 mL 离心管中）。</li>
	<li>加入 500 µL ENR 培养基以终止消化反应；ENR 中的血清可终止该反应。</li>
	<li>将类器官细胞通过 20 µm 细胞滤筛过滤，并以 400 × g 离心 5 分钟收集类器官碎片。</li>
	<li>用 150 µL 转导培养基（表 1）重悬类器官碎片。</li>
</ol>
5. 通过病毒转导对类器官或隐窝细胞进行基因工程改造
注意： 参见图2。
<ol>
	<li>在48孔板中，每孔加入200 µL转导培养基接种类器官细胞簇，并在标准组织培养孵箱（37 °C，5% CO2）中孵育。或者，在48孔板中每孔加入新鲜分离的隐窝细胞（约1,000个隐窝）和200 µL转导培养基，并在标准组织培养孵箱（37 °C，5% CO2）中孵育。</li>
	<li>解冻用于转导的病毒冻存管，每48孔板每孔使用约50 µL浓缩病毒，或每24孔板每孔使用约100 µL浓缩病毒。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中，将病毒与12 µL磁性纳米颗粒溶液在室温下孵育15分钟（表3）。</li>
	<li>将磁性纳米颗粒溶液与病毒的混合物加入待转导的细胞中。</li>
	<li>将细胞培养板置于磁板上，在标准组织培养孵箱（37 °C，5% CO2）中孵育至少2小时（最长可达约6小时）。</li>
</ol>
6. 感染后类器官片段的接种
<ol>
	<li>将每个孔中被感染的类器官细胞簇及转导培养基转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>在500 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>用轻柔抽吸法弃去上清液，并将含有沉淀的离心管置于冰上冷却5分钟。</li>
	<li>加入120 µL基底膜基质，通过缓慢吹打重悬沉淀。</li>
	<li>将基质-细胞混合物以每滴30 µL接种至新的48孔板中。</li>
	<li>将培养板置于37 °C孵育5–15分钟，直至基质凝固。</li>
	<li>向每孔加入转导培养基，并在标准组织培养孵箱中（37 °C，5% CO2）孵育3–4天。</li>
	<li>3–4天后，在光学显微镜（10倍）下观察培养物，确认细胞簇已形成类器官结构。随后，轻轻移除转导培养基，更换为250 µL ENR培养基。</li>
	<li>每3–4天更换一次培养基。</li>
</ol>
7. 筛选（如适用）
<ol>
	<li>转导后2‒3天，根据需要向转导培养基中添加相应的抗生素或激素用于筛选。 
	注意：我们使用嘌呤霉素（2 µg/mL）筛选慢病毒转导，因为质粒携带嘌呤霉素抗性基因2,14。</li>
</ol>
8. 确认转导成功及基因表达或沉默
<ol>
	<li>若使用 FUGW 慢病毒2,14，可通过荧光显微镜或流式细胞术检测 GFP 信号，以评估转导效率。</li>
	<li>使用定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）对对照组和实验组类器官培养物中的 mRNA 进行定量比较，以验证基因的过表达或沉默。</li>
	<li>通过 Western Blot 或免疫染色2检测蛋白编码基因表达或沉默后的蛋白水平，以确认结果。</li>
</ol>
9. 基底膜基质中类器官冷冻切片
注意：参见图3。
<ol>
	<li>轻轻抽吸去除 ENR 培养基，注意不要扰动基底膜基质，并用 500 µL PBS 轻柔洗涤一次。</li>
	<li>加入 1.0 mL 4% 多聚甲醛（PFA）溶液（材料表），在室温下固定类器官 30 分钟。</li>
	<li>抽吸去除 PFA，再用 1 mL PBS 轻柔洗涤两次。</li>
	<li>抽吸去除 PBS，每份样品中加入足量 30% 蔗糖缓冲液（约 300 µL/孔）。将固定的类器官置于冷室、冰箱或冰上，在 4 °C 下孵育 1 小时，以脱水样品。</li>
	<li>抽吸去除蔗糖缓冲液，每孔加入适量包埋剂（材料表），刚好覆盖基质层（约 300 µL/孔）。</li>
	<li>在室温下孵育 5 分钟。</li>
	<li>将样品置于 -80 °C 超低温冰箱中冷冻 10 分钟，或直至包埋剂变为固体且呈白色。</li>
	<li>将含有冷冻包埋剂的培养皿置于室温，使包埋剂边缘轻微融化。用手术刀将包埋块从孔壁分离。</li>
	<li>用镊子取出基质-包埋剂块，并迅速转移至样品模具（如冷冻模具）中，操作过程应迅速以防止融化。</li>
	<li>用包埋剂完全填充模具，并在 -80 °C 冷冻 30 分钟。</li>
	<li>将所得包埋块用于切片，或储存于 -80 °C 超低温冰箱中以备后续使用。</li>
</ol>

<ol><li>Cheung, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGAR+is+required+for+efficient+intestinal+regeneration+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis.</a> Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

成年肠道上皮组织的类器官原代培养为研究干细胞功能、肠道上皮稳态及病理过程中的分子机制提供了一种强有力的工具1,2,3,4。尽管CRISPR/Cas9技术可用于对类器官进行基因工程改造9，但其应用受限于必须通过测序分析对目标遗传改变进行大量筛选和筛选。本实验方案的目标是提供清晰简明的操作步骤，并辅以基于视频的教程，介绍利用磁性纳米颗粒将慢病毒或逆转录病毒递送至肠道类器官，随后进行冷冻切片以供进一步分析的方法。
本方案是一种快速高效的方法，用于对肠道类器官进行基因工程改造，并分析从冷冻切片中基因过表达或沉默的影响。图2和图3概述了关键步骤。该策略可用于研究在三维培养条...

将小鼠或人类小肠和结肠隐窝细胞在体外长期培养为三维（3D）类器官的能力是一项重大突破，因为这些培养物能够再现体内肠上皮的关键特征1,2,3。源自原代隐窝的类器官具有自我更新和自我组织的能力，表现出与其来源组织相似的细胞功能。事实上，类器官不仅重现了体内隐窝的结构组织，还保留了多种分子特征，因此为研究正常生理机制和疾病状态提供了有力的工具。例如，类器官研究已揭示了参与组织再生的新分子通路1,2,3,4,5，以及在病理条件下可能增强功能的药物靶点6,7。
肠道干细胞的研究备受关注，因为肠上皮是哺乳动物体内再生能力最强的组织之一，每3-5天即可自我更新一次，从而保护机体免受肠道腔内细菌、毒素及其他病原体的侵害。肠道干细胞（ISCs）正是介导这种强大再生能力的关键细胞，因此为研究成体干细胞功能提供了一个独特的范式1,2。在小鼠中进行的谱系示踪实验表明，分离出的Lgr5阳性干细胞可在体外培养形成三维类器官或称为“迷你肠”（mini-guts），其结构与功能高度模拟体内真实的肠道组织。此外，类器官培养也可通过分离包含前体细胞、肠道干细胞及潘氏细胞的肠隐窝细胞实现，其中潘氏细胞在体内构成上皮干细胞微环境中的关键支持细胞。事实上，利用原代肠隐窝细胞进行类器官培养已发展为一种相对常规的技术，大多数实验室均可借助广泛可得的试剂轻松实施。该模型还适用于通过RNA测序（RNA-Seq）对基因表达进行定量分析，以及通过质谱、免疫组织化学或免疫荧光染色对蛋白质进行检测2,4,8。此外，还可采用功能获得性（如基因过表达或激活型突变基因表达）或功能缺失性（如基因沉默或功能缺失型突变基因表达）策略来研究功能遗传学2。
重要的是，标准质粒DNA或使用聚凝胺（polybrene）的病毒转导方法在效率低下和毒性较高方面仍是该领域的主要障碍。尽管CRISPR/Cas9技术能够实现精确的基因组编辑，但该方法需要耗时的筛选过程，并随后进行测序验证9。本文介绍了一种用于原代肠道类器官的病毒转导方案，通过将病毒颗粒与磁性纳米颗粒偶联并施加磁场，优化了病毒颗粒的递送效率。我们提供了对先前方案4,5,10,11,12,13的关键改进以及提高转导效率的建议。此外，我们还描述了一种从在三维基质胶（matrigel，下文简称基底膜基质或基质）中培养的完整类器官制备冷冻切片的方法，以便进一步进行免疫组织化学或免疫荧光染色分析。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td>293T 细胞的基础培养基</td></tr><tr><td>DMEM/F12+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634010</td><td>类器官培养基和类器官消化缓冲液的基础培养基</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>病毒质粒转染培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td>病毒收集培养基和 293T 培养基的组分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>类器官培养基和隐窝解离缓冲液的组分</td></tr><tr><td>PBS（不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>洗涤缓冲液及隐窝解离缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Mem-NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140050</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>GlutamaxII</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9644</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 B</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>R&amp;D</td><td>7150-RS-025/CF</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>人重组胰岛素</td><td>Millipore Sigma</td><td>I9278-5ml</td><td>类器官培养基的组分</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Millipore Sigma</td><td>N3376-100G</td><td>转导培养基的组分</td></tr><tr><td>Wnt3A</td><td>R&amp;D</td><td>5036-WN-010</td><td>转导培养基的组分</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Millipore Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td>转导培养基的组分</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>隐窝解离缓冲液的组分</td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td>隐窝解离缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4818-2MG</td><td>类器官消化缓冲液的组分</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>类器官消化缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Matrigel（生长因子减少型）</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>用于包埋类器官的基质</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>病毒生产中用于转染的培养基</td></tr><tr><td>ViralMag R/L</td><td>Oz Biosciences</td><td>RL40200</td><td>病毒转导用磁性颗粒</td></tr><tr><td>磁力板</td><td>Oz Biosciences</td><td>MF10000</td><td>促进病毒转导的磁力板</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>病毒生产中的转染试剂</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>A-003-E</td><td>接种 293T 细胞前对培养板的包被处理</td></tr><tr><td>4% 甲醛溶液</td><td>Boster</td><td>AR1068</td><td>用于固定类器官的溶液</td></tr><tr><td>O.C.T. 包埋剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4583S</td><td>用于类器官的包埋</td></tr><tr><td>5 mL Falcon 聚苯乙烯管</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon 管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.100</td><td></td></tr><tr><td>Orbitron rotator II 摇床</td><td>Boekel Scientific</td><td>260250</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 倒置显微镜 CK30</td><td>Olympus</td><td>CK30</td><td>用于扫描和计数隐窝</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200 倒置荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>Axiovert 200</td><td>用于观察隐窝中的荧光</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置（含 Ultracel-100 膜）</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td>用于浓缩病毒</td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 &amp;micro;m（细胞筛）</td><td>pluriSelect</td><td>SKU 43-50020</td><td>用于制备类器官片段</td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛</td><td>Fisher Scientific</td><td>352340</td><td>用于隐窝分离后制备大小均一的隐窝</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&amp;nbsp;多孔培养板 48 孔（带盖，组织培养处理）</td><td>Millipore Sigma</td><td>M8937-100EA</td><td>用于 D2:D37+D16:D37g 类器官片段</td></tr><tr><td>动物品系：C57BL/6J</td><td>Jackson Lab</td><td>#000664</td><td>用于类器官培养</td></tr></tbody></table>

利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

肠道类器官培养为在体外研究肠道干细胞和隐窝生物学提供了独特的机会，尽管目前在类器官中调控基因表达的高效方法在此领域进展有限。虽然CRISPR/Cas9技术能够对用于类器官生成的细胞进行精确的基因组编辑，但该策略需要通过测序分析进行大量筛选和鉴定，耗时且成本高昂。本文提供了一种高效的病毒转导肠道类器官的详细实验方案。该方法快速且效率高，显著降低了CRISPR/Cas9技术所固有的时间和经济成本。我们还介绍了一种从完整类器官培养物制备冷冻切片的方案，可用于后续的免疫组织化学或免疫荧光染色分析，以验证基因表达或沉默效果。在成功实现病毒载体介导的基因表达或沉默后，可快速评估肠道干细胞和隐窝功能。尽管大多数类器官研究采用体外检测方法，但类器官也可移植至小鼠体内进行体内功能分析。此外，我们的方法在预测药物治疗反应方面具有优势，因为目前可用的治疗方法通常通过调控基因表达或蛋白质功能发挥作用，而非改变基因组。

本文介绍了一种快速且高效的转导技术，该技术利用暴露于磁场中的磁性纳米颗粒将慢病毒递送至目标细胞。借助 readily available 工具，我们不仅将该方法应用于新分离的隐窝细胞的转导（图1A），还成功用于类器官（图2）以及其他对常规转导方法不敏感的细胞类型。慢病毒颗粒可轻松与磁性纳米颗粒偶联，通过使用磁板施加磁场，病毒-纳米颗粒复合物能够被高效递送至细胞。为优化该方法，我们首先测试了携带 GFP 的慢病毒载体，以便通过荧光显微镜观察 GFP 表达来识别被转导的细胞。在类器官发育的各个阶段均可观察到 GFP 信号，包括早期隐窝细胞形成囊状结构时（图4A），以及后期类器官出芽阶段（图4B）。成功转导的肠类器官可进一步进行功能分析，通过染色细胞膜和细胞核以计数总细胞数，并结合谱系标记物（如溶菌酶用于鉴定潘氏细胞）分析发育过程中的变化（<...

我们详细描述了以下操作步骤：1）利用磁性纳米颗粒高效构建用于慢病毒或逆转录病毒转导的肠道类器官；2）对经基因工程改造的类器官制备冷冻切片。该方法为高效调控类器官中的基因表达以研究其下游效应提供了有力工具。

肠道类器官培养为在体外研究肠道干细胞和隐窝生物学提供了独特的机会，尽管目前尚缺乏高效的……

由于类器官能够重现肠道上皮在体内的天然结构组织以及许多分子特征，该技术使我们能够在实验室中研究正常的生物学过程及疾病状态。该技术的主要优势在于能够利用一种高效且细胞毒性低的转导方法对类器官进行基因工程改造，从而实现对这些基因修饰类器官的功能研究。该技术的应用前景可延伸至肠道疾病的治疗，因为我们能够将肠道类器官暴露于药物或其他试剂或干预措施中。该方法可应用于研究其他适用于类器官培养体系的发育和病理过程，例如乳腺组织，或在标准二维条件下培养的细胞。通常情况下，初次使用该方法的研究人员也能成功实现难以转导的类器官或其他细胞的转导。我们最初提出该方法的构想，源于在转导类器官和干细胞时遇到了困难。该方法的可视化演示至关重要，因为在类器官包埋于基底膜基质进行冷冻切片的过程中，若样品处理不当，可能导致类器官结构的丧失。为了进行病毒转导而培养类器官，需将类器官细胞以每孔200 µL转导培养基接种至48孔板中，并在标准组织培养孵育箱中孵育。解冻用于转导的病毒冻存管，每孔（48孔板）转导需准备约50 µL浓缩病毒。在1.5毫升离心管中，将病毒与12 µL磁性纳米颗粒溶液混合，在室温下孵育15分钟。15分钟后，将磁性纳米颗粒溶液与病毒的混合物加入待转导的细胞中。将48孔板置于磁板上，在标准组织培养孵育箱中孵育至少2小时。病毒转染完成后，将每个孔中被感染的类器官细胞簇及转导培养基转移至1.5毫升离心管中。在500 × g条件下离心5分钟。用轻柔抽吸法弃去上清液，并将含有细胞沉淀的离心管置于冰上冷却5分钟。向每管中加入 120 微升基底膜基质，通过缓慢吹打重悬沉淀。将 30 微升基质-细胞混合物滴加至新的 48 孔板中。于 37 摄氏度孵育 5 至 15 分钟，直至基质凝固。向每个孔中加入转导培养基，在标准组织培养孵育箱中孵育三至四天。三至四天后，在10倍放大倍数的光学显微镜下观察培养物，以确认细胞簇已有序形成类器官结构。轻轻将每孔中的转导培养基更换为250 µL类器官培养ENR培养基。将培养板放回培养箱。首先用轻柔的抽吸法去除ENR培养基，注意不要扰动基底膜基质。用500微升PBS轻轻洗涤。通过向每孔加入一微升4%多聚甲醛溶液固定类器官，并在室温下孵育30分钟。30分钟后，用吸液法去除多聚甲醛溶液。每孔轻轻加入一微升PBS，然后用轻柔的吸液法去除PBS。以这种方式，用 PBS 洗涤两次。弃去第二次洗涤的 PBS，并向每个样本中加入一微升 30% 蔗糖缓冲液。将固定的类器官在蔗糖溶液中于 4°C 孵育一小时，以对样本进行脱水。用吸管吸去蔗糖缓冲液，每孔中加入足量包埋剂以覆盖基质层。室温孵育5分钟。随后，将样品置于-80摄氏度冰箱中10分钟，或直至包埋剂变为固体且呈白色。将含有冷冻包埋剂的载板置于室温下，使包埋剂边缘轻微融化。使用解剖刀或刮匙将组织块从孔壁上分离。操作需迅速，以防包埋剂融化，用镊子取出基质包埋的组织块，并将其放入样品模具中。用包埋剂完全填充模具。在使用组织块进行切片前，于负80摄氏度冷冻30分钟。本实验方案经过优化，首先使用与GFP连接的慢病毒载体转导肠道类器官。在类器官发育的各个阶段均对GFP进行了可视化观察，包括早期隐窝细胞组织形成囊状结构时，以及后期类器官形成芽状结构时。成功转导的肠类器官随后经甲醛固定、冷冻切片，并通过免疫荧光成像进行分析。在此图像中，细胞核染成蓝色，绿色表示上皮细胞黏附分子，用于标记细胞边界。红色表示溶酶体染色，用于鉴定潘氏细胞。掌握该技术后，类器官转导操作约需三小时完成，类器官冷冻切片包埋约需两个半小时完成。进行该操作时，需注意在处理基底膜基质试剂时应始终在冰上操作。完成此操作后，可进行免疫荧光分析及其他检测蛋白质或细胞器的方法，以评估其定位或相对丰度。该技术为研究人员探索正常生物学过程及疾病状态提供了途径，既可用于体外研究，也可用于体内研究——前提是转导后的类器官或细胞可被移植到小鼠体内。观看本视频后，您应充分理解如何使用磁标记病毒对类器官进行遗传工程改造以用于冷冻切片。请注意，操作病毒可能具有极高的危险性，进行本实验时应始终采取预防措施，例如穿戴适当的防护装备。

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科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用磁纳米粒子转导病毒载体进行冷冻切片的原小鼠肠道器官的遗传工程

本文及随附视频介绍了我们利用类器官单元-支架法在小鼠中生成组织工程化肠道的实验方案。...

小鼠模型中肠道的组织工程

来源：Van Lidth de Jeude, J. F., 等. 肠类器官慢病毒转导及下游分析方案. J. Vis. Exp.

用于免疫组织化学分析的慢病毒转导小鼠肠道类器官的处理

本文描述了一种建立原代小鼠结肠肿瘤类器官的简单方法。该方法利用了结肠肿瘤细胞能够在含有有限生长因子的培养基中存活并生长成类器官，而正常结肠上皮细胞则不能的特性。...

体外 原代小鼠结肠肿瘤类器官培养

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原代肠道类器官培养中逆转录病毒感染的视频方案

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

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该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

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利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

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小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

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从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

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利用磁性纳米颗粒转导病毒载体对原代小鼠肠道类器官进行遗传工程改造以用于冰冻切片

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