Name: 人精切肺切片中物质的细胞毒性及免疫调节作用的评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学习使用人精切肺切片三维模型评估细胞毒性及免疫调节作用的方法。该技术利用新鲜人体肺组织模拟呼吸系统疾病，为药理学和毒理学研究提供可靠的体外评估平台。

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我们感谢Lan Lauenstein在利用人肺切片（PCLS）进行风险评估的替代测试策略方面所做的前期工作。部分研究得到了欧洲委员会第六框架计划项目的资助。th 框架计划SENS-IT-IV“新型测试策略” 体外 过敏原评估

<ol><li>D'Amato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change%2C+air+pollution+and+extreme+events+leading+to+increasing+prevalence+of+allergic+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Multidiscip+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Climate change, air pollution and extreme events leading to increasing prevalence of allergic respiratory diseases.</a> Multidiscip Respir Med. 8 (1), 12(2013).</li>
<li>Pawankar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+world+allergy+report+2008%3A+allergy+and+chronic+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Allergy+Organ+J%22%5BJournal%5D)">State of world allergy report 2008: allergy and chronic respiratory diseases.</a> World Allergy Organ J. 1 (6), Suppl 4-17 (2008).</li>
<li>Hartung, T., Daston, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+in+vitro+tests+suitable+for+regulatory+use%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Are in vitro tests suitable for regulatory use.</a> Toxicol Sci. 111 (2), 233-237 (2009).</li>
<li>Hartung, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19587762">Toxicology for the twenty-first century.</a> Nature. 460 (7252), 208-212 (2009).</li>
<li>Balls, M., Straughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Rs+of+Russell+%26+Burch+and+the+testing+of+biological+products%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol+Stand%22%5BJournal%5D)">The three Rs of Russell & Burch and the testing of biological products.</a> Dev Biol Stand. 86, 11-18 (1996).</li>
<li>Sewald, K., Braun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunotoxicity+using+precision-cut+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Xenobiotica%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunotoxicity using precision-cut tissue slices.</a> Xenobiotica. 43 (1), 84-97 (2013).</li>
<li>Fisher, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+human+lung+slices+in+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Exp+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The use of human lung slices in toxicology.</a> Hum Exp Toxicol. 13 (7), 466-471 (1994).</li>
<li>Ressmeyer, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+guinea+pig+precision-cut+lung+slices%3A+comparison+with+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Characterisation of guinea pig precision-cut lung slices: comparison with human tissues.</a> Eur Respir J. 28 (3), 603-611 (2006).</li>
<li>Donovan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosiglitazone+elicits+in+vitro+relaxation+in+airways+and+precision+cut+lung+slices+from+a+mouse+model+of+chronic+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rosiglitazone elicits in vitro relaxation in airways and precision cut lung slices from a mouse model of chronic allergic airways disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 309 (10), 1219-1228 (2015).</li>
<li>Koziol-White, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+spleen+tyrosine+kinase+attenuates+IgE-mediated+airway+contraction+and+mediator+release+in+human+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of spleen tyrosine kinase attenuates IgE-mediated airway contraction and mediator release in human precision cut lung slices.</a> British journal of pharmacology. 173 (21), 3080-3087 (2016).</li>
<li>Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videomorphometric+analysis+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-pulmonary+arteries+using+murine+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices.</a> J Vis Exp. (83), e50970(2014).</li>
<li>Lamb, D. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27048659">Bl 1002494, a Novel Potent and Selective Oral Spleen Tyrosine Kinase Inhibitor, Displays Differential Potency in Human Basophils and B Cells.</a> J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 554-561 (2016).</li>
<li>Leus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC+3-selective+inhibitor+RGFP966+demonstrates+anti-inflammatory+properties+in+RAW+264.7+macrophages+and+mouse+precision-cut+lung+slices+by+attenuating+NF-kappaB+p65+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-kappaB p65 transcriptional activity.</a> Biochem Pharmacol. 108, 58-74 (2016).</li>
<li>Schleputz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurally+mediated+airway+constriction+in+human+and+other+species%3A+a+comparative+study+using+precision-cut+lung+slices+%28PCLS%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Neurally mediated airway constriction in human and other species: a comparative study using precision-cut lung slices (PCLS).</a> PLoS One. 7 (10), 47344(2012).</li>
<li>Hess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalidation+of+the+ex-vivo+model+PCLS+for+prediction+of+respiratory+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Prevalidation of the ex-vivo model PCLS for prediction of respiratory toxicity.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 32, 347-361 (2016).</li>
<li>Bergner, A., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine-induced+calcium+signaling+and+contraction+of+airway+smooth+muscle+cells+in+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine-induced calcium signaling and contraction of airway smooth muscle cells in lung slices.</a> J Gen Physiol. 119 (2), 187-198 (2002).</li>
<li>Wohlsen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+allergic+response+in+small+airways+of+human+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">The early allergic response in small airways of human precision-cut lung slices.</a> Eur Respir J. 21 (6), 1024-1032 (2003).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+response+to+H3N2+and+H1N1+influenza+virus+infection+in+a+human+lung+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Innate immune response to H3N2 and H1N1 influenza virus infection in a human lung organ culture model.</a> Virology. 396 (2), 178-188 (2010).</li>
<li>Zmora, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-human+primate+orthologues+of+TMPRSS2+cleave+and+activate+the+influenza+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin.</a> PLoS One. 12 (5), 0176597(2017).</li>
<li>Rosner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+contractility+in+the+precision-cut+lung+slice+after+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway contractility in the precision-cut lung slice after cryopreservation.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (5), 876-881 (2014).</li>
<li>Lauenstein, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunotoxicity+induced+by+chemicals+in+human+precision-cut+lung+slices+%28PCLS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunotoxicity induced by chemicals in human precision-cut lung slices (PCLS).</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 28 (4), 588-599 (2014).</li>
<li>Wild, L. G., Lopez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+asthma+caused+by+high-molecular-weight+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Allergy+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Occupational asthma caused by high-molecular-weight substances.</a> Immunol Allergy Clin North Am. 23 (2), 235-250 (2003).</li>
<li>Di Stefano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+asthma+due+to+low+molecular+weight+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopathol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Occupational asthma due to low molecular weight agents.</a> Int J Immunopathol Pharmacol. 17 (2), Suppl 77-82 (2004).</li>
<li>Buonsante, V. A., Muilerman, H., Santos, T., Robinson, C., Tweedale, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+assessment%27s+insensitive+toxicity+testing+may+cause+it+to+fail%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Risk assessment's insensitive toxicity testing may cause it to fail.</a> Environ Res. 135, 139-147 (2014).</li>
<li>Boverhof, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+sensitization+and+allergy%3A+current+research+approaches+and+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Respiratory sensitization and allergy: current research approaches and needs.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 226 (1), 1-13 (2008).</li>
<li>Johansson, H., Albrekt, A. S., Borrebaeck, C. A., Lindstedt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GARD+assay+for+assessment+of+chemical+skin+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro+%3A+an+international+journal+published+in+association+with+BIBRA%22%5BJournal%5D)">The GARD assay for assessment of chemical skin sensitizers.</a> Toxicology in vitro : an international journal published in association with BIBRA. 27 (3), 1163-1169 (2013).</li>
<li>Brismar, H., Patwardhan, A., Jaremko, G., Nyengaard, J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2818.1996.tb00005.x/full">Thickness estimation of fluorescent sections using a CSLM.</a> Journal of Microscopy. 184 (2), 106-116 (1996).</li>
<li>Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision-cut+Mouse+Lung+Slices+to+Visualize+Live+Pulmonary+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li>
<li>Switalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+innate+cytokine+response+to+immunomodulators+and+adjuvants+in+human+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Natural innate cytokine response to immunomodulators and adjuvants in human precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 246 (3), 107-115 (2010).</li>
<li>Henjakovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+testing+of+immune+responses+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Niehof, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+isolation+from+precision-cut+lung+slices+%28PCLS%29+from+different+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">RNA isolation from precision-cut lung slices (PCLS) from different species.</a> BMC Res Notes. 10 (1), 121(2017).</li>
<li>De Proost, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+signaling+in+the+pulmonary+neuroepithelial+body+microenvironment+unraveled+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Purinergic signaling in the pulmonary neuroepithelial body microenvironment unraveled by live cell imaging.</a> FASEB J. 23 (4), 1153-1160 (2009).</li>
<li>Davidovich, N., Chhour, P., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+of+Remnant+Human+Lung+Tissue+for+Mechanical+Stretch+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Uses of Remnant Human Lung Tissue for Mechanical Stretch Studies.</a> Cell Mol Bioeng. 6 (2), 175-182 (2013).</li>
<li>Watson, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+Chemical+Toxicity+Using+Cryopreserved+Precision+Cut+Lung+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Screening for Chemical Toxicity Using Cryopreserved Precision Cut Lung Slices.</a> Toxicol Sci. 150 (1), 225-233 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。弗劳恩霍夫 ITEM 是一家独立的公立非营利性应用研究机构，代表生物技术、制药、化工和化妆品行业开展合同研究。该机构的资金来源于国家级和国际级公共项目。

人类肺组织离体切片（PCLS）技术在我们实验室已得到广泛应用。本文详细描述了该技术及其在肺组织中进行物质毒性测试的应用。 离体通常情况下，任何使用该技术的实验室都应建立与检测方法相关的可定量范围定义、变异度估计以及质量控制措施，以确保实验的有效性。可能的标准操作程序包括，例如，对每个终点指标进行重复检测， 例如细胞毒性检测应至少使用三位不同生物供体样本（独立实验）进行，每一样本至少设置两到三个技术重复，并包括阳性和阴性对照。实验室操作人员应接受培训，以提高检测的一致性并尽量减少实验变异。
常用于评估物质对肺组织免疫调节作用的终点指标包括使用不同检测方法测定的细胞毒性（例如，LDH 检测、WST-1 检测、显微镜染色检测）、细胞因子释放检测，以及通过免疫组织病理学方法分析基因表达谱的变化和细胞群体的表征6。此外，已有技术可用于可视化小鼠PCLS中的细胞（如肺树突状细胞）28，这些技术也可应用于人源PCLS，从而可能在给予潜在细胞毒性物质处理前后，更深入地了解细胞组成的改变。
本制备人肺组织切片的基本方案与技术，与其他文献中已有详尽描述的方法类似29。简而言之，器官组织来源于患有危及生命的慢性疾病（如肺癌）并需接受切除或移植手术的患者。相关研究必须经当地伦理委员会批准，并需获得患者的知情书面同意。建立临床与实验室之间的标准工作流程至关重要，这需要双方在沟通、接口定义及基础设施方面进行协调。人肺组织在切除后必须立即处理，以保持组织的活性。值得注意的是，本文所述的人肺组织切片（PCLS）制备技术适用于年轻和年老的肺组织，也适用于健康和病变的肺组织。例如，在美国，可以从因意外死亡或器官不适用于移植的健康器官捐献者处获取肺组织。
实验方案中的第一个关键步骤是用琼脂糖溶液充胀气道及其周围的肺实质。此步骤对于固化极为柔软的组织以进行后续切片至关重要。人肺组织的质量，尤其是其疾病背景，在此环节尤为关键。只有胸膜完整的肺叶才能成功充胀。靠近支气管的终末期肿瘤有时会阻碍充胀过程。在对人肺组织进行充胀前，必须仔细检查琼脂糖溶液的温度。人肺组织内若含有过多血液（或其他液体、渗出物），会导致琼脂糖被非预期稀释，从而影响其聚合过程。肺组织充胀后置于冰上使琼脂糖凝胶化，随后将肺组织切成200至300 µm厚度的切片。组织的一致性是一个极为关键的问题。若组织过软，则难以切出厚度均一的切片。即使为每位供体设置相同的切片机参数，由于个体差异以及每例肺组织在充胀过程中的变化，不同供体之间的切片厚度仍可能存在差异。组织充胀不均将导致切片厚度不一致。除直接测量并标准化切片厚度外，还可通过测定总蛋白含量间接监测肺切片的厚度。多种终末期肺部疾病会妨碍切片过程。 例如在肺动脉高压中，血管壁会显著增厚，且纤维化组织可能极为僵硬，导致组织圆柱难以切片，需频繁更换切片刀。
在制备人肺组织切片（PCLS）并进行充分的洗涤步骤以去除细胞碎片和释放的酶后，组织切片即可用于实验29。人PCLS在常规细胞培养条件下进行培养，并可暴露于化学物质、药物或脂多糖等刺激物。由于（未知）感染导致的PCLS偶尔污染，是人肺组织材料培养中的一个特殊问题。显示感染迹象的组织培养物必须丢弃，且相关设备必须彻底消毒。将用于制备和培养的实验区域进行空间分离，有助于避免交叉污染。在设备方面，切片机可能泄漏，松动的六角螺丝可能导致电机损坏并使刀片运动停止。并非切片机的所有部件均由不锈钢制成，因此若清洁后未立即干燥，将发生氧化。为应对设备故障问题，建议至少配备一台备用设备。
在以往的文献中，有报道称琼脂糖在制备后的强化洗涤步骤中可被洗脱并去除。事实上，这是不可能的，琼脂糖无法被去除。若要完全去除琼脂糖，需在高温下重新熔化，但这会破坏组织。存在于肺泡和气道中的琼脂糖不会干扰本文所述的检测终点。然而，其他检测终点可能会受到琼脂糖存在的影响（参见局限性部分）。必须强调制备非常新鲜的组织切片的重要性，因为组织活性在培养过程中是一个关键问题。支气管收缩不是一个有效的活性评估参数。我们建议至少使用两种或三种独立的细胞毒性检测方法来评估周围肺实质的活性；每次实验都必须进行此项检查30。细胞毒性检测中的质量控制可作为组织活性不足的指标。因此，建议在所有细胞毒性检测中评估组织对有效毒性物质（例如洗涤剂）的反应性。根据剂量-反应曲线，应为细胞毒性检测设定吸收值的最小值和最大值，并在后续实验中满足这些标准。对本方案的进一步修改主要取决于所用化学物质和关注的检测终点。不溶性或高反应性化学物质的应用受到限制。DMSO的最高溶剂浓度限制为1%。虽然可以使用更高浓度，但可能导致促炎性细胞因子（如IL-8）的显著释放。另一方面，所用刺激物可能相对较弱。在此情况下，可将每孔组织量从两片增加至四片。该方法将组织活性限制在24小时以内。
人源肺组织切片（PCLS）的一个主要局限性在于，在德国只能使用病变的人肺组织来制备。接受手术的患者通常年龄超过50岁，且80%的肺癌患者目前或曾经有吸烟史。患者的用药情况（如糖皮质激素）也可能影响使用人组织进行实验的结果。因此，必须做到以下两点：i) 通过阳性对照验证每次实验，以确认个体组织的活性、功能性和敏感性；ii) 使用来自实验动物的健康、非病变、中年肺组织进行交叉验证（非人灵长类动物如食蟹猴，以及可能情况下使用小鼠、大鼠、豚鼠）。病变组织的病理评分越高，实验结果通常越好。严重病变的组织几乎无法使用，且常常表现出有限的活性、细胞因子水平过低或过高、细菌或真菌感染，以及支气管收缩能力减弱。与实验动物获得的结果相比，供体之间的个体差异更大，这反映了人类个体间的自然变异性。然而，这通常并不构成普遍性限制；如上所述，在其他国家（例如，美国），可以从因不适合移植而被拒绝使用的已故器官捐献者身上获取健康的肺组织。在急性暴露实验中，组织的反应性在最初48小时内已有充分描述。经过多天培养或在-80 °C下储存后，组织的活性和功能性会下降。人肺组织最多可培养约14天。在此期间组织仍保持活性；然而，变异性增加，且组织中多种细胞群体（如巨噬细胞）的功能逐渐丧失，导致对有丝分裂原刺激的细胞因子释放能力受限。对于某些检测终点而言，另一个限制因素是组织中存在琼脂糖，这会阻碍高质量且足量RNA的提取31，或妨碍制备单细胞悬液用于后续的流式细胞术分析和细胞表型鉴定。因此，深入探究单个细胞反应及其功能机制的可能性受到限制。
器官型组织模型（如人肺切片PCLS）在基础研究和非临床研究中具有重要意义。人肺组织具有接近正常器官结构的生物学组成，包含肺泡和支气管上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经纤维以及巨噬细胞等固有细胞类型。该组织具有良好的活性，细胞可对多种刺激产生反应。尽管神经纤维已被切断，但仍可在局部被激活，从而引发末端反射性反应14因此，这 离体 该模型可用于研究细胞的先天免疫反应、防御反应、细胞因子信号传导以及细胞表面标志物的诱导。技术、培养方法和终点验证方面的多项改进，使得人肺组织切片（PCLS）可应用于转化医学研究。未来的研究方向示例包括：i）在人肺组织中验证新靶点；ii）评估暴露于化学物质、药物、纳米颗粒等后的免疫反应。 等等。，iii）向肺组织补充免疫细胞，例如T淋巴细胞，iv）分子模式的鉴定与修饰，例如在接触呼吸道致敏物、致病物质或通路抑制性活性化合物后；此外，v）气道重塑以及vi）神经调节32科学界对PCLS的当前及未来应用方法颇感兴趣。此外，还有多种不同的技术发展将有助于改进PCLS技术，例如冷冻保存20，以及组织拉伸33 以模拟呼吸或机械通气过程中组织的自然运动。
与其它三维模型相比，人肺组织切片（PCLS）的主要优势在于其含有免疫细胞和神经纤维。实验也可在小鼠、大鼠和非人灵长类动物中进行，这些动物物种目前在药理学和毒理学研究中仍最为常用。人肺组织的复杂性有助于将动物实验结果外推至人体，以及将体外（in vitro）结果转化为体内（in vivo）情况。在现有用于识别呼吸道致敏原的替代检测方法中，人PCLS模型具有高度复杂性，但尚无法提供对单个细胞反应的深入洞察。然而，若结合适当的细胞标志物，例如凋亡、坏死或细胞内标志物，显微镜技术和流式细胞术可能提供有关细胞反应的信息。已有发表的检测方法经过验证并被报道用于呼吸道致敏原的识别。然而，PCLS技术相较于单细胞检测具有诸多优势，其应用进展正作出重要贡献，例如如Watson et al.34所述，该技术可用于高通量筛选。他们开发了一种高通量筛选方法，用于预测小鼠冷冻保存PCLS中的气道毒性。通过微型化的96孔PCLS体系，他们在小鼠灌洗液中检测到类似的结果，表明PCLS是一种可行的高通量检测模型。

过敏性哮喘、职业性哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、肺气肿以及上下呼吸道感染等呼吸系统疾病的发病率不断上升，已成为全球性的健康负担1,2合适的测试系统对于揭示这些疾病背后的一些基本机制，以及相关物质的开发与测试至关重要。基础研究和临床前药物开发均以这些研究获得的结果为重点。 体外 或 体内 检测方法。然而，这些检测方法存在其局限性3首先， 体外 实验采用从邻近组织或器官中分离并移除的人类细胞，因此这些细胞无法再与其他细胞相互作用或受到其保护3其次，由于生理学差异和生物化学上的分歧，动物模型往往难以转化为人类应用4为了尽量减少这些局限性，并遵循“3R原则”（替代、优化、减少）5新的替代模型正在不断演变。
类器官等替代性人类三维组织模型（如PCLS）是连接基于人类的体外（in vitro）模型与复杂的动物体内（in vivo）模型之间的桥梁。PCLS能够反映呼吸道中所有相关细胞类型的生理异质性6。此外，PCLS技术具有可重复制备的优点，即从单个动物或人类组织供体中可获得多个厚度精确的薄片，从而可设置内部对照，并用于测试不同浓度或不同药物。
自1994年Fisher首次引入琼脂灌注的人肺组织切片以来 等7 肺组织切片与培养技术已得到显著改进。Christian Martin 等 已改进该技术以拓展其在化学和药理学领域的应用8我们课题组于2007年经Christian Martin介绍接触到该技术。此后，PCLS在研究中的应用范围已从检测功能反应（如气道）等方面逐步拓展9,10 和血管收缩11，到免疫学、药理学12,13，以及毒理学的7 在多个实验室对不同物种进行测试。例如，Schlepütz 等14 研究了不同物种在气道反应上的差异，并比较了小鼠、大鼠、豚鼠、绵羊、狨猴和人类中通过电场刺激（EFS）或辣椒素诱导的外周神经元激活。他们发现各物种在神经介导的支气管收缩方面具有不同且特异的模式，得出结论认为常用实验动物（小鼠和大鼠）并不总能反映人类的反应。对于肺毒性测试以及在此背景下减少动物使用数量，Hess 等15 经预验证的大鼠PCLS作为一种 离体 吸入毒性研究的替代方法。这项多中心预验证研究利用PCLS开发了两种预测模型，结果令人鼓舞。
此外，在基础研究中，PCLS 已被用于阐明钙信号传导16、早期过敏反应17以及病毒感染反应18,19。技术进步正在持续进行，更多改进也正在探索中。例如，该领域正通过冷冻保存和重复利用组织来提高人体组织的使用价值。Rosner et al. 描述了一种冻融小鼠 PCLS 的技术，该技术可保留气道在受到刺激时的收缩能力，从而延长组织保持活性的有限时间窗口，使得对同一供体的组织可在不同时间点进行更多的检测20。除了这些研究进展外，Lauenstein et al.21&#160;最近还利用人源 PCLS 研究了多种可能引起职业性哮喘的潜在致敏化学品的风险评估。
职业性哮喘的症状表现为气流阻塞和气道高反应性，与过敏性哮喘相似，是由工作环境中暴露于高分子量（HMW）22或低分子量（LMW）物质23（例如，铂化合物）所诱发的。低分子量致敏物在形成半抗原并与载体蛋白结合时具有较高的致敏潜力21。对于新注册的高分子量或低分子量化学品，需要进行体外（in vitro）和体内（in vivo）风险评估，以判断其潜在的致敏性（例如，OECD 指南 429）24。然而，目前用于评估潜在致敏性的检测方法最初并非为呼吸道致敏物的风险评估而设计，而是针对接触性致敏物开发的，尽管对少数物质可能存在一定程度的一致性25。Lauenstein 等的研究是欧盟项目Sens-it-iv的一部分，旨在为潜在接触性或肺部致敏物的风险评估开发替代性测试策略21。在本项目中，我们重点关注评估人肺切片（PCLS）作为替代性测试工具的可用性。因此，我们选择了一系列免疫调节终点指标（例如，细胞活力和细胞因子分泌），用于测定化学品（如低分子量铂化合物）的刺激性或炎症潜力。Lauenstein 等并未发现适用于所有呼吸道致敏物的普遍规律；但他们的研究为近期发布的实验方案奠定了基础26。
综上所述，本文所述的人肺组织切片（PCLS）制备及其后续暴露的实验方案，为评估可能参与呼吸系统疾病（如职业性哮喘）发生发展的潜在肺毒性物质和/或免疫调节物质提供了一种有效的方法。

<table><tbody><tr><td>硅胶管 3.0 × 5.0 mm</td><td>A. Hartenstein (Leipzig, Germany)</td><td>SS04</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Faust Lab Science (Klettgau, Germany)</td><td>9.410 050</td><td></td></tr><tr><td>取芯工具</td><td>定制</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>修整刀片手柄（FEATHER）</td><td>pfm medical ag&amp;nbsp; (Cologne, Germany)</td><td>205530001</td><td></td></tr><tr><td>修整刀片（FEATHER）</td><td>pfm medical ag&amp;nbsp; (Cologne, Germany)</td><td>205500000</td><td></td></tr><tr><td>切片机：组织切片器</td><td>Alabama R&amp;D (Bad Homburg, Germany)</td><td>303400-ADPT</td><td>Krumdieck 组织切片器 (MD6000)</td></tr><tr><td>切片机刀片</td><td>Wilkinson Sword (Solingen, Germany)</td><td>ENR-4027800011506</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿</td><td>Sigma (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>Z666246-420EA</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛滤器（100 &amp;micro;m 尼龙）</td><td>Becton Dickinson (Heidelberg, Germany)</td><td>BD352360</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Copan Diagnostics (Murrieta, USA)</td><td>&amp;nbsp;CD176S01</td><td></td></tr><tr><td>TPP 组织培养板 24 孔</td><td>Sigma (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>Z707791-126EA</td><td></td></tr><tr><td>包埋盒</td><td>Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 平底板</td><td>Fisher Scientific GmbH (Hannover, Germany)</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 孔板&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td><td>260836</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss (Jena, Germany)</td><td></td><td>Confocal LSM Meta 510</td></tr><tr><td>图像渲染软件</td><td>Bitplane AG (Z&amp;uuml;rich, Switzerland)</td><td></td><td>IMARIS 7.6</td></tr><tr><td>LSM 图像浏览器</td><td>Zeiss (Jena, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多孔板读数仪</td><td>Tecan Group Ltd. (M&amp;auml;nnedorf, Switzerland)</td><td>Tecan infinite F200Pro</td><td>酶标仪</td></tr><tr><td>微孔板振荡器</td><td>Edmund Buehler GmbH (Hechingen, Germany)</td><td>KM-2 Akku</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ULTRA</td><td>Ventana Medical Systems (Tucson, USA)</td><td></td><td>全自动免疫组化/原位杂交染色系统</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;检测试剂盒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞增殖试剂 WST-1</td><td>Roche (Basel, Switzerland)</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>细胞毒性检测试剂盒（LDH）</td><td>Roche (Basel, Switzerland)</td><td>11644793001</td><td></td></tr><tr><td>显微活力染色试剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen (Carlsbad, USA)</td><td>L-3224</td><td>LIVE/DEAD 活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量测定</td><td>Thermo Scientific (Schwerte, Germany)</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 检测试剂盒</td><td>R &amp; D systems</td><td>多种，例如 DY210 (TNF-&amp;alpha;) 或 DY200 (IL-1&amp;alpha;)</td><td>DuoSet</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>A9414-100G</td><td></td></tr><tr><td>平衡盐混合物与溶液、细胞培养、经典培养基与盐类、Earle&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（EBSS）</td><td>Sigma (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>E2888-500ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Lonza (Verviers, Belgium)</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s 改良 Eagle&amp;acute;s 培养基 F-12 Ham 营养混合物（DMEM F-12）</td><td>Gibco (Darmstadt, Germany)</td><td>11039-047</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s 磷酸盐缓冲液（含 Ca 和 Mg）（DPBS）</td><td>Lonza (Verviers, Belgium)</td><td>BE17-513F&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma (M&amp;uuml;nchen, Germany)</td><td>A9647-500G</td><td></td></tr><tr><td>去垢剂</td><td>Sigma (Saint Louis, USA)</td><td>X100-100ML</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液</td><td>Merck (Darmstadt Germany)</td><td>524653</td><td>&amp;nbsp;PBS 中含 0.05% Tween 20</td></tr></tbody></table>

人源肺组织精准切割切片中物质细胞毒性和免疫调节效应的评估

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

呼吸系统疾病种类繁多，需要合适的模型系统来理解其潜在机制，并推动新疗法的开发。此外，新物质的注册需要通过适当的测试系统进行充分的风险评估，以避免个体在工作环境等场景中受到伤害。此类风险评估通常通过动物实验进行。鉴于“3R原则”以及公众对动物实验的质疑，人类替代方法（如精准切割肺组织片，PCLS）正在不断发展。本文介绍了一种用于研究小分子物质（如六氯铂酸铵，HClPt）免疫调节潜力的人源PCLS离体（ex vivo）技术。检测指标包括组织活性以及以细胞因子和趋化因子分泌改变为标志的局部呼吸道炎症反应。在暴露于亚毒性浓度的HClPt后，人源PCLS中促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1α（IL-1α）水平显著升高。尽管PCLS技术在过去几十年中已得到显著优化，但其在免疫调节测试中的应用仍处于发展阶段。因此，尽管本文结果展示了人源PCLS作为呼吸系统研究有力工具的潜力，但这些结果仍属初步。

本研究方法中，制备人肺组织切片（PCLS），并将其暴露于五种浓度的工业物质中，以评估化学物质对人肺组织免疫调节效应的影响。肺组织在浸没条件下进行持续培养，暴露时间为24小时。通过检测乳酸脱氢酶（LDH）释放量、线粒体活性及显微镜下活度染色来评估毒性。此外，还检测了用于归一化的总蛋白含量及促炎性细胞因子水平。在可能的情况下，采用非线性S型曲线拟合计算抑制浓度（IC）75值。每次实验均采用细胞毒性阳性对照物（去污剂）和先天性细胞因子反应阳性对照物（LPS）进行验证。将经对数转换后的IC75 [µM] 值（log IC50）作为后续细胞因子释放检测的“刺激性”浓度使用。
图1 和 图2 展示了填充人肺组织材料的流程以及人肺组织切片（PCLS）的典型H&amp;E染色结果。必须遵循常规卫生操作规程，以避免对健康造成不良影响，并确保处理人肺组织材料的工作人员安全。该技术需要经过人员培训并积累实践经验。需要有经验的病理学家来区分不同区域（上叶/下叶、胸膜下区与更靠近中央的区域）以及病变区域与健康区域，以评估人肺组织材料的病理状态。所制备的人肺组织切片应用于制备H&amp;E染色的薄切片，以便病理学家重新评估。该流程有助于使用者练习并提高区分肺组织内不同病变区域和位置的能力。
图3 展示了人肺切片（PCLS）在含SLS的培养基中孵育24小时后LDH与WST-1活性的检测结果。未处理的空白对照组（不含SLS）显示于 0 µg/mL SLS 是一项重要的质量控制指标。与去垢剂裂解组织相比，LDH 的数值应低于 20%。 &gt;WST-1 检测中为 0.7 吸光度单位。这些质量控制指标也可用于提示组织活力不足。必须将人组织对作为有效毒性物质的洗涤剂溶液的反应性作为阳性对照，其结果应表现为增加 300 - 500%。&gt;2.0 吸光度单位）的LDH，与未经处理的组织相比，其数值 &lt;0.1 个吸光度单位用于 WST-1 检测。SLS 在 WST-1 检测中表现为代谢活性降低，同时 LDH 升高，表明细胞活力呈浓度依赖性下降 &gt;87 µg/mL采用 S 形浓度-反应模型对数据进行拟合，以便计算 IC75 或 IC50 值。这些数值可用于后续选择用于检测细胞因子和趋化因子水平的浓度：在高毒性浓度下，通常无法检测到细胞因子和趋化因子，或其水平显著降低。因此，建议选用无毒或仅轻度毒性的浓度（IC75）。需特别注意的是，细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性的预期升高常受到所用物质的影响21干扰物质常常会影响酶活性，如果仅使用LDH检测作为细胞毒性实验，可能导致结果误读。因此，进行多种细胞毒性检测以获得可靠且有效的结果至关重要。此外，需要指出的是，LDH检测与WST-1检测的敏感性高度相似。
在图4中，肺组织切片（PCLS）的显微存活率图像显示了人肺组织对洗涤剂这一有效毒性物质的反应性。这些结果对于验证其他存活率数据非常有用，但需要额外的设备支持。通过评估钙黄绿素阳性组织与碘化乙啶-1（EthD-1）阳性细胞核的比例，可对毒性效应进行直观判断。通常选择肺实质内随机区域可获得可比数据，而应避免选择气道或血管区域，因为较大的腔隙可能影响结果准确性。根据我们的经验并结合上述显微镜设置，对照组织的平均体积测量值介于1.5 × 106 至 5 × 106 µm3之间。该数值受肺组织材料质量、PCLS质量以及供体肺组织疾病状态的影响。尽管不同供体的人肺组织存活率存在差异，但死亡细胞核数量相对于存活组织的比例不应超过对照组织的15%。然而，若在对照组织中观察到大量死亡细胞核，则应终止该实验。
图5 展示了HClPt和SLS对人肺组织免疫调节作用的代表性数据。促炎性细胞因子IL-1α和TNF-α是炎症的生物标志物，提示在接触刺激物质后炎症过程的启动。这两种细胞因子均通过ELISA进行检测。在人肺组织切片（PCLS）中，细胞外IL-1α通常水平较低，而细胞内IL-1α可达到1,000 pg/mL及以上。细胞内IL-1α的减少提示正在进行的细胞毒性过程，通常在人PCLS暴露于化学物质后观察到。当组织以LPS（一种先天免疫系统的激活剂，作为阳性处理对照）刺激时，诱导产生的大部分IL-1α在24小时后仅能在细胞内检测到。相比之下，由LPS刺激诱导的TNF-α分泌主要可在细胞外检测到。使用适当的阳性对照（如LPS）可验证方法的有效性。在本研究方法中，人PCLS被暴露于三种浓度的HClPt（32、64和 125 µg/mL）或两种浓度的十二烷基硫酸钠（1 和 10 µg/mL) 培养24小时。细胞因子分泌量测定为细胞外和细胞内细胞因子的总和，并归一化至总蛋白浓度，如图所示。 图5值得注意的是，BCA 法通常用于测定总蛋白含量，但也能反映物质诱导的细胞毒性。因此，在高毒性浓度下，总蛋白含量不能用于细胞因子数据的归一化。IL-1α 的分泌量从 263 ± 38 pg/mg 显著增加至 887 ± 216 pg/mg，TNF-α 的分泌量则从 263 ± 38 pg/mg 显著增加至 1,160 ± 286 pg/mg（图5A，B此外，将LPS诱导的IL-1α和TNF-α分泌情况与未刺激的组织对照进行比较。病原体相关分子模式（如LPS）诱导促炎细胞因子的产生，可验证该方法的有效性，因此在利用人肺切片（PCLS）研究免疫调节效应时，强烈推荐采用此策略。有关HClPt和SLS数据的更多细节，请参见Lauenstein的研究。 等21
<img alt="肺组织样本和手术过程；在培养皿中进行组织学研究的实验分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：填充人肺组织材料的操作流程。人肺在切除后应立即进行处理。为确保琼脂糖能够均匀填充并防止填充过程中琼脂糖突然聚合，肺组织应在室温下保存。将肺水平放置，使肺叶充分展开，以便清晰观察主支气管或各支气管（A 和 B 为支气管的放大图）。使用柔软的硅胶管对支气管进行插管，并用夹具固定（C）。完成填充操作并使琼脂糖在组织内聚合后，由经验丰富的病理学家将肺组织切成约 3–5 cm 厚的切片（D）。从这些切片中，使用取芯工具制备圆柱形组织芯（直径 例如，8 mm）（E）。再利用组织切片机将这些组织芯切割成肺切片（PCLS），并立即将其转移至盛有培养基的培养皿中，在标准细胞培养条件下进行孵育（E）。经过多次洗涤步骤后，将PCLS转移至细胞培养板中（例如，24孔板，每孔放置两个PCLS，加入500 µL培养基），以去除残留的细胞碎片和释放的细胞因子（F）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学示意图：染色的肺组织切片，显示细胞结构，突出肺泡形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：通过H&amp;E染色评估人源肺组织切片（PCLS）的健康状态。 本图中的PCLS来自一位肺肿瘤供体，显示完整的肺组织结构，包括肺泡实质、外周气道（***）和血管（箭头）的总体观（A）。在更高倍镜下可见具有完整纤毛呼吸上皮的传导性气道（箭头）（B），结构完整的肺泡，其内衬有活性肺泡上皮细胞，并可见含大量红细胞的毛细血管（箭头）（C），肺泡腔内含有肺泡巨噬细胞（CD68免疫组织化学染色）（D），以及具有完整内皮的血管（CD31免疫组织化学染色）（E）。仅使用无肿瘤组织制备PCLS，因此未见肉眼可见的病变区域。与来自其他肺部疾病（如肺气肿或纤维化）供体的PCLS相比，该样本的肺泡结构未受破坏，仅在边缘处略有松散，这很可能归因于制备过程中的操作。比例尺分别表示1,000 µm（A）和50 µm（B-E）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SLS 毒性的吸光度和剂量反应曲线；包括 LDH 和 WST-1 细胞毒性检测。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：通过检测酶 LDH 泄漏至培养基（A）以及使用染料 WST-1 评估代谢酶活性的损失（B），测定 SLS 在人源肺切片（PCLS）中诱导的细胞毒性。 人源 PCLS 被暴露于递增浓度的 SLS 中。随后将数据拟合为 S 形浓度-反应模型，以便计算 IC75 或 IC50 值（即细胞活力分别降低 25% 和 50% 时的抑制浓度）（右图）。数据以均值 ± 标准误表示，n = 3 - 5。LDH 检测的吸光度在 492 nm（参考波长 630 nm）处测定，WST-1 检测的吸光度在 450 nm（参考波长 630 nm）处测定。数据经改编和修改自 Lauenstein et al.21 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="使用钙黄绿素和EthD-1染色比较组织与死亡对照的共聚焦显微镜示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：人源肺切片（PCLS）三维显微染色与图像重建的代表性图像。 通过钙黄绿素AM（黄色）和EthD-1（红色）对人源肺切片（PCLS）染色后，展示活体组织对照以及组织对洗涤剂（作为一种有效毒性物质）的反应性。使用10X物镜采集30 µm厚的图像层叠（A），并进行三维重建（B）。比例尺为100 µm。激发波长分别为488 nm和543 nm，发射滤光片分别为BP 505–550 nm和LP 560 nm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示HCIPt、SLS和LPS处理后细胞因子反应的IL-1α和TNF-α表达图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57042/57042fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：人肺切片（PCLS）经氯六氨合铂酸铵（HClPt）处理24小时后IL-1α和TNF-α的分泌情况。 将PCLS暴露于三种浓度的HClPt（32 µg/mL、64 µg/mL和125 µg/mL）以及两种不同浓度的十二烷基硫酸钠（SLS，1 µg/mL和10 µg/mL）。通过ELISA法测定细胞外和细胞内的IL-1α（A）和TNF-α（B），并归一化至总蛋白含量。为验证该方法的有效性，使用先天免疫系统的阳性激活剂脂多糖（LPS）作为参照，分别展示细胞内IL-1α（A）和细胞外TNF-α（B）的释放情况，并归一化至总蛋白含量。数据以均值±标准误表示，*p &lt;0.05，***p &lt;0.001；HClPt和SLS组：n = 9，IL-1αLPS：n = 5，TNF-αLPS：n = 4，均为技术重复（Mann-Whitney检验）。本图经Lauenstein et al.21 修改 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="用于光谱数据分析的图形用户界面；多个面板显示滤波、拟合及结果表格。" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="补充图1"> 
补充图1：利用渲染软件对显微镜下存活率染色图像进行详细计算处理。 上传LSM图像进行钙黄绿素染色活体组织表面渲染的图像分析分步操作流程A-G, I）以及对溴化乙锭同源二聚体染色的细胞核进行点状检测（H, J-M). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度比较的显微镜分析；多幅显示细胞结构的图像。" src="/files/ftp_upload/57042/57042supfig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="补充图2"> 
补充图2：人肺组织显微存活染色的计算图像分析概览。 通过表面渲染分析存活组织（黄色）（B-I），通过斑点检测识别死亡细胞核（红色）（J-P）。图像导出采用快照模式（Q）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57042/57042supfig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

鉴于3R原则，作为动物实验替代方案的呼吸系统模型正在不断发展。特别是对于呼吸性物质的风险评估，目前尚缺乏合适的检测方法。本文介绍了利用人源性精准切割肺组织切片评估空气传播物质的方法。

呼吸系统疾病具有高度异质性，需要合适的模型系统来阐明其潜在机制，并推动新疗法的开发……

建立人源性精准切割肺组织三维模型的总体目标是利用人体组织在离体模型中评估细胞毒性及免疫调节效应。该方法有助于回答药理学与毒理学领域中的关键问题，从而评估物质的安全性，并在原生人体环境中评价其生理反应。该技术的主要优势在于，通过使用新鲜且具有活性的人体组织，能够有效模拟人类呼吸系统疾病中的细胞毒性或免疫调节效应。尽管该方法可为人类细胞间相互作用、生理学及呼吸系统疾病的发病机制提供深入见解，但它也可应用于其他领域及其他物种。通常，初次接触该方法的研究人员在组织评估人体组织和建立可靠的技术体系方面会遇到困难。此外，由于肺组织具有高度异质性，灌注过程需要大量的训练和实践经验。开始此操作时，通过插入硅胶管并用夹子将其固定，以实现气管插管，夹子应与硅胶管平行放置，使夹子将组织与硅胶管一起夹紧，但不压闭管腔。用夹子封闭所有其他支气管、血管及损伤部位，以防止在灌注过程中琼脂糖泄漏。插管主支气管需要良好的解剖操作技能。肺组织不应过度扩张，否则组织会撕裂；如果灌注不充分，组织会过于柔软，无法制备任何PCLS。然后，在烧杯中将等体积的3%低熔点琼脂糖与培养基混合。使用15毫升注射器将混合液注入肺组织中。在用培养基重新填充注射器之前，用手指或夹子夹紧导管，以避免产生气泡和琼脂糖回流。将肺组织切成3至5厘米厚的片状。向组织切片机中加入400毫升冰冻的EBSS。使用半自动螺丝刀配合取芯工具，立即从肺组织切片中切割出圆柱形组织芯。随后，将组织芯转移至组织切片机的组织固定架中。将重物置于组织芯上方，开始将组织芯切片制成PCLS（肺切片组织培养物）。打开玻璃圆筒的夹子，将组织切片仪中的培养基排入烧杯中。接着，将切片从烧杯转移至含有培养基的培养皿中。随后，将培养皿放入培养箱，使培养基在洗涤步骤前预热。然后，将肺组织切片小心转移至24孔培养板中，每孔加入至少500微升培养基，每孔放置两片组织切片。为配制工作液的主混合液，需为每孔加入25微升WST-1试剂和225微升培养基。接着，每孔加入250微升WST-1主混合工作液，并将培养板在37摄氏度下孵育1小时。确保在孵育过程中PCLS完全被WST-1试剂覆盖。随后，将培养板置于200 RPM的轨道摇床上，轻轻振荡30秒，以确保WST-1试剂充分混匀。然后，用移液器将24孔板中每孔的上清液各100微升，重复取样至新的平底96孔板中。使用酶标仪在450纳米处测定各孔的吸光度，并从450纳米处的吸光度中减去630纳米处的参考吸光度。将PCLS与测试试剂孵育后，将50微升上清液以复孔形式转移至新的96孔板中。由此可从24孔板的每个处理孔中获得复孔样本。在进行检测前，立即配制无LDH试剂的工作液主混合液：将125微升催化剂溶液与6.25毫升染料溶液充分混合，用于96孔板。然后，将50微升主混合工作液加入各已含有50微升上清液的孔中。将板在室温下避光孵育20分钟。随后，使用酶标仪在492纳米处测定每个孔的吸光度，并从492纳米处的吸光度中减去630纳米处的参考吸光度。对于显微观察，使用共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）至少采集两个随机分布的Z轴层扫图像。单击目镜选项卡，选择10倍物镜。单击“Online”以将cLSM用作标准光学显微镜，找到PCLS的表面。然后，单击“Offline”退出目镜设置。随后，点击“Acquisition”选项卡，并为相应的荧光染料开启适当的激光器。在采集选项卡下点击光路，为实验设置必要的滤光片和反射镜。按下实时按钮，可在屏幕上查看相应层的实时图像。上下调节焦距，直至肺切片表面呈现清晰的信号。随后，将红色碘化丙啶同型二聚体-1通道的针孔设为一个空气单位，以在光收集效率和光学切片效果之间达到最佳平衡，并相应调整钙黄绿素通道。提高增益以增强检测信号。增加或减少数字偏移，以调节背景，使其在激活通道颜色锁定表的活体图像中呈现蓝色。勾选Z轴堆叠复选框以设置显微体积的上限和下限。缓慢上下调节焦距，直至达到30微米的范围，然后按“设置终点”以保存。接着，再次单击“实时”以关闭实时图像，再按“开始实验”以启动成像。图中显示的是PCLS的显微存活率图像，展示了人体组织对洗涤剂作为有效毒性物质的反应性。通过评估钙黄绿素阳性组织与碘化乙啶同源二聚体-1阳性细胞核的对比，可直观判断毒性效应。尽管人体肺组织的存活率在不同供体之间存在差异，但与存活组织相比，死亡细胞核的数量不应超过组织对照的15%。该图展示了六氯铂酸铵（一种SLS）对人肺组织免疫调节作用的代表性数据。通过ELISA法测定细胞外和细胞内的IL-1α和TNF-α，并将其归一化至总蛋白含量。该技术建立后，为药理学和基础科学领域的研究人员探索活性人肺组织内的生理反应开辟了道路。完成此操作后，还可进行其他终点检测，例如气道收缩，以回答更多问题，如支气管扩张药物的有效性。观看本视频后，您应能够较好地掌握如何制备和处理人源性精准切割肺组织片。一旦熟练掌握，该技术可在六至八小时内完成，若操作得当，最早可在24小时内获得初步结果。然而，请务必注意，处理未固定的**人类**材料可能具有极其严重的感染风险，因此在进行此操作时，应始终穿戴防护服等防护装备。此外，必须牢记尽可能在无菌条件下操作。

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科研

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Immunology and Infection

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