体外血管发生动力学分析定量评估血管发生与血管生成的动态过程 In Vitro

本实验方法的总体目标是随时间可视化并定量分析血管发生过程的动态变化。该方法有助于回答血管生成和血管发生领域中的关键问题，例如血管形成速率以及所形成网络结构模式之间的差异。该技术的主要优势在于能够对大量血管发生时间点进行定量分析，从而提供了评估血管生成过程动力学的机遇。

该方法可应用于任何影响血管发生或血管生成过程的细胞群体或病理状态，用于研究单个细胞群体或共培养系统。实验开始前约一至两小时，将显微镜载物台培养箱预热至37摄氏度，并将二氧化碳浓度设定为5%，湿度设定为85%。若培养箱的湿度储水槽为空，请及时加水。将活细胞培养腔置于显微镜上，然后将一片空白的带孔载玻片放入活细胞培养腔两个开放位置中的任意一个。

用蒸馏水填充载玻片，并将辅助吹风机设置为39至42摄氏度，从下方加热载玻片并尽量减少冷凝。维持活细胞成像腔内的适当温度和湿度对实验成功至关重要。在实验载玻片准备好之前，先添加另一张空白载玻片。

然后，向第二张载玻片上小孔周围的储液槽中加入水，以模拟成像实验期间的环境条件。为了将基底膜基质加载到实验用腔室载玻片中，首先使用低温的20微升移液器吸头安装在20微升移液器上，并用剪刀从吸头末端剪去约1厘米。将移液器体积设定为略大于10微升，然后缓慢将基质吸入经改造的吸头中。

立即将移液器吸头放入一个载玻片孔的中心，轻轻接触孔底，缓慢按压移液器推杆以推出基质。将基质加入全部15个孔后，将盖子完全推到底，盖紧载玻片。准确且一致地向每个孔中加入Matrigel体积，对于获得高质量的相差显微图像至关重要。

然后，将载玻片置于37摄氏度环境中孵育30至60分钟，并将其放置在装有2至3毫升PBS的50毫升锥形管盖旁边，以减少基质脱水。当基质完全凝固后，移除过夜培养的内皮集落形成细胞培养物中的上清液，并用7毫升PBS洗涤细胞。吸除PBS洗涤液，加入2至3毫升胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育2至5分钟以解离细胞。

随后，将解离的细胞重悬于3毫升内皮细胞生长培养基-2（Endothelial Growth Medium-2）中，以充分分散任何细胞团块，并将所得细胞悬液转移至15毫升锥形管中。待所有内皮集落形成细胞样品均完成重悬后，通过离心收集细胞沉淀，并将沉淀重悬于1至2毫升新鲜内皮细胞生长培养基中。计数每份样品中的活细胞数量，并向新的1.5毫升离心管中加入足量的内皮集落形成细胞，使细胞浓度稀释至每175微升培养基中含1.4 × 10⁴个细胞。

然后，用移液器轻轻吹打混匀各主混合液。取下滑片盖子，将每种主混合液各取 50 µL，每孔重复三次，加入到滑片上的各孔中。为成像细胞，将空白滑片替换为实验滑片，并向滑片上细胞周围的储液槽中加入水。

依次切换每个阶段位置，确认已选中第一个孔的中心。聚焦于孔中接种的细胞，并设置载物台的Z轴位置。当设置准确后，关闭灯光以开始成像实验。

成像完成后，在图像采集软件中对图像序列文件进行缩放并导出，并将图像保存为用于分析的 TIFF 文件。要分析图像，请将“血管生成动力学分析”文件从其文件夹拖动到软件窗口底部的灰色栏中以打开该软件，然后点击“保存”将其添加到软件列表中。点击“文件”并选择“打开”，以选择要打开的图像文件，或者将图像文件直接拖动到软件窗口内的灰色栏中。

单击“图像”、“调整”，然后选择“亮度/对比度”，打开亮度/对比度窗口。在亮度/对比度窗口中单击“重置”，以查看图像。然后，依次单击“图像”、“类型”和“8位”，将图像转换为8位。

选择“工具”和“感兴趣区域管理器”，使用适当形状的选择工具创建新的感兴趣区域。单击“添加”将该感兴趣区域形状加入“感兴趣区域管理器”窗口，并在“感兴趣区域管理器”中单击感兴趣区域标签以在图像上查看该区域。根据需要调整感兴趣区域。

当区域确定后，单击“图像”，然后选择“裁剪”以裁剪图像。接着，打开“编辑”菜单并选择“清除外部”，以删除图像堆栈中每个图像在感兴趣区域之外的图像数据。接下来，打开“插件”菜单并选择“分析网络”插件。

使用弹出窗口中的下拉箭头更改阈值分割方法，然后单击“确定”以启动软件处理。分析结束后，将打开一个数据表和一组融合图像，显示骨架和掩膜的呈现结果。单击“文件”然后选择“另存为”，将数值数据导出到电子表格中，并保存包含原始数据值的电子表格文件。

单击融合的骨架与掩膜图像，将融合的骨架掩膜图像序列和裁剪后的相差图像序列保存为 TIFF 文件。然后，单击“感兴趣区域管理器”窗口，选择用于裁剪图像的感兴趣区域，点击“更多”按钮，再点击“保存”，以将该感兴趣区域保存供将来使用。通过血管发生动力学分析鉴定出的内皮集落形成细胞网络，以骨架和掩膜的图示形式呈现，用以说明软件用于定量分析的结构。

当相差图像质量较高且获得足够的对比度时，血管发生动力学分析将能够准确识别内皮集落形成细胞网络，这可通过相差图像与血管发生动力学分析生成的骨架图和掩膜图之间的相似性得以证实。如果相差图像对比度不足，或出现网格状成像伪影等图像干扰，则网络检测的准确性会降低，结果变得不明确。然而，可在软件下拉菜单中分析前选择不同的阈值分割方法（如此处所示的均值法和大津法），以适应图像质量的差异。

通过血管发生动力学分析，确定暴露于妊娠期糖尿病的内皮集落形成细胞是否表现出网络形成动力学的改变，结果表明，与来自无并发症妊娠的内皮集落形成细胞培养相比，妊娠期糖尿病培养物中的网络结构形成呈现异质性改变。事实上，无并发症妊娠样本通常比妊娠期糖尿病样本形成更多的闭合网络。然而，所有内皮集落形成细胞样本总体上均表现出双相性的网络形成模式，尽管不同样本之间的网络形成速率以及达到的最大网络数量存在差异。

通过该方法，血管发生动力学分析所产生的数据值可进行作图和分析，以确定不同样本形成的网络结构是否存在统计学差异，以及差异出现在哪些时间点。血管发生动力学分析能够高效处理涉及大量图像的时间序列实验。一旦掌握该技术，若所有系统运行正常，图像采集、后期处理和分析可在两天内完成。