血管血管和血管生成的动力学分析体外
2018年1月31日
在这里, 我们提出了一个时间推移成像和分析血管在体外使用相衬显微镜结合开放源码软件, 动力学分析的血管。本协议可用于定量评估多种细胞类型的血管电位或模型血管疾病的实验条件。
这种实验方法的总体目标是可视化和量化血管生成的动态过程随时间的变化。这种方法可以帮助回答血管生成和血管生成领域中关于血管形成速率和形成网络结构模式之间差异的关键问题。该技术的主要优点是它能够量化大量血管生成时间点，为评估血管生成过程的动力学提供了机会。
该方法可应用于影响血管生成或血管生成过程的任何细胞群或病理状态，用于研究单个细胞群或共培养系统。在实验开始前大约一到两个小时，将显微镜载物台顶部培养箱预热至 37 摄氏度，并将二氧化碳设置为 5%，湿度设置为 85%如果培养箱是空的，请填充培养箱的湿度箱。将活细胞室放在显微镜上，然后将空腔室载玻片放入活细胞室内两个打开位置之一。
用蒸馏水填充载玻片，并将辅助鼓风机设置为 39 至 42 摄氏度，以从下方加热载玻片并最大限度地减少冷凝。在活细胞成像室内保持适当的温度和湿度对于实验的成功至关重要。将第二张幻灯片添加为空白，直到可以添加实验性幻灯片。
然后，向第二张载玻片上孔周围的储液槽中加水，以模拟成像实验期间的条件。要在实验室载玻片上加载基底膜基质，首先用 20 微升冷移液器吸头加载 20 微升移液器，然后用剪刀从吸头末端剪下约 1 厘米。将移液器体积设置为略大于 10 μL，然后缓慢将基质吸入改良的移液器吸头中。
立即将移液器吸头放入一个载玻片孔的中心，轻轻接触吸头到孔底部，然后慢慢按下柱塞以将基质推出。将基质添加到所有 15 个孔中后，将盖子完全推到载玻片上。将 Matrigel 体积准确一致地移液到每个孔中对于获得高质量的相差图像至关重要。
然后，将玻片置于 37 摄氏度下 30 至 60 分钟，放在装满 2 至 3 mL PBS 的 50 mL 锥形管盖旁边，以减少基质脱水。当基质凝固后，从过夜培养的内皮集落形成细胞培养物中取出上清液，并用 7 毫升 PBS 洗涤细胞。在 37 摄氏度下用 2 至 3 毫升胰蛋白酶吸出 PBS、洗涤并分离细胞 2 至 5 分钟。
然后，将解离的细胞重悬于 3 mL 内皮生长培养基-2 中，以打碎任何细胞团块，并将所得细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。重悬所有内皮集落形成细胞样品后，通过离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于 1 至 2 mL 新鲜内皮生长培养基中。计算每个样品中活细胞的数量，并将足够的内皮集落形成细胞加入新的 1.5 毫升试管中，以允许将细胞稀释至每 175 微升培养基浓度的 1.4 乘以 10 至第四个细胞。
然后，将每种预混液与轻柔的移液混合。取下玻片盖，将每孔 50 微升每种预混液一式三份倒入载玻片上。为了对细胞进行成像，用一张实验载玻片替换空白载玻片，并向载玻片上细胞周围的储液器中加水。
循环切换每个阶段位置，并确认已选择第一个孔的中心。专注于孔中铺板的细胞并设置载物台的 Z 位置。当设置准确时，关灯开始成像实验。
成像完成后，在 Image Capture 软件中缩放和导出图像堆栈文件，将图像保存为 TIFF 文件以供分析。要分析图像，请将 Kinetic Analysis of Vasculogenesis 文件从其文件夹拖到软件窗口底部的灰色条中以打开软件，然后单击 Save 将软件添加到列表中。点击 文件 和 可选 选择要打开的图像文件，或将图像文件拖到软件内的灰色条上。
点击 图片， 调整及 亮度/对比度 打开 亮度/对比度 窗口。单击 Brightness/Contrast 窗口中的 Reset 以可视化图像。然后，单击 图片， 房屋类型及 8 位，将图像转换为 8 位。
选择 Tools and Region Of Interest Manager，然后使用形状合适的选择工具创建新的感兴趣区域。单击"添加"将感兴趣区域形状添加到"感兴趣区域管理器"窗口，然后单击"感兴趣区域管理器"中的"感兴趣区域"标签以查看图像上的区域。根据需要调整感兴趣区域。
区域就位后，单击 图像，然后单击 作物，以裁剪图像。然后，打开 Edit 菜单并选择 Clear Outside 以删除堆栈中每个图像的感兴趣区域之外的图像数据。接下来，打开 Plugins 菜单并选择 Analyze Network 插件。
使用弹出窗口中的下拉箭头更改 Thresholding Method，然后单击 OK 启动软件处理。在分析结束时，将打开一个数据表和一堆描绘骨架和蒙版演绎版的融合图像。单击 文件 和 另存为 将数值传输到电子表格中，并保存包含原始数据值的电子表格。
单击融合的骨架和遮罩图像，并将融合的骨架遮罩图像堆栈和裁剪的相差图像堆栈保存为 TIFF 文件。然后，单击感兴趣区域管理器窗口，选择用于裁剪图像的感兴趣区域，然后单击更多和保存以保存感兴趣区域以备将来使用。通过血管发生动力学分析鉴定的内皮集落形成细胞网络以图形方式表示为骨架和面具，以说明软件用于定量的结构。
当相差图像质量高且获得足够的对比度时，血管生成的动力学分析将准确识别内皮集落形成的细胞网络，如在相差图像与血管生成动力学分析生成的骨骼和掩码再现之间观察到的相似性所示。如果相差图像没有高对比度，或者出现网格化等成像伪影，则网络检测精度会降低，结果会变得模糊。但是，在分析之前，可以在软件下拉菜单中选择不同的阈值方法，例如此处显示的 Mean 和 Otsu，以适应图像质量的差异。
使用血管发生的动力学分析来确定妊娠糖尿病暴露的内皮集落形成细胞是否显示网络形成动力学的改变，揭示了与来自无并发症妊娠的内皮集落形成细胞培养物相比，妊娠糖尿病培养物中的网络结构形成异质性改变。事实上，与妊娠糖尿病样本相比，无并发症的妊娠样本通常会形成更多的封闭网络。然而，所有内皮集落形成的细胞样品总体上都显示出网络形成的双相模式，尽管不同样品的形成速率和实现的最大网络数量不同。
按照此程序，可以绘制和分析血管发生动力学分析生成的数据值，以确定不同样品形成的网络结构是否在统计上不同，如果是，则在哪些时间点。血管发生的动力学分析能够有效处理涉及大量图像的延时实验。一旦掌握，如果所有系统都运行正常，图像采集、后处理和分析可以在两天内完成。
概述
本文介绍了一种使用相差显微镜和血管生成动力学分析软件对体外血管生成进行时间跨度成像和分析的协议。该方法允许对各种细胞类型和与血管疾病相关的实验条件的血管生成潜力进行定量评估。
关键研究组成部分
科学领域
- 血管生成
- 血管生成
- 细胞培养技术
背景
- 理解血管生成对于洞察血管疾病至关重要。
- 时间跨度成像提供了血管形成的动态可视化。
- 该方法可以应用于各种细胞群体和条件。
- 定量分析增强了对血管网络形成的理解。
研究目的
- 可视化和量化血管生成过程随时间的变化。
- 评估不同实验设置中血管形成的动力学。
- 探索形成的血管网络的结构模式。
所用方法
- 准备一个温度和湿度受控的活细胞成像室。
- 使用Matrigel创建细胞培养基质。
- 对内皮细胞集落形成细胞进行时间跨度成像。
- 使用血管生成动力学分析软件分析图像。
主要结果
- 成功可视化了血管生成过程随时间的变化。
- 关于血管形成速率和结构模式的定量数据。
- 识别了不同细胞类型之间血管生成潜力的差异。
- 生成数据表和融合图像以供进一步分析。
结论
- 该协议提供了一种可靠的研究血管生成的方法。
- 定量分析可以导致对血管疾病的更好理解。
- 该方法可以适用于各种实验条件和细胞类型。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying the kinetics of vasculogenesis provides a predictive readout for endothelial progenitor cell functionality, enabling mechanistic de-risking in vascular disease models. This approach supports target validation by linking network formation dynamics to pathophysiological conditions such as maternal diabetes. The method enhances assay development for branching processes, improving translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring rates of network formation and stabilization in endothelial progenitor cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative comparison of vasculogenic potential across disease states.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by identifying altered kinetics in diabetic-exposed fetal ECFCs versus controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized basement membrane matrix plating and time-lapse imaging.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated segmentation and skeletonization of network structures.
- Scientific Value: Highlights screening readiness by generating ten quantitative parameters (nine measured, one calculated) for network analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by applying the protocol to fetal ECFCs from pregnancies complicated by diabetes mellitus.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal assessment of vasculogenic dynamics.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying biphasic network formation patterns and altered maximal network achievement in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing dynamic, quantitative readouts of vasculogenesis that inform mechanistic and phenotypic assessments.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking via kinetic analysis of network formation over 15 hours.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through time-lapse phase contrast imaging and KAV-derived parameters such as closed networks, total branch length, and branch-to-node ratio.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs that enable comparison of network structures across conditions and time points.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating altered vasculogenesis in diabetic-exposed ECFCs, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for assessing vasculogenesis and other branching processes in diverse cell types and disease states.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vascular network formation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vasculogenesis assessment across multi-well formats and time-lapse experiments.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of dysfunctional vasculogenic phenotypes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative network formation kinetics and structural parameters.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cell culture, live-cell imaging, and image analysis software operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including phase contrast microscopy, temperature/humidity-controlled live-cell chamber, and Kinetic Analysis of Vasculogenesis software.
- Cross-team standardization requirements for matrix plating, cell seeding density, and thresholding method selection (e.g., Mean or Otsu) to ensure consistent network detection.
- Adaptation considerations across model systems, including varying endothelial progenitor cell sources and extracellular matrix compositions.
- Practical limitations supported by source material: network detection accuracy is reduced under low image contrast or imaging artifacts such as gridding, necessitating quality control of phase contrast images.
