胰腺胰岛与小鼠分离的简单高效协议

与更复杂的传统小岛隔离方法相比，该协议要求使用单密度梯度，使其劳动密集型程度显著降低，成本效益更高。该协议的主要优点是，酶直接送到胰腺，从而增强组织消化和增加胰岛产量。首先将小鼠的四肢贴在苏平位置，然后用70%乙醇喷洒身体。

使用盖玻璃钳和弯曲的手术剪刀，做一个约三厘米的水平腹部皮肤切口，并拉开皮肤暴露腹壁。在腹部腹膜上进行三到四厘米的垂直切口，以完全暴露胰腺，将鼠标置于解剖显微镜下。将肝叶上级推至暴露显示为淡粉色管的胆管，轻轻将肠道从右腰椎和腹腔右侧移动，以暴露胆管和肝动脉。

使用Schwartz微肌素仔细夹紧普通胆管尽可能靠近肝脏，并识别位于十二指肠教皇的Va特尔的安培，该安培由胰腺导管和普通胆管结合形成。使用微型Adson钳子拉普通胆管教学，插入一个30量程半英寸针连接到一个三毫升注射器，含有三毫升新鲜准备的胶原酶P溶液到Va特尔的安图拉推针到管道平行于容器约四分之一的容器长度。一旦针头就位，用微型Adson钳子稳定针头，并缓慢而稳定地将三毫升胶原蛋白酶P溶液注入管道。

如果胰腺的头部、颈部、身体和尾部区域完全膨胀，则注射被认为是成功的。正确进入普通胆管的安培和导管是成功消化收获的关键。刺穿导管壁会降低隔离的功效。

使用弯曲和微型Adson钳子，小心地拉出膨胀的胰腺，从脾脏开始，继续朝胃和沿十二指肠。然后将胰腺放在含有三毫升冰冷胶原酶P溶液的50毫升消化管中。要收获小岛，首先使用精细的手术剪刀切割胰腺三至五秒钟，然后将管子置于37摄氏度的水浴中，每分钟旋转100至120次，旋转12至13分钟。

在孵育结束时，轻轻摇动管子约30秒，以扰乱组织，直到溶液是均匀的，如细砂状胰腺组织颗粒确认。一旦组织被消化，将管子放在冰上，并加入40毫升的冰冷停止溶液，以终止酶反应。轻轻搅拌颗粒后，在摆动桶离心机中旋转消化的组织，然后每次洗涤两次离心，并加热 20 毫升新鲜止损溶液。

上次洗涤后，将颗粒重新在 40 毫升的冰冷 HBSS 中重新加洗三次，在上次洗涤后将颗粒重新用 5 毫升室温密度梯度溶液中重新填充。在低速下短暂旋转管，直到溶液均质，然后再向管中再添加五毫升室温密度梯度。现在使用10毫升移液器，以滴滴的方式轻轻地缓慢地将10毫升室温HSS加入管子，以允许形成梯度，并使用摆动桶离心机通过密度梯度分离来分离细胞群。

在离心结束时，使用 10 毫升移液器预湿与冷 HBSS 收集密度梯度和 HBSS 之间的 5 到 10 毫升的小岛层。将小岛转移到一个新的50毫升管中，里面装着20毫升的新鲜冰冷HSS，并在摆动桶离心机中离心收集细胞。小心吸气，但最后三毫升的上一液，而不干扰颗粒和洗小岛至少三次，每次洗涤20毫升新鲜HSS。

上次洗涤后，用 37 摄氏度 RMPI 1640 介质的 4 毫升更换上经剂，轻轻旋转管子以取出颗粒。立即将小岛倒入 100 毫米 Petri 盘中，用 5 毫升新鲜 RPMI 1640 介质清洗管，收集与其他小岛一起清洗的任何剩余小岛。然后使用解剖显微镜和20微升移液器尖端，从培养皿中挑选具有光滑表面的健康球形或长方形金棕色小岛，将其转移到含有10毫升完整RPMI 1640介质的新培养皿中。

收集所有小岛后，将小岛放在37摄氏度的无菌孵化器中，将5%的二氧化碳在加湿空气中过夜。良好的健康小岛似乎有一个光滑的圆形，而损坏的坏小岛表现出粗糙的边缘。未消化的外分泌组织在外观上是半透明的，并且表现出不规则的形状。

胶原酶P酶的适当的凝固和分布可以通过胰腺的血性部分的膨胀来证实。在低葡萄糖介质中过夜孵育可以在第二天为胰岛提供葡萄糖刺激胰岛素分泌测定，从而深入了解小岛胰岛素分泌能力。