检测单突触连接 果蝇 利用河豚毒素抗性钠通道

该技术的总体目标是利用对河豚毒素具有抗性的钠通道，通过电生理学方法在果蝇中鉴定单突触连接。该技术的主要优势在于其操作简便，并能够揭示突触的化学性质。此外，该方法也适用于体积传递或大范围传递的研究。

通常，在初次采用该方法的实验视频中，我们常因解剖难度较大而遇到困难。然而，只要充分理解该方法，其原理可轻松推广至其他模式系统，例如小鼠。进行记录时，应准备电阻接近七兆欧姆的膜片钳电极。

此外，准备pH值为7.3或更低的外部记录用生理盐水，并持续用含95%氧气和5%二氧化碳的碳合气（carbogen）进行通气。实验对象选用在含有0.2毫摩尔全反式视黄醛（all trans-Retinal）的食物上培养的表达csChrimson的果蝇品系。用于记录时，选择1至3日龄的成虫。

将它们装入玻璃闪烁瓶中，并在冰冻低温条件下暴露一分钟以固定。然后，降低体视显微镜的光照强度，使用粗镊子将一只麻醉后的果蝇放入自制的记录室中。用石蜡或紫外光固化环氧树脂包裹果蝇，将其固定在记录室内。

将果蝇背侧朝上放置，锡箔位于胸部约一半高度处。获得良好制备样本的关键在于锡箔上的孔洞大小要适中，既不能挤压果蝇，也不能让其掉落穿过。从两侧用光纤光源照射样本，并尽可能调暗光照强度。

接下来，用四到六滴记录用生理盐水覆盖制备样本。然后，对用于解剖的钨丝或灯丝进行尖端处理。将约20伏的交流电施加于饱和硝酸钾溶液，并将钨丝尖端快速反复浸入该溶液中。

经过20次浸蘸后，尖端将变得锋利。现在调节光源，提供刚好足够的照明，以便使用 sharpened 钨丝去除角质层，随后移除气管和脂肪体，从而暴露脑组织。为进入触角叶，使用弯曲的钨丝将触角轻轻拨至箔片屏蔽层下方。

然后使用锋利的镊子轻轻撕去目标区域表面的胶质鞘。现在将标本转移至电生理记录装置进行记录。在装置上立即开始用经碳氧混合气体饱和的记录液灌流标本。

将重力灌注的生理盐水储液罐置于显微镜载物台上方。使用真空管路和一个2升的废液瓶来收集废弃的生理盐水。接着，用4微升的胞内记录液填充膜片钳电极，并将电极连接到显微操作器上。

然后，将放大器的偏移调零，并设置放大器以输出测试脉冲。接着，调节红外斜照明，以获得清晰的脑组织视野。此时，在向移液管施加正压的同时，用移液管接近细胞。

当与细胞接触后，释放正压，使移液管与膜形成密封。然后，将膜的钳制电位设置为负60毫伏。此时，移液管应与细胞膜形成吉欧姆级密封。

保持电流应降至亚皮安级别。为了获得稳定的千兆欧封接，请确保通过施加正压保持移液管清洁，并避免触碰组织或过于接近细胞。接下来，将放大器设置为输出从负50到负60毫伏的测试脉冲。

测试脉冲将显示一个较大的电容瞬变，代表为充电补丁移液管所需的电流。为消除电容瞬变，请调节放大器上的电容补偿旋钮。随后，施加短暂的负压脉冲以破裂细胞膜，从而获得全细胞构型。

容抗性瞬变显著增加表明操作成功。同时应观察到保持电流略有增加。然后，将放大器设置为电流钳制模式。

并将细胞的电位调节至负50到负60毫伏之间。准备时，按照技术指南中的说明设置数据采集系统。该系统需要一个高功率红色LED，置于样本下方，位置应确保以每平方毫米0.238毫瓦的强度照射果蝇。

现在，使用脉冲红光通过csChrimson表达对突触前神经元进行光遗传学激活。也可使用其他方法。在施加河豚毒素之前，应对40毫秒的光脉冲产生突触连接的可见反应。

无反应意味着连接可能性较低。可根据情况调整钳制电位，以突出兴奋性或抑制性连接。一旦确认连接，将灌流液设置为在盐溶液中循环灌流。

将泵调节至使浴液中的生理盐水液面保持稳定。然后向系统中加入河豚毒素，使其终浓度为1微摩尔。这应可阻断记录电极下神经元的放电活动。

如果没有反应，则向系统中加入更多的河豚毒素。接着，施加短暂的红光脉冲，以激活可能是单突触的连接。然后，向循环的生理盐水中添加药理学拮抗剂，以检测突触连接的化学性质。

在对河豚毒素敏感的钠离子通道notchback中进行转基因表达，可恢复神经元的兴奋性，并产生较大的平台电位。触角叶中的中间神经元对气味产生反应。然而，兴奋性突触后电流在胞体处不易被分辨。

那么，这些反应是否直接来源于嗅觉受体神经元的输入？利用tERPs发现，嗅觉受体神经元与局部中间神经元之间存在直接连接。刺激触角叶中的5-羟色胺能神经元会导致局部中间神经元出现兴奋与抑制的混合反应。

应用甲基麦角酸（methysergide，一种广谱5HT受体拮抗剂）阻断了缓慢的超极化反应，但对去极化无影响，而美加明（mecamylamine）则阻断快速去极化反应。这表明刺激为胆碱能性的。tERPs被用于解析由GABA或神经调质介导的细胞外突触间隙容积性传递。

在一个示例中，河豚毒素的应用并未抑制局部中间神经元中的抑制性信号。该抑制作用可被5-羟色胺拮抗剂甲基麦角酸丁醇酰胺阻断，提示存在来自特定5-羟色胺能神经元的直接信号。观看本视频后，您应能够充分理解如何从黑腹果蝇（Drosophila）神经元获取全细胞记录，并利用诱发电位（tERPs）评估其传导性。

在尝试该操作过程中，重要的是要保持耐心，并反复练习难度较高的解剖步骤。一旦掌握，若操作得当，该技术可在大约一小时内完成。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如药理学方法），以回答更多问题，例如化学突触的性质。

请务必注意，使用河豚毒素可能具有极高危险性，在进行这些操作时，应始终采取预防措施，例如佩戴手套并使用小体积操作。