利用5-溴尿苷标记与免疫沉淀法研究RNA合成

本实验的总体目标是通过溴尿苷标记和免疫沉淀来检测RNA合成的变化。该方法可通过测定RNA水平的变化是否由RNA合成改变所引起，从而帮助回答RNA代谢领域的关键问题。该技术的主要优势在于，它可应用于任何首选类型的细胞培养，且所用材料易于获取。

开始实验方案时，将3.5 × 10⁶个HEK293T细胞接种于10厘米培养皿中，加入10毫升生长培养基，以确保48小时后提取时获得总量超过40微克的RNA。将细胞维持在37°C、5% CO₂条件下培养。接种48小时后，吸除8毫升生长培养基，保留2毫升以防止细胞干燥。向生长培养基中加入2毫摩尔的溴尿苷（bromouridine）进行处理，并在重新加入含8毫升溴尿苷的生长培养基之前，先将细胞中残留的2毫升培养基移除。

接着，将细胞孵育一小时。孵育结束后，用 5 毫升 Hank's 缓冲液洗涤细胞，并加入 2 毫升 0.05% 胰蛋白酶消化细胞 5 分钟。加入 8 毫升培养基以终止反应，将细胞转移至 15 毫升离心管中，在 1,000 ×g 条件下离心 2 分钟。

然后，去除上清液，并使用RNA提取试剂盒从细胞沉淀中提取总RNA，用无RNase的水洗脱RNA。该技术非常灵敏，因此使用高质量的RNA至关重要。RNA提取是一个关键步骤，但借助现有的RNA提取试剂盒，该步骤也相对容易完成。

将要检测的样本数量加1（以补偿移液和涡旋混匀过程中的损失）作为一批次准备磁珠。通过涡旋混匀充分重悬抗小鼠IgG磁珠，并在无RNase的1.5毫升离心管中每样本取20 µL磁珠。将1.5毫升离心管置于磁力架上20秒，使磁珠吸附至管壁一侧。

弃去上清液，将离心管从磁力架上取下，用移液器加入40 µL 1×溴尿苷免疫沉淀缓冲液重悬磁珠。在台式离心机中离心2秒，再将离心管放回磁力架，弃去上清液。接下来，使用肝素封闭磁珠上的非特异性结合位点。

将珠子重悬于1毫升1倍溴尿苷-IP缓冲液中，另加1毫克/毫升肝素，混匀后旋转孵育30分钟。随后将珠子洗涤1次。将珠子重悬于1毫升1倍溴尿苷-IP缓冲液中，每样本加入1.25微克抗-α-溴脱氧尿苷抗体。

将珠子在旋转条件下孵育一小时。孵育结束后，用缓冲液洗涤珠子三次。将洗涤后的珠子重悬于每样品50 µL的1倍溴尿苷-IP缓冲液中，缓冲液中添加1 mM溴尿苷，然后继续在旋转条件下孵育30分钟。

旋转后，用一倍体积的溴尿苷免疫沉淀缓冲液（bromouridine-IP buffer）将磁珠洗涤三次，并将磁珠重悬于每份样品50 µL的上述缓冲液中。使用紫外-可见分光光度法测定RNA提取物中的RNA浓度，并将每份样品中的40 µg RNA用无RNase的水稀释至总体积为200 µL。将RNA在80°C下变性2分钟后，将样品在台式离心机中短暂离心。

离心后，向每个样品中加入200微升的两倍溴尿苷-IP缓冲液（含BSA和RNase抑制剂）。然后，向每个样品中加入50微升重悬并制备好的磁珠，室温旋转孵育1小时。孵育结束后，将磁珠洗涤四次。

用 200 微升洗脱缓冲液重悬珠子以洗脱 RNA，并迅速加入 200 微升 pH 6.6 的苯酚，以去除样品中任何非 RNA 分子。涡旋混匀样品，在台式离心机中以 25,000 × g 离心 3 分钟。随后，尽可能吸出上层相，约 190 微升，转移至含有 200 微升 pH 6.6 苯酚-氯仿的离心管中。

确保在各样本之间吸取相同体积的液体。涡旋混匀样本后进行离心。离心后，吸取约180微升的上层水相，并将其转移至含有200微升氯仿的离心管中，进行氯仿抽提。

涡旋混匀后离心样品。吸取约170微升的水相上层，转移至含有17微升3摩尔、pH为6的醋酸钠溶液的离心管中，以中和并沉淀水相中的RNA。接着，加入2微升糖原，糖原将与RNA共同沉淀，使沉淀物更易观察。

加入 500 µL 的 96% 乙醇以增强盐离子与 RNA 之间的结合，通过倒置离心管数次进行混匀。将离心管在 -20 °C 下过夜或在干冰中放置 15 分钟。离心冷却后的样品，弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后用 185 µL 的 75% 乙醇洗涤沉淀，以去除任何残留的盐分。

然后，在 4 °C 条件下以 25,000 × g 离心 5 分钟。彻底弃去上清液，注意不要扰动沉淀，将管盖打开，让沉淀在空气中干燥 5 至 10 分钟。用 10 µL 无 RNase 的水重悬沉淀，将水加在管壁侧面，以避免扰动沉淀。

AsPC-1 细胞分别用溴尿苷处理 0、1、2 和 4.5 小时，随后提取总 RNA 并进行溴尿苷免疫沉淀（bromouridine-IP）。在溴尿苷免疫沉淀的 RNA 中检测 GAS5 和 GAPDH，结果显示，与背景相比，1 小时标记即可达到 9 倍和 44 倍的变化。在 HEK293T 细胞中，2 毫摩尔的溴尿苷处理无论是 1 小时还是更长的 4 小时，均未引起任何形态学变化。

PLK-2 抑制导致输入样本和溴尿苷免疫沉淀物中的 α-突触核蛋白 mRNA 增加，表明稳态 RNA 的增加是由 RNA 合成增加所致。观看本视频后，您应充分了解如何使用溴尿苷标记新合成的 RNA，并对溴尿苷及其标记的 RNA 进行后续的免疫沉淀操作。