Name: 用于在大容量中查找特定细胞目标的串行剖面的多模式分层成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习多模式分层成像技术，利用阵列层析和连续切片方法在光学显微镜与扫描电子显微镜中定位组织内的特定细胞目标，实现纳米级分辨率的超微结构三维可视化。该技术适用于细胞生物学、发育生物学、神经科学和病理学等多个研究领域。

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本工作由德国联邦教育与研究部资助，项目编号FKZ 13GW0044，项目名称MorphiQuant-3D。我们感谢Carolin Bartels提供的技术支持。

注意：样品块应进行聚合处理，并含有某些重金属。图中所示两个样品的固定和包埋方案 图1A- B 在其他地方已有描述11简而言之，所示样品在 图1A 经化学固定并染色 整块 首先用1% OsO₄4，然后用1%醋酸铀染色，并包埋于Spurr树脂中。图中所示样品 图1B 经高压冷冻，在丙酮中用0.4%醋酸铀进行冷冻置换，随后包埋于Lowicryl HM20树脂中。后续制备步骤请使用无粉手套。
1. 创建阵列
<ol>
	<li>样品块修整 
	注意：插入部件时务必拧紧螺丝。
	<ol>
		<li>将样品块插入超薄切片机的样品 holder 中，将 holder 放入修整块，并滑入超薄切片机的下部载物台。</li>
		<li>使用剃刀片将包埋组织周围的树脂切除，仅在样品周围保留一圈窄小的树脂边缘。从顶部开始修整，直至达到目标区域。 
		注意：切面形状可以是梯形或矩形（我们已成功使用过两种形状）。重要的是使用矩形的长边作为前缘和后缘，以确保胶水混合物能够稳定条带的大面积区域。</li>
		<li>将样品 holder 插入超薄切片机的臂部，并用刀架替换下部载物台中的修整块。将金刚石修整刀（通常为45°）插入刀架中。使切面与修整刀刃完全平行。 
		注意：为获得精确平行的前缘（底部）和后缘（顶部），仅转动或移动刀具以修整相对两侧。对于大体积切片（超过数百片），使用90°修整刀更有优势。</li>
		<li>将四个侧面均修平，然后旋转样品 holder，使前缘和后缘处于水平位置。</li>
		<li>小心地用粘合剂混合物涂覆切块的前缘和后缘。使用固定在牙签上的一小束毛发制成的小刷子13。此步骤需快速完成，因为该混合物的溶剂在数秒内即挥发。切勿让此混合物污染切面。让涂覆后的样品块干燥5–10分钟。 
		注意：对于较多样品切片（&#62;200片），可能仅涂覆前缘更为合适，因为随着时间推移，后缘可能形成胶水隆起，进而可能将切片拉回刀刃上方。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基底制备
	<ol>
		<li>将硅片切割成适合放入刀槽的尺寸（对于Jumbo刀，约为2 × 2.5 cm2）。如需标记，可在清洗前用金刚石刻划笔（数字或字母）标记硅片，或在清洗后用永久性记号笔标记。使用异丙醇和无绒布手动清洁硅片。 
		注意：用于相关成像时，请使用氧化铟锡（ITO）涂层的玻璃盖玻片。它们必须小心操作，无需额外清洗。</li>
		<li>使用可移除粘合剂将基底固定在载板的一端。 
		注意：也可使用两条胶带将基底边缘平行于刀刃压紧固定。</li>
		<li>使用空气等离子体活化（辉光放电）基底，以获得亲水表面。应使水滴在基底上铺展成极薄的液膜（低接触角，图2C、D）。等离子体活化参数取决于所用设备；此处使用的参数见材料表。 
		注意：等离子体活化效果极不稳定，因此应在使用基底前立即进行。</li>
		<li>将载板插入基底 holder 的夹具中，使安装的基底更靠近刀刃，以实现刀槽中基底的最佳润湿。 
		注意：基底 holder 的详细描述（包括计算机辅助设计（CAD）图纸）见Wacker 等.11</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片准备
	<ol>
		<li>将Jumbo金刚石刀插入刀架，设定 Clearance 角（Jumbo刀为0°），并向刀槽中加入蒸馏水。将刀具移近样品至1–2 mm距离。</li>
		<li>使用基底 holder 的螺丝1–3（图2A）将基底降入水中。检查水线是否位于基底的上三分之一处。 
		注意：用干净的镊子轻推基底，检查基底与载板之间的胶水是否已充分固化。基底不应移动。</li>
		<li>由于使用硅片时难以观察到底部间隙，可将基底降低至触底，然后略微抬高。确保在切片过程中基底或载板均不接触刀槽。</li>
		<li>使用注射器或移液器调节刀槽中的水位。通过双目镜观察，添加或移除水，直至整个水面区域均匀反射超薄切片机的顶部照明光源。</li>
		<li>打开超薄切片机的底部光源。确保通过手轮将臂部置于中间位置而非回缩位置。将刀具移近样品，直至在切面上可见刀刃的反射。</li>
		<li>使用超薄切片机的调节功能对样品与刀具进行对齐。首先旋转刀具，然后旋转并倾斜样品。 
		注意：若在样品与刀具之间的间隙中可见的光条边缘平行（呈直的平行线而非楔形），则表示已正确对齐。</li>
		<li>检查样品的倾斜度：上下移动样品时，确保光条不会变宽或变窄。如有需要，使用弧形调节螺丝进行校正。将刀具移近样品，直至刚好位于切面上方（但不接触）。</li>
		<li>在控制单元上设定切片厚度（进给量）、切片速度和切片窗口。</li>
		<li>开始切片。如有必要，等待第一整片被切出。切出若干切片以确保它们能粘连成条带（否则需重新涂胶）。初始使用较高的进给值（最大值，Ultra刀为200 nm），直至第一整片被切出，然后设定所需的进给值。为获得足够的条带稳定性，建议从100 nm切片厚度和1 mm/s切片速度开始。最低可实现的切片厚度约为60 nm，具体取决于样品质量。</li>
		<li>停止切片。使用睫毛/猫毛清除刀刃和刀槽中所有不需要的（部分切出的）切片。若水中漂浮大量细小碎屑，可用移液器完全吸出水并注入新鲜水。此时即可开始第一条有效条带的收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>开始切片。当切出一定数量的切片（具体数量取决于切片和基底的尺寸）后，停止切片过程，并用睫毛14或更佳地，用猫毛极柔软的毛发轻轻拂过刀刃，使条带从刀刃上释放。</li>
		<li>用睫毛操纵（推/拉）条带，使其朝向基底移动，并将第一片切片贴附到基底上。 
		注意：需轻轻推动条带，直至其粘附到基底的干燥区域。</li>
		<li>继续切片并将条带贴附到基底上。从一侧开始，逐条逐渐移向另一侧。 
		注意：避免剧烈的水流动，以防已贴附的条带松动。气流同样需避免。使用超薄切片机配备的防呼吸罩。在不利环境条件下，建议使用超薄切片机的封闭罩15。</li>
		<li>当基底完全被条带覆盖（通常可容纳4–5条条带）后，使用基底 holder 的微操纵螺丝将基底从刀槽中轻轻取出。 
		注意：合适的操作方式包括：垂直提升（螺丝1）和旋转/倾斜取出（螺丝3），或两者结合。</li>
		<li>在无尘环境中让条带阵列干燥。干燥后，应尽快将粘合固定的基底从载板上取下（最好在同一天完成，否则基底可能因过紧而难以取下，甚至在拆卸时破裂）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. LM 成像的染色
注意：可采用不同的染色/标记方法，包括免疫荧光实验方案。此处选择一种直接且特异性较低的染色方法以显示细胞壁轮廓。
<ol>
	<li>碘化丙啶染色
	<ol>
		<li>用保鲜膜覆盖大型玻璃培养皿（直径30 cm）底部，并在培养皿边缘贴上湿润的纸巾以构建一个湿润的染色环境。</li>
		<li>每张盖玻片使用约300–500 µL溶液。在保鲜膜上为每张盖玻片滴加一滴溶液，然后将盖玻片倒扣在液滴上，使组织切片与染色液接触。盖上培养皿，并用铝箔包裹以避光。在4 °C条件下孵育16小时。</li>
		<li>用镊子取下盖玻片，将其在装有80 mL蒸馏水的100 mL烧杯中上下移动进行清洗。再换一个装有新鲜蒸馏水的烧杯重复此步骤。用压缩空气小心吹干盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在 FLM 中记录图像堆栈
<ol>
	<li>将盖玻片放置在普通宽场荧光显微镜（FLM）的载物台上。</li>
	<li>选择适合待观察荧光的滤光片组（材料表）。</li>
	<li>使用合适的物镜，对每个区段中的样品成像：尽量充满整个视野，并保持方向一致。对于根尖样品，使用了40倍空气物镜。 
	注意：如果切片带不够平直，可在成像时使用可旋转载物台重新调整方向。如果可能，应将图像中心对准某一特定结构，或使切片边缘等特征与所记录图像边缘保持相等距离。</li>
	<li>如条件允许，使用16位图像以减少像素饱和，并保持曝光时间恒定。</li>
</ol>
4. FLM 图像堆栈的配准
<ol>
	<li>将图像序列作为虚拟堆栈导入 Fiji16。</li>
	<li>从文件菜单中打开一个新的 TrakEM17（空白项目）。</li>
	<li>在图像区域中右键单击，并将堆栈以&#34;每层一张切片&#34;的方式导入 TrakEM。</li>
	<li>对齐各层（在图像区域中右键单击），设置范围（从第一张到最后一张图像），并选择“无”作为参考图像。所有参数均使用默认值，并选择“刚性变换”作为所需的变换模式。</li>
	<li>当配准完成且结果满意后，通过右键单击并选择“导出”来保存对齐后的数据集。生成平面图像，设置范围为从第一张到最后一张图像，并让软件显示生成的堆栈。将该堆栈以 tif 格式保存。</li>
</ol>
5. 扫描电镜成像的染色与封片
注意：配制染色溶液请参见材料表。溶液可置于 4 °C 避光密封保存，最长可达 12 个月。
注意：柠檬酸铅和醋酸铀酰含有有毒的重金属。操作时应佩戴手套，并根据当地主管部门的指示处理废弃物。
<ol>
	<li>用石蜡膜覆盖一个大玻璃培养皿（直径 30 cm）的底部，并在培养皿边缘贴上湿润的纸巾，以构建一个保湿室。 
	注意：必须在培养皿内靠近染色液滴的位置放置数粒 NaOH 颗粒，以防止柠檬酸铅过度沉淀。</li>
	<li>醋酸铀染色
	<ol>
		<li>将醋酸铀溶液在 2,680 × g 离心数秒，以沉淀其中的微小颗粒。</li>
		<li>每张盖玻片使用约 300–500 µL 溶液。在石蜡膜上为每张盖玻片滴加一滴溶液，然后将盖玻片倒扣于液滴上，使切面与染色液接触。</li>
		<li>室温孵育 10 分钟，染色期间需盖上培养皿。</li>
		<li>用镊子取下盖玻片，并将其在盛有蒸馏水的烧杯中上下移动进行清洗（见步骤 2.1.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柠檬酸铅染色
	<ol>
		<li>在醋酸铀染色孵育期间，配制柠檬酸铅溶液。 
		注意：柠檬酸铅在使用前必须立即过滤，以去除任何沉淀物。此外，还需像步骤 5.2.1 一样，在 2,680 × g 离心数秒。</li>
		<li>每张盖玻片使用约 300–500 µL 溶液。在醋酸铀染色后的清洗前，立即在石蜡膜上为每张盖玻片滴加一滴溶液，然后将盖玻片倒扣于液滴上，使切面与染色液接触。在清洗盖玻片前，立即在石蜡膜上放置液滴（300–500 µL）。 
		注意：为避免沉淀形成，切勿向柠檬酸铅液滴呼气。</li>
		<li>将清洗后的盖玻片倒扣于液滴上（无需干燥）。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟，染色期间需盖上培养皿。</li>
		<li>用镊子取下盖玻片，并如上所述在盛有新鲜水的烧杯中清洗（步骤 5.2.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用压缩空气小心地将盖玻片吹干。</li>
	<li>用于 SEM 成像的样品制备
	<ol>
		<li>使用粘性碳垫将硅晶片固定在铝制样品台上。 
		注意：ITO 涂层盖玻片可使用银浆和铜胶带固定——确保导电表面与样品台连接；也可如上所述使用碳垫。此时，可通过滴加一滴银浆实现 ITO 表面与样品台之间的导电连接。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 扫描电镜中的分级成像
注意：在场发射扫描电镜中，应选择较低的加速电压（3 kV 或更低）、束流范围为 50 至 800 pA 以避免样品充电，并选择合适的工作距离以高效收集二次电子和/或背散射电子。束流的选择取决于样品特性（例如，包埋树脂）；电子剂量需在小束流（对样品损伤较小）和大束流之间权衡，后者有利于提高成像速度，从而缩短总图像采集时间。专用的背散射电子探测器可提供良好的对比度，对样品充电较不敏感，且能减少样品表面伪影（如褶皱、刀痕）的显现。应调节对比度和亮度，使直方图居中。
<ol>
	<li>扫描电子显微镜成像
	<ol>
		<li>首先，在约100倍的低倍率下拍摄阵列四个角的图像，以确定阵列的四个角点。创建一个包围整个阵列的感兴趣区域（ROI）。设定成像协议，参数如下：使用二次电子（SE）探测器，以实现大像素尺寸（例如1,000 nm）和短停留时间（例如0.2 µs）下的高速成像。 
		注意：为克服在大扫描视野（FOV）下可能出现的电子光学限制（可能导致图像边缘失真），请使用专用的低倍率模式（大多数扫描电镜制造商提供），或采用中等倍率，以1至2 k的扫描视野获取单张图像。</li>
		<li>通过创建一个仅勾勒出第一张切片中组织区域的兴趣区（ROI），生成一组切片。使用印章工具将其复制到后续所有切片中。根据需要旋转ROI，以适应弯曲的切片带。</li>
		<li>使用中等像素尺寸（约 50 nm）和足够长的停留时间来记录图像序列，以便识别和辨认目标结构。单幅图像的视场范围应为 6–10 k 像素。 
		注意：Atlas 5 软件可自动采集由相邻图像组成的拼接图，以覆盖连续切片中较大的 ROI/切片区。</li>
		<li>在此区域设置内创建一个包含目标结构的位点集，用于更高分辨率的SEM成像。确保感兴趣区域（ROI）足够大，以补偿样品台的定位精度误差。检查并调整各站点的位置。 
		注意：放置感兴趣区域（ROIs）时，必须确保将用于自动对焦和自动消像散的中心位置避开 &#34;空&#34; 无结构细节的材料， 例如，液泡。</li>
		<li>定义自动对焦设置，并至少在一条带状区域的长度范围内检查其性能即，即载物台需要移动的最长距离）在将要成像区域附近的较小ROI上。</li>
		<li>为高分辨率扫描电镜成像设定成像参数。为观察膜结构，选择3–5 nm的图像像素尺寸。根据检测器选择合适的停留时间，以确保图像噪声不过大。</li>
		<li>开始采集前，使用检查程序选项对每条带的第一个切片至少定义一次聚焦值。</li>
		<li>在整组目标感兴趣区域（ROIs）上启动自动扫描电镜成像。</li>
		<li>将获取的数据导出为图像序列，建议采用 tif 格式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 扫描电镜图像堆栈的配准
<ol>
	<li>将图像序列作为虚拟堆栈导入 Fiji。 
	注意：根据切片数量和感兴趣区域（ROI）的大小，这些数据文件可能达到几 GB 的大小。</li>
	<li>将 SEM 图像堆栈裁剪至尽可能接近目标结构的区域，以供后续处理，并调整亮度和对比度。</li>
	<li>从文件菜单中打开一个新的 TrakEM17（空白项目）。</li>
	<li>在图像区域中右键单击，将堆栈以&#34;每层一个切片&#34;的方式导入 TrakEM。</li>
	<li>对齐各层（在图像区域中右键单击），选择“最小二乘法”作为模式，设置范围（从第一张图像到最后一张），并选择“无”作为参考图像。参数设置使用默认值，并选择“刚性变换”作为所需的变换类型。</li>
	<li>当配准完成且结果满意后，通过右键单击并选择导出，保存对齐后的数据集。生成平面图像，设置范围为从第一张到最后一张图像，并让软件显示生成的堆栈。将该堆栈以 tif 格式保存。</li>
</ol>

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</ol>

KIT已从Boeckeler Instruments获得报销，用于提供基底支架的功能模型。Marlene Thaler是ZEISS Microscopy GmbH的员工，该公司是本文所提及显微镜系统的制造商。此外，ZEISS还提供某些解决方案，例如ZEISS Atlas解决方案包，适用于SEM和FIB-SEM仪器的大面积、三维成像的多种应用。其余所有作者均无任何利益冲突需要披露。

通过多模态分层AT技术实现组织内特定细胞靶向的工作流程如下：将树脂包埋的样品切割成一系列连续切片，并使用定制设计的基底支架将其放置在导电基底上。在使用荧光染料标记并在FLM中成像后，利用重建的体积图像选择目标细胞。随后通过多轮重金属染色以引入对比度，再使用自动化软件平台在扫描电镜（SEM）中对数百个连续切片进行纳米级分辨率成像，从而对这些目标细胞进行高分辨率观察。
要制备包含多条长切带的紧密排列阵列，需要使用类似于本文所述的基底支架。技术熟练且有耐心的操作者或许能够将多条切带连接到部分浸没于刀槽液体中的硅基底上，并通过逐渐降低液面高度，使切带最终停留在基底表面，从而获得阵列。然而，根据我们的经验，当基底接触刀槽任何部位时，容易导致切带碎裂（参见实验方案中1.3.2节的注释）。此外，该操作在ITO镀膜基底上更为困难：（1）由于ITO玻璃具有透明性，难以观察到液体边缘，而切带末端需准确附着在此处；（2）由于ITO镀膜表面远比高度抛光的硅晶圆粗糙，在提起过程中切带容易断裂，产生仅含少数几段的较小碎片并漂浮于液面，从而破坏切片的有序排列。
整个工作流程即使不与荧光显微镜（FLM）数据关联也是可行的。在这种情况下，扫描电镜（SEM）中的数据采集可能需要分多次会话完成。初步的三维重建或至少对低分辨率或中等分辨率数据的评估可能是识别目标区域所必需的。此外，也可应用常规的明场光学显微镜（LM）组织学染色方法（无需使用FLM）。当然，其他可选方案6,7,8还包括在切片阵列上进行抗体标记（如AT初始研究中已展示的那样18），或使用基因编码的荧光蛋白（XFPs），或在包埋前进行荧光保留的标记处理。
所讨论方法的一个普遍局限性在于使用了特定厚度的切片，从而导致对三维体积进行离散采样：Z方向的分辨率仅能与切片厚度相当，因为扫描电镜（SEM）仅收集来自切片表面的数据（取决于所选的初级能量/着陆能量）。这意味着所获得的三维体积具有各向异性的体素。 例如，5 × 5 × 100 纳米3 若使用100 nm的切片厚度和5 nm的图像像素尺寸，则对于尺寸小于1 µm的微小结构，可能不足以实现真正的超微结构描述。另一个技术上的限制是扫描电镜（SEM）中用于自动成像的样品台精度。因此，必须选择大于样品台精度规格的感兴趣区域（ROI），以确保整个目标区域被完整成像。
与SBF-SEM和FIB-SEM等块面成像方法相比，相关联的AT具有体素各向异性的明显缺点，如上所述。在实施适当的漂移校正后，FIB-SEM可获得5 × 5 × 5 nm3的各向同性体素。
在制备切片阵列过程中，由于切片丢失导致重建体积中出现空缺，这可能是ATUM-SEM面临的一个问题，而SBF-SEM或FIB-SEM则不存在此类问题。通过胶水对切片条带进行良好固定后，通常仅最后一片切片会受到影响：使用睫毛工具从刀刃上释放切片时可能造成损伤。然而，根据我们的经验，每20至50个切片中丢失一个切片并不会影响图像配准。
另一方面，阵列的后期染色可能性为扫描电镜成像提供了良好的信号和对比度，即使对于金属化程度较低的样品（如此处所示的高压冷冻根尖）也是如此。因此，无需通过多次化学固定和金属化步骤来牺牲最优的超微结构保存效果。此外，来自病理实验室中具有中等金属化程度的常规样品也能获得优异的数据。10这种浸渍后染色增强对比度的方法通常不适用于SBF-SEM和FIB-SEM。此外，由于这些方法具有破坏性， 即，成像过程中会消耗样品，因此无法进行不同分辨率和位点的分级成像，或在后续时间点进行重复成像。原则上，由大视场（FOVs）组成的无限体积例如，对于连接组学中的完整小鼠大脑而言，可达到数毫米的范围，通过拼接马赛克图像实现；同时，采用AT技术可获取大量连续切片，而在FIB-SEM中，常规仪器难以实现超过100 µm × 100 µm的视场。
进一步实现所述AT工作流程的自动化将具有明显优势，因为上述的SBF-SEM和FIB-SEM方法均能在同一仪器内以完全自动化的方式完成切片与成像。目前已有某种形式的切片自动化：ATUMtome12能够生成并收集数千张切片，但使用聚酰亚胺（Kapton）胶带作为基底使得此类切片阵列难以在荧光显微镜（FLM）下成像。而在本研究中使用的ITO涂层盖玻片上，甚至有望实现超分辨率成像。另一个非常理想的自动化目标是FLM数据堆栈的采集。另一方面，自动化设备可能成本较高；而本文所介绍的工作流程（在硬件方面）除基底支架外，仅依赖常规电镜实验室或核心设施中通常配备的仪器，因此具有较低的准入门槛。

为在超微结构分辨率下重建大体积组织，已采用多种基于扫描电镜（SEM）的成像方法1：可获取全面的综述文章 例如用于 SBF-SEM2，聚焦离子束-扫描电子显微镜3和阵列断层扫描（AT）4虽然后一种方法能将样品材料以一系列连续切片的形式保留在基底上，但SBF-SEM和FIB-SEM属于破坏性方法，直接作用于样品块并在成像过程中消耗样品。由于树脂在扫描电镜中会产生电荷积累，这些方法还依赖于经过强金属化处理的样品块。5.
另一方面，在组织样本中识别特定细胞或感兴趣结构时，尤其可受益于相关联的光学显微镜与电子显微镜技术（correlative light and electron microscopy, CLEM）6,7,8。由于大量重金属会淬灭荧光信号，因此在使用荧光显微镜（FLM）进行定位时，无法应用大量重金属染色9。对于此类仅含少量重金属的样品，切片阵列电子显微镜技术（AT）是首选方法，因为在完成光学显微成像后，可轻易对切片阵列进行重金属后染色。此外，几乎任何类型的样本均可用于AT技术，甚至包括病理学家常规存档样本中的组织材料10。
AT的另一个显著优势在于其具备层级化潜力11 或多分辨率成像12：无需以高分辨率对所有内容成像，因为目标可在不同成像模式下选定例如，FLM）或低分辨率扫描电镜图像中。仅对组织或细胞群体中感兴趣的区域进行高分辨率成像，可节省数字数据存储空间，并生成更小的图像数据集，便于后续处理。此处通过一个金属化程度较低的样品展示AT工作流程：高压冷冻的植物根尖拟南芥) 包埋于亲水性树脂中。
详细说明了在荧光显微镜（FLM）和扫描电镜（SEM）中如何制备、染色和成像阵列，以及如何对图像序列进行配准。同时，图示了如何利用FLM体积数据的三维重建来选择特定细胞，进而在SEM中以纳米级分辨率对其进行成像。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>RMC</td><td>PT-PC</td><td>替代型号：Leica UC7</td></tr><tr><td>基底夹持器</td><td>RMC</td><td>ASH-100</td><td>替代方案：自制</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Diener</td><td>Zepto 40kHz</td><td>替代产品：Ted Pella Pelco 或其他台式等离子清洗仪&lt;br/&gt; Diener Zepto 配 40kHz 发生器（0–100W）的示例参数：0.5 mbar，5 sccm（空气），10% 功率&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>宽场荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer.Z1</td><td>替代型号：&lt;br/&gt; Leica、Nikon、Olympus</td></tr><tr><td>荧光滤光片组</td><td>Zeiss</td><td>43 HE（Cy3/DsRed）</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Neofluar 40x</td><td>&amp;nbsp;0.75 数值孔径</td></tr><tr><td>可处理 GB 级图像数据的高性能工作站</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>场发射扫描电镜（FESEM）</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td>替代型号：FEI、Jeol、Hitachi、TESCAN</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;切片&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>Plano</td><td>T585-V</td><td></td></tr><tr><td>用于修块 45&amp;deg; 的金刚石刀</td><td>Diatome</td><td>DTB45</td><td></td></tr><tr><td>用于修块 90&amp;deg; 的金刚石刀</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td></td></tr><tr><td>用于切片的大尺寸金刚石刀</td><td>Diatome</td><td>DUJ3530</td><td></td></tr><tr><td>硅片（片状）</td><td>Si-Mat</td><td>定制</td><td>掺杂类型：P/Bor，晶向：&amp;lt;100&gt;，厚度：525 &amp;plusmn; 25 &amp;micro;m，电阻率：1–30 &amp;Omega;-cm&lt;br/&gt; http://si-mat.com/silicon-wafers.html</td></tr><tr><td>ITO 涂层盖玻片</td><td>Balzers</td><td>型号 Z</td><td>22 &amp;times; 22 &amp;times; 0.17 mm&lt;br/&gt; https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html</td></tr><tr><td>铝制载具</td><td>定制</td><td></td><td>76 &amp;times; 26 mm</td></tr><tr><td>硅片镊子</td><td>Ideal-tek</td><td>34A.SA</td><td></td></tr><tr><td>样品台镊子</td><td>Dumont</td><td>0103-2E1/2-PO-1</td><td>Dumoxel-H 2E 1/2</td></tr><tr><td>金刚石划片刀</td><td>Plano</td><td>T5448</td><td></td></tr><tr><td>睫毛/极软猫毛</td><td>自制</td><td></td><td>替代品：Plano</td></tr><tr><td>刷子</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pattex 接触胶</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td>强力胶 Classic（淡黄色）</td></tr><tr><td>Fixogum 胶</td><td>Marabu</td><td>290110001</td><td>用于固定基底至载具</td></tr><tr><td>胶带</td><td>3M</td><td>851</td><td>用于固定基底至载具</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Bernd Kraft</td><td>07029.4000</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Carl Roth</td><td>4436</td><td>胶混合物的稀释剂</td></tr><tr><td>Rotihistol</td><td>Carl Roth</td><td>6640</td><td>替代品，柠檬烯基稀释剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像处理</td><td>开源</td><td>Fiji（http://fiji.sc/#download）</td><td></td></tr><tr><td>图像采集</td><td>Zeiss</td><td>Atlas 5 AT&lt;br/&gt;（Zeiss 扫描电镜模块）</td><td>自动图像采集替代方案：WaferMapper：https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>储存液：1.5 mM 溶于 0.1% 叠氮化钠</td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Science Services</td><td>E22400</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铅(II)</td><td>Merck</td><td>107398</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠</td><td>Merck</td><td>106448</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>Merck</td><td>106469</td><td></td></tr><tr><td>1M 氢氧化钠溶液</td><td>Bernd Kraft</td><td>01030.3000</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Duran</td><td>23 755 56</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;安装&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>样品台</td><td>Plano</td><td>G301F</td><td></td></tr><tr><td>碳垫</td><td>Plano</td><td>G3347</td><td></td></tr><tr><td>铜导电胶带</td><td>Plano</td><td>G3397</td><td>双面粘附，导电</td></tr><tr><td>银导电漆</td><td>Plano</td><td>G3692</td><td>Acheson Elektrodag 1415M</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;溶液/混合物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于包埋块涂覆的粘合剂混合物</td><td></td><td></td><td>Pattex 接触胶 / 二甲苯（稀释剂），比例 1:3。&lt;br/&gt;（二甲苯替代品：Rotihistol）</td></tr><tr><td>Reynolds 柠檬酸铅溶液</td><td></td><td></td><td>50 mL：&lt;br/&gt; 将 1.33 g 硝酸铅(II) 溶于 10 mL 去离子水（dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）中。&lt;br/&gt; 将 1.76 g 三水合柠檬酸钠溶于 10 mL 去离子水（dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）中。&lt;br/&gt; 将两者混合，并逐滴加入 1 M 氢氧化钠溶液直至溶液澄清。&lt;br/&gt; 用去离子水（dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）定容至 50 mL。</td></tr><tr><td>碘化丙啶染色液</td><td></td><td></td><td>将储存液用去离子水（dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）稀释 1500 倍。&lt;br/&gt; 涡旋振荡以充分混匀。</td></tr><tr><td>水溶性醋酸铀酰</td><td></td><td></td><td>将 3% 醋酸铀酰溶于去离子水（dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）中（充分混匀）。</td></tr></tbody></table>

大体积样本中连续切片的多模态分层成像以定位特定细胞靶标

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

在混合细胞群体或组织中，通过结合光学显微镜与电子显微镜的层级成像方法，可实现对特定细胞的超微结构分辨率靶向定位。将树脂包埋的样品切割成阵列，该阵列由数百个超薄切片组成的切片带构成，并沉积在硅片或导电涂层盖玻片上。使用数码消费级设备（如智能手机相机）或光学显微镜（LM）对这些阵列进行低分辨率成像，以快速获得大范围的整体视图；若使用荧光染料标记，则可采用宽场荧光显微镜（荧光光学显微镜（FLM））进行成像。经重金属后染色后，阵列可在扫描电子显微镜（SEM）中成像。若存在荧光标记，可通过FLM生成的三维重建图像选择目标区域；若无荧光标记，则可根据SEM图像堆栈在中等分辨率下生成的三维重建图像进行目标选择。对于超微结构分析，最终在SEM中以高分辨率（图像像素为数纳米）记录选定的目标区域。本文展示了一种可适配于任意超薄切片机的切片带操作工具，有助于阵列制备以及从切片刀槽中移除基底。同时讨论了一个可在SEM中实现阵列自动成像的软件平台。与其他生成大体积电镜数据的方法（如连续块面扫描电镜（SBF-SEM）或聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM））相比，该方法具有两个主要优势：（1）树脂包埋的样品得以保存（尽管已被切片），可进行多种染色处理，并以不同分辨率反复成像；（2）由于切片可进行后染色，因此无需在样品制备阶段对组织块进行强重金属块染以提供SEM成像对比度或使组织块具备导电性。这使得该方法适用于多种材料和广泛的生物学问题，尤其适用于预先固定过的材料（e.g. 来自活检样本库和病理学实验室的样本），可直接进行树脂包埋并实现三维重建。

此处描述的工作流程（图1）始于包埋在树脂块中的样品。在样品制备过程中，应将某些重金属引入组织中，但无需使用针对较强金属化效果优化的方案。图1A 显示的是用1% OsO4 和1%醋酸铀酰常规块染的植物根（水芹）样品，而 图1B 中的拟南芥（Arabidopsis）根仅使用0.5%醋酸铀酰进行弱金属化处理。后者这类样品最适合用于关联成像方法，因为某些重金属容易淬灭荧光信号。使用专用的基底 holder（图2），可制备出包含数百个切片的阵列（图1C）。经荧光标记后，此类阵列首先在标准的宽场荧光显微镜（FLM）中成像（图1D），随后用重金属溶液染色，并在扫描电镜（SEM）中以不同分辨率进行成像（图1E-G）。
用于可重复地制备阵列的重要工具，特别是在将切片机刀槽中的多条带转移至基底时，包括基底支架（图2A，由作者实验室自行设计）和带有足够大槽体以容纳显微镜载玻片的Jumbo金刚石刀（图2B）。必须形成平坦的弯月面，以便良好观察条带，这可通过等离子体清洗基底实现：在基底上滴加少量蒸馏水后，不应形成类似透镜的结构（如图2C所示的未处理基底），而应形成一层均匀的薄膜（如图2D所示的等离子体活化基底）。在此条件下，附着于ITO涂层盖玻片干燥区域的条带可被清晰观察（图2E），并在将基底从水中提起的过程中进行观察与控制。
例如，使用碘化丙啶染色以标记植物细胞壁的阵列，采用标准的宽场荧光显微镜进行成像（图 3A）。由于切片仅厚100 nm，即使如图所示出现过度染色，引入的模糊也极轻微。完成配准后，从图像堆栈中选取了在重建体积内完全包埋的两个细胞。图3B）用于三维高分辨率成像（另见 补充视频 S1）。经醋酸铀和柠檬酸铅进一步染色后，使用扫描电镜对样品进行成像。 图3C 显示了使用60 nm图像像素记录的概览图；图像中央的暗色方块表示自动对焦功能执行的位置，额外的剂量导致了轻微污染。随后，对连续切片中选定的适当感兴趣区域（共435个切片中的第51至248切片），这些区域包含在FLM图像栈中选定的两个目标细胞，以5 nm图像像素大小进行记录（图3D；另请参见 补充视频 S2).
本文所述在扫描电镜中对样品阵列进行自动分层成像，是使用蔡司 Atlas 5 软件/硬件平台完成的。首先，利用二次电子（SE）探测器对整个阵列进行概览成像，采用非常大的图像像素（1,000 nm）和极短的停留时间（图 4A）。随后，在第一张切片上划定仅包含组织区域的兴趣区（ROI），并将其传播至阵列中所有其他切片。接着，使用较长的停留时间，以 60 nm 的图像像素尺寸对这一组切片进行成像（图 4B）。最后，设置一个位点集，包含两个目标细胞以及一圈周围的细胞（以补偿载物台定位误差），其成像参数如下：能量选择性背散射电子（ESB）探测器，图像像素为 5 nm，停留时间极长（40 µs）（图 4C）。将此类图像进一步放大，可观察到亚细胞结构细节（图 4D），例如液泡（V）、线粒体（M）、细胞核（N）以及内质网（箭头所示）。另请参见补充视频 S3，其中展示了从整个阵列的概览图像逐步放大至单个目标细胞的亚细胞结构细节的过程。
此处展示的样品（200个切片）加上另一组250个切片，制备耗时约8小时，LM染色需一个晚上，FLM下手动记录需一天时间。后续染色步骤总共需要约1–2小时，具体时间取决于独立样品阵列的数量。对于SEM记录，设置Atlas运行需数小时；以中等分辨率（像素尺寸60 nm）对200个切片（450 × 200 µm2）进行自动记录耗时3–4小时，而对包含两个目标细胞的高分辨率区域（像素尺寸5 nm，200个切片，55 × 30 µm2）进行记录则约需5天。需要注意的是，由于本实验所展示样品的金属含量较低，必须采用极慢的扫描速度以获得良好的信噪比，这意味着在当前使用的探测器条件下，高分辨率区域的停留时间为40 µs。
整个工作流程中有多个步骤容易出现问题：理想情况下，切带应尽可能平直并按正确顺序排列（图5A）。然而，实际中常出现弯曲（图5B）、弧形（图5D）甚至断裂的切带。这可能是由于修块不当（前后边缘不完全平行）、胶水涂抹不均匀，或样品本身存在不对称性或渗透不均所致。尤其棘手的是同时包含柔软和极硬组分的样品。后者可能难以充分渗透，例如本研究中所示的植物根部细胞壁（图5C）。在此情况下，切片过程中因压缩和回弹程度不同，容易产生褶皱（箭头所示）。对于在扫描电镜中进行自动成像而言，弧形切带并非严重问题，因为可通过旋转感兴趣区域（ROI）以适应切带的曲率。
实验方案中的另一个关键步骤是染色：洗涤不充分可能导致切片上残留杂质（图5E，F），在最坏的情况下，会覆盖最有趣的区域（其中一个靶细胞上的圆形区域） 图5F）。此外，灰尘（图5D，引入刀舟中的强光散射颗粒） 例如，使用被污染的基底载体可能会导致严重问题：在荧光显微镜下，灰尘可能具有强烈的荧光（参见某些切片中的情况） 补充视频 S1）到如此程度，以至于某些配准算法无法运行。TrakEM 中的“align”功能17 然而，可以处理此类堆栈，如所示 补充视频 S1.
<img alt="样品制备至扫描电镜：树脂包埋、切片、光学显微镜观察、扫描电镜成像流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：相关联的多层次成像工作流程。 从包埋在树脂块中的样品开始（A，强金属化样品），首先对样品进行修块（B，弱金属化样品），然后使用超薄切片机切出包含多条连续切片带的阵列（C），此处放置于ITO涂层盖玻片上。经荧光染料染色后，在宽场荧光显微镜（FLM）中采集图像堆栈（D）。经过进一步的重金属盐染色后，在扫描电镜（SEM）中以不同分辨率（像素尺寸）对样品进行成像（E-G）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="切片过程设置、硅藻刀片、切片；光学显微镜图像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：阵列制备工具。 由具有七个运动轴的显微操作器组装而成的基底夹具，安装在标准超薄切片机上（A）：用圆圈标出的螺丝用于基底载体的垂直（1）和水平（2）移动以及倾斜（3）。大尺寸金刚石刀配有加大型舟槽，可容纳大尺寸基底（箭头所示），图中为一块等离子体活化后的硅片安装在载玻片大小的铝制载体上（B）。将 20 µL 去离子水液滴置于未经处理的硅片基底（C）或等离子体活化后的基底（D）上。四条切片带漂浮于刀槽中，其底端附着于镀有氧化铟锡（ITO）的盖玻片上。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="根细胞结构显微图像；不同尺度下的荧光显微图像和电子显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：光学显微镜（LM）数据与扫描电镜（SEM）数据的相关性。 使用荧光显微镜（FLM）（A、B）和扫描电镜（SEM）（C、D）记录的概览图（A、C）和目标细胞图像（B、D）。其中（B）为软件放大图像，原始数据使用40倍物镜在1,388 × 1,040像素的相机芯片上采集；而（C）的图像像素尺寸为60 nm，（D）为5 nm，展示了扫描电镜中实际分辨率的提升。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="纳米结构显微分析；显示切片和成像放大倍数层级的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用 ZEISS Atlas 5 AT 在扫描电镜（SEM）中进行层级成像。 使用 1,000 nm 图像像素通过二次电子（SE）探测器记录的阵列概览图（A）。在每张切片中将感兴趣区域（ROI）置于组织上，并以 60 nm 图像像素记录的切片组（B）。在目标细胞上连续放置感兴趣区域并以 5 nm 图像像素记录的位点组（C）。当放大至此类高分辨率图像时（D），细胞内膜性结构（如液泡（V）、细胞核（N）、线粒体（M）和内质网（箭头））变得清晰可见。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="应力下的光学涂层：裂纹形貌、扫描电镜分析、微观结构完整性图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57059/57059fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：常见问题。 1. 来源于切片过程：置于ITO涂层盖玻片上的切片带应尽可能平直（A），但切片过程中不规则的压缩可能导致弯曲（B）或弯曲的带状结构（D），甚至折叠（folds）C。2. 由在水中操作底物和带材引起， 例如，切片和染色过程中：基底上的光散射颗粒（D），切片上液滴边缘（圆圈内 E），或染色后洗涤不充分导致组织上残留污渍扩散（F). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/57059fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充视频 S1：FLM 图像序列。 使用 TrakEM17 在 Fiji16 中对齐的 435 张图像，并保存为视频文件（.avi）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS1.avi">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S2：扫描电镜图像序列。 使用 TrakEM17 在 Fiji16 中对齐的 210 张图像。该数据集的原始图像序列（300 张图像）大小为 15 GB。为将对齐并裁剪至仅包含两个目标细胞后的图像序列从 3.3 GB 缩减体积，使用 Fiji 将其在 x 和 y 方向上按 0.2 倍进行缩放，然后保存为 .avi 视频格式。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS2.avi">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 S3：在扫描电镜中以不同分辨率级别进行缩放。 该视频在 Atlas 5 软件中创建并以 .mp4 格式导出。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57059/WackerJoVE_movieS3.mp4">请点击此处下载该文件。</a>

本方案旨在利用扫描电子显微镜（SEM）对组织中特定细胞进行纳米级分辨率的成像。首先在光学显微镜下对来自树脂包埋生物样品的大量连续切片进行成像，以识别目标区域，随后以逐级放大的方式在扫描电子显微镜中进行成像。

在混合细胞群体或组织中，通过分层成像技术可在超微结构分辨率下靶向特定细胞。

该工作流程的总体目标是利用光学显微镜在组织中定位特定目标结构，进而通过扫描电镜（SEM）对其进行高分辨率的三维超微结构成像。本文介绍的成像工作流程有助于回答细胞生物学、发育生物学、神经科学乃至病理学等多个领域中有关细胞或组织超微结构的关键问题。该技术的主要优势在于其基于阵列断层成像（array tomography）原理：将组织切割成连续切片阵列后，即使目标结构最初深埋于原始样品内部，也能够被轻松识别。阵列断层扫描技术最初是在神经科学领域提出的，但也可应用于多种其他系统，包括细菌、植物、动物，甚至病理学环境下的患者样本。对于初次接触该方法的研究人员而言，由于连续收集大量超薄切片极为困难，因此可能面临较大挑战。若缺乏额外的技术支持，可能会导致切片丢失或切带排列紊乱。使用固定在牙签上的几根毛发制成的小刷子，将粘合剂混合物仔细涂覆在预先修整好的样品块的前侧和后侧。此步骤需快速完成，因为该混合物中的溶剂在数秒内即会挥发。在样品干燥的同时，将硅晶片切割成适合放入刀槽的大小，并用金刚石刻划笔进行标记。然后，使用异丙醇和无尘纸手动清洁硅片。使用可移除胶粘剂将基底固定在载片板的一端。固定后，利用空气辉光放电对基底进行等离子体活化，以获得亲水性表面。将安装好基质的载片靠近刀刃，插入基质夹持器的夹具中。接着，将大型金刚石刀插入刀架，并将刀具间隙角设为零度。然后，用蒸馏水填充刀槽。将刀片移近，使其距离样品一到两毫米。然后，使用基底夹持器的螺丝一至三将基底缓缓降入水中。检查水线是否位于基底的上三分之一处。由于使用硅片时难以观察到离地间隙，应降低基底直至感觉到其接触地面，然后将基底略微抬高。确保在切割过程中，基底和载体均不会触碰到刀舟。接下来，使用注射器或移液器调节舟槽中的水位。在通过双目镜观察的同时，添加或移除水，直到水面整个区域均呈现出超薄切片机顶部光源均匀的反射光。一旦装置完成，即可开始对样品进行切片。当切出若干切片后，停止切片过程，用睫毛或极细的猫毛轻轻拂过刀刃，使切片带从刀刃上松脱。将切片带移向载物基底，并轻轻推动切片带的第一片，使其附着在基底的干燥区域。继续对样品进行切片，并将切片带依次附着到基底上。从基底的一侧开始，每次使用新的带状物时逐渐向另一侧移动。当基底表面完全被带状物覆盖后，使用基底夹持器的显微操作螺丝，轻轻将基底从刀槽中提起。让带状物阵列自然干燥，然后将其存放在无尘环境中。干燥后，尽快将带有黏合剂的基材从载片上取下。然后，按照随附的文字实验方案对样品进行光学显微镜染色，并进行成像。接着，对样品进行电子显微镜染色，并使用带黏性的碳垫将其固定在铝制样品台上。现在使用场发射扫描电子显微镜对这些阵列进行成像。为避免样品充电，应采用3 kV或更低的初级电子能量，以及50至800 picoamps之间的束流。当使用ITO镀膜玻璃盖玻片时，需用铜箔胶带和银导电漆将导电面与显微镜载物台连接。分层成像级联的第一步是以能够识别各个独立区域的方式生成阵列的概览图。首先，在约100倍的低倍率下拍摄每个角落的图像，以确定阵列的四个角点，然后创建一个覆盖整个阵列的感兴趣区域（ROI）。为该ROI分配一个成像方案，参数如下。使用二次电子探测器，以约0.2微秒的短停留时间进行高速成像。选择较大的图像像素尺寸和2000×2000像素的图块尺寸。结果图像噪声较大，但即便如此，仍可观察到切片内的组织结构。然后，通过创建一个感兴趣区域来生成一个切片区段，仅勾勒出第一张切片中的组织轮廓。使用图章工具将其复制到所有后续切片中。根据需要旋转感兴趣区域，以适应弯曲的切片带。将实验方案分配给最能显示组织亚结构的切片区域。此处采用的中间像素尺寸为 60 纳米，图块尺寸为 12000 × 12000 像素，驻留时间为 3.2 微秒。由于图像质量较差，另制备了一组包含少数特定细胞的切片，使用了更小的像素尺寸和更灵敏的检测器。现在可以非常清晰地识别出两个目标细胞。在包含目标结构的切片区段内创建一个位点集，用于更高分辨率的扫描电镜成像。将感兴趣区域设置得足够大，以确保能够适应阶段移动的精度要求。检查并调整位点的位置。当需要成像多个区域时，必须进行自动调谐。在放置感兴趣区域时，应确保其中心不落在无结构细节的空材料上，例如液泡。接下来，定义自动对焦设置，并在靠近成像区域的小范围区域内检查沿带状区域的成像性能。然后，为高分辨率扫描电镜成像设定成像方案。为观察膜结构区室，应选择三至五纳米之间的图像像素尺寸。根据探测器选择合适的停留时间，以确保图像噪声不过大。由于载物台需要在记录此区域和彼区域之间移动较长距离，因此需使用检查程序选项，至少对每条带的第一个区域定义聚焦值。然后启动全自动扫描电镜成像，覆盖所有目标兴趣区域的序列。完成时，将获取的数据导出为图像序列，建议采用 TIF 格式。将图像序列作为虚拟堆栈导入 Fiji。接下来，通过尽可能贴近目标结构裁剪区域，对堆栈进行裁剪以用于后续处理。此外，调整亮度和对比度，并保存图像栈。裁剪并优化后，从“文件”菜单中打开一个新的 TrakEM。在图像区域右键单击，将图像栈作为每层一个切片导入 TrakEM。通过右键单击，选择对齐图层。选择最小二乘法作为模式，将范围设置为从第一帧到最后帧，并选择无作为参考。接下来，选择默认设置值，并选择刚性作为所需的变换方式。当配准完成且结果满意后，通过右键单击并选择“导出”来保存对齐后的数据集。创建一幅平面图像，将范围设置为从第一幅到最后一幅图像，并让软件显示生成的图像栈。完成后，以 TIF 格式保存该图像栈。制备完成后，切片阵列表现为由多条连续切片组成的带状阵列。本图展示的是经碘化丙啶染色的拟南芥根尖的概览图。该样品的连续切片已按照实验方案中的描述进行对齐，并组合成一个三维图像，以单个视频文件的形式呈现样品的三维结构。此处可以看到两个目标细胞，后续将在扫描电镜（SEM）中以纳米级分辨率进行成像。在使用醋酸铀和柠檬酸钠进一步染色后，对这些阵列进行了电子显微镜成像。该静态图像显示了样本切片在第一轮成像中以20纳米分辨率获取，而在第二轮成像中则达到5纳米分辨率。在此，按照方案所述，将来自电子显微镜的210张连续图像进行了对齐和裁剪。该视频仅针对两个细胞，展示了细胞内液泡的三维排列方式以及它们之间的部分连接情况。此处所示扫描电镜中的阵列自动分层成像可实现不同分辨率水平下的无缝映射，从整个阵列的概览到亚细胞结构的细节均可呈现。在最高放大倍数下，可以分辨出液泡、线粒体、细胞核和内质网。一旦掌握技巧，若操作得当，可在数小时内将切片条带并排置于常规基底上。这可在同一基底上提供数百个切片用于成像。对如此大量的切片进行成像所需的时间可能因显微镜而异，尤其当您常用的成像仪器具有不同自动化水平时，差异更为明显。值得注意的是，该通用工作流程可轻松与其他成像技术结合使用，例如常规组织学染色甚至焰光分析，也可单独作为大体积组织结构成像的工具。该工作流程的另一个优势在于其易于获取和使用。初步研究无需额外工具或自动化设备，这意味着无需大量投入。观看本视频后，您将对工作流程有清晰的了解，并掌握如何利用多模态和分层成像技术，在不同分辨率下对大体积三维样本中的感兴趣结构进行定位与成像。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

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