大体积样本中连续切片的多模态分层成像以定位特定细胞靶标

该工作流程的总体目标是利用光学显微镜在组织中定位特定目标结构，进而通过扫描电镜（SEM）对其进行高分辨率的三维超微结构成像。本文介绍的成像工作流程有助于回答细胞生物学、发育生物学、神经科学乃至病理学等多个领域中有关细胞或组织超微结构的关键问题。该技术的主要优势在于其基于阵列断层成像（array tomography）原理：将组织切割成连续切片阵列后，即使目标结构最初深埋于原始样品内部，也能够被轻松识别。

阵列断层扫描技术最初是在神经科学领域提出的，但也可应用于多种其他系统，包括细菌、植物、动物，甚至病理学环境下的患者样本。对于初次接触该方法的研究人员而言，由于连续收集大量超薄切片极为困难，因此可能面临较大挑战。若缺乏额外的技术支持，可能会导致切片丢失或切带排列紊乱。

使用固定在牙签上的几根毛发制成的小刷子，将粘合剂混合物仔细涂覆在预先修整好的样品块的前侧和后侧。此步骤需快速完成，因为该混合物中的溶剂在数秒内即会挥发。在样品干燥的同时，将硅晶片切割成适合放入刀槽的大小，并用金刚石刻划笔进行标记。

然后，使用异丙醇和无尘纸手动清洁硅片。使用可移除胶粘剂将基底固定在载片板的一端。固定后，利用空气辉光放电对基底进行等离子体活化，以获得亲水性表面。

将安装好基质的载片靠近刀刃，插入基质夹持器的夹具中。接着，将大型金刚石刀插入刀架，并将刀具间隙角设为零度。然后，用蒸馏水填充刀槽。

将刀片移近，使其距离样品一到两毫米。然后，使用基底夹持器的螺丝一至三将基底缓缓降入水中。检查水线是否位于基底的上三分之一处。

由于使用硅片时难以观察到离地间隙，应降低基底直至感觉到其接触地面，然后将基底略微抬高。确保在切割过程中，基底和载体均不会触碰到刀舟。

接下来，使用注射器或移液器调节舟槽中的水位。在通过双目镜观察的同时，添加或移除水，直到水面整个区域均呈现出超薄切片机顶部光源均匀的反射光。一旦装置完成，即可开始对样品进行切片。

当切出若干切片后，停止切片过程，用睫毛或极细的猫毛轻轻拂过刀刃，使切片带从刀刃上松脱。将切片带移向载物基底，并轻轻推动切片带的第一片，使其附着在基底的干燥区域。继续对样品进行切片，并将切片带依次附着到基底上。

从基底的一侧开始，每次使用新的带状物时逐渐向另一侧移动。当基底表面完全被带状物覆盖后，使用基底夹持器的显微操作螺丝，轻轻将基底从刀槽中提起。让带状物阵列自然干燥，然后将其存放在无尘环境中。

干燥后，尽快将带有黏合剂的基材从载片上取下。然后，按照随附的文字实验方案对样品进行光学显微镜染色，并进行成像。接着，对样品进行电子显微镜染色，并使用带黏性的碳垫将其固定在铝制样品台上。

现在使用场发射扫描电子显微镜对这些阵列进行成像。为避免样品充电，应采用3 kV或更低的初级电子能量，以及50至800 picoamps之间的束流。当使用ITO镀膜玻璃盖玻片时，需用铜箔胶带和银导电漆将导电面与显微镜载物台连接。

分层成像级联的第一步是以能够识别各个独立区域的方式生成阵列的概览图。首先，在约100倍的低倍率下拍摄每个角落的图像，以确定阵列的四个角点，然后创建一个覆盖整个阵列的感兴趣区域（ROI）。为该ROI分配一个成像方案，参数如下。

使用二次电子探测器，以约0.2微秒的短停留时间进行高速成像。选择较大的图像像素尺寸和2000×2000像素的图块尺寸。结果图像噪声较大，但即便如此，仍可观察到切片内的组织结构。

然后，通过创建一个感兴趣区域来生成一个切片区段，仅勾勒出第一张切片中的组织轮廓。使用图章工具将其复制到所有后续切片中。根据需要旋转感兴趣区域，以适应弯曲的切片带。

将实验方案分配给最能显示组织亚结构的切片区域。此处采用的中间像素尺寸为 60 纳米，图块尺寸为 12000 × 12000 像素，驻留时间为 3.2 微秒。由于图像质量较差，另制备了一组包含少数特定细胞的切片，使用了更小的像素尺寸和更灵敏的检测器。

现在可以非常清晰地识别出两个目标细胞。在包含目标结构的切片区段内创建一个位点集，用于更高分辨率的扫描电镜成像。将感兴趣区域设置得足够大，以确保能够适应阶段移动的精度要求。

检查并调整位点的位置。当需要成像多个区域时，必须进行自动调谐。在放置感兴趣区域时，应确保其中心不落在无结构细节的空材料上，例如液泡。

接下来，定义自动对焦设置，并在靠近成像区域的小范围区域内检查沿带状区域的成像性能。然后，为高分辨率扫描电镜成像设定成像方案。为观察膜结构区室，应选择三至五纳米之间的图像像素尺寸。

根据探测器选择合适的停留时间，以确保图像噪声不过大。由于载物台需要在记录此区域和彼区域之间移动较长距离，因此需使用检查程序选项，至少对每条带的第一个区域定义聚焦值。然后启动全自动扫描电镜成像，覆盖所有目标兴趣区域的序列。

完成时，将获取的数据导出为图像序列，建议采用 TIF 格式。将图像序列作为虚拟堆栈导入 Fiji。接下来，通过尽可能贴近目标结构裁剪区域，对堆栈进行裁剪以用于后续处理。

此外，调整亮度和对比度，并保存图像栈。裁剪并优化后，从“文件”菜单中打开一个新的 TrakEM。在图像区域右键单击，将图像栈作为每层一个切片导入 TrakEM。

通过右键单击，选择对齐图层。选择最小二乘法作为模式，将范围设置为从第一帧到最后帧，并选择无作为参考。接下来，选择默认设置值，并选择刚性作为所需的变换方式。

当配准完成且结果满意后，通过右键单击并选择“导出”来保存对齐后的数据集。创建一幅平面图像，将范围设置为从第一幅到最后一幅图像，并让软件显示生成的图像栈。完成后，以 TIF 格式保存该图像栈。

制备完成后，切片阵列表现为由多条连续切片组成的带状阵列。本图展示的是经碘化丙啶染色的拟南芥根尖的概览图。该样品的连续切片已按照实验方案中的描述进行对齐，并组合成一个三维图像，以单个视频文件的形式呈现样品的三维结构。

此处可以看到两个目标细胞，后续将在扫描电镜（SEM）中以纳米级分辨率进行成像。在使用醋酸铀和柠檬酸钠进一步染色后，对这些阵列进行了电子显微镜成像。该静态图像显示了样本切片在第一轮成像中以20纳米分辨率获取，而在第二轮成像中则达到5纳米分辨率。

在此，按照方案所述，将来自电子显微镜的210张连续图像进行了对齐和裁剪。该视频仅针对两个细胞，展示了细胞内液泡的三维排列方式以及它们之间的部分连接情况。此处所示扫描电镜中的阵列自动分层成像可实现不同分辨率水平下的无缝映射，从整个阵列的概览到亚细胞结构的细节均可呈现。

在最高放大倍数下，可以分辨出液泡、线粒体、细胞核和内质网。一旦掌握技巧，若操作得当，可在数小时内将切片条带并排置于常规基底上。这可在同一基底上提供数百个切片用于成像。

对如此大量的切片进行成像所需的时间可能因显微镜而异，尤其当您常用的成像仪器具有不同自动化水平时，差异更为明显。值得注意的是，该通用工作流程可轻松与其他成像技术结合使用，例如常规组织学染色甚至焰光分析，也可单独作为大体积组织结构成像的工具。该工作流程的另一个优势在于其易于获取和使用。

初步研究无需额外工具或自动化设备，这意味着无需大量投入。观看本视频后，您将对工作流程有清晰的了解，并掌握如何利用多模态和分层成像技术，在不同分辨率下对大体积三维样本中的感兴趣结构进行定位与成像。