用于在大容量中查找特定细胞目标的串行剖面的多模式分层成像
March 20th, 2018
本协议以扫描电镜 (SEM) 为目标, 以纳米尺度分辨率成像组织中的特定细胞为靶点。从树脂嵌入的生物材料中, 大量的系列部分首先在光学显微镜中被成像, 以识别目标, 然后以分层的方式在 SEM 中。
该工作流程的总体目标是使用光学显微镜确定组织内超微结构成像的某些目标，然后在 SEM 中以非常高分辨率进行 3D 成像。本文介绍的成像工作流程可以帮助回答许多领域中有关细胞或组织超微结构的关键问题，例如细胞生物学、发育生物学、神经科学甚至病理学。该技术的主要优点是，实际上基于阵列断层扫描，将组织切成连续切片阵列，可以很容易地识别目标结构，即使它们最初被埋在原始样本体积内。
阵列断层扫描最初是在神经科学背景下引入的，但它也可以应用于广泛的其他系统，包括细菌、植物、动物，甚至病理学环境中的患者样本。刚接触这种方法的人会很挣扎，因为收集许多连续部分非常困难。在没有额外支撑的情况下工作可能会导致截面丢失或色带错乱。
使用由固定在牙签上的几根头发制成的小刷子，小心地用粘合剂混合物涂在预先修剪的块的前侧和后侧。快速执行此步骤，因为该混合物的溶剂会在几秒钟内蒸发。样品干燥后，将硅晶片切割成适合刀船的大小，然后用金刚石划线器标记它们。
然后，用异丙醇和无绒纸巾手动清洁硅晶片。使用可移除的粘合剂将基材固定到载板的一端。凝固后，等离子体使用空气辉光放电来活化基材，以获得亲水表面。
将已安装的基板更靠近刀口，将载体插入基板支架的夹子中。接下来，将一把巨型金刚石刀插入刀架，并将后角设置为零度。然后，用蒸馏水填充刀船。
靠近刀，使其距离样品 1 到 2 毫米。然后，使用基板支架的 1 到 3 号螺钉将基板放入水中。检查水线是否位于基材的上三分之一处。
因为在使用硅晶片时很难看到离地间隙，所以降低基板，直到感觉到它接触到地板。然后，将底物少量升高。确保在切割时基材和载体都不会接触刀舟。
接下来，使用注射器或移液管调整船内的水位。在通过双筒望远镜观察时，添加或去除水，直到水面的整个区域显示出超薄切片机顶部光照明的均匀反射。设置完成后，开始对样品进行切片。
当切割了多个切片后，停止切片过程，用睫毛或非常柔软的猫毛轻轻抚摸刀口，将丝带从刀口松开。将色带朝基材方向移动，然后轻轻推动色带的第一部分，将其连接到基材的干燥部分。继续切片样品并将色带连接到基材上。
从基材的一侧开始，然后随着每个新色带逐渐向另一侧移动。当基材完全被色带覆盖时，使用基材支架的显微作螺钉轻轻地将基材从刀舟中取出。让色带阵列干燥，然后将其存放在无尘环境中。
干燥后，尽快从载体上取下贴有粘合剂的基材。然后，按照随附文本方案中的说明对样品进行光学显微镜染色并进行成像。接下来，对样品进行电子显微镜染色，并用粘性碳垫将其安装在铝短管上。
现在在场发射扫描电子显微镜中对这些阵列进行成像。为避免充电，请使用 3 kV 或更低的一次电子能量和 50 到 800 皮安之间的束流。使用 ITO 涂层玻璃盖玻片时，请用铜带和银漆将导电面连接到显微镜支架上。
分层成像级联的第一步是生成阵列的概览，以便可以识别各个部分。首先，通过以低放大倍率（约 100 倍）绘制每个角的图像来定义阵列的四个角，然后创建一个包含整个阵列的 ROI。使用以下参数为此 ROI 分配成像协议。
使用二级电子检测器进行高速成像，停留时间约为 0.2 微秒。选择较大的图像像素大小和 2000 x 2000 像素的平铺大小。结果是一个非常杂色的图像，但即使在这里，切片内的组织也是可见的。
然后，通过创建感兴趣区域来生成截面集，在第一部分仅概述组织。使用图章工具将其克隆到所有后续部分。需要时旋转感兴趣的区域，以适应弯曲的色带。
为最能显示组织子结构的部分分配一个协议。在这里，使用了 60 纳米的中间像素大小、12000 x 12000 像素的平铺大小和 3.2 微秒的停留时间。由于质量较差，使用更小的像素大小和更灵敏的检测器创建了第二部分，概述了选定的几个细胞。
现在可以很好地识别两个靶细胞。在包含目标结构的截面集中创建一个站点集，以实现更高分辨率的 SEM 成像。使感兴趣的区域足够大，以考虑分阶段精度。
检查并调整站点的位置。当对许多部分进行成像时，需要进行自动调整。放置感兴趣的区域很重要，这样中心就不会位于没有结构细节的空材料上，例如液泡。
接下来，定义自动对焦设置，并检查在靠近要成像的站点的一小块感兴趣区域上色带长度上的成像性能。然后，为高分辨率 SEM 采集定义成像协议。要查看膜隔室，请选择 3 到 5 纳米之间的图像像素大小。
根据探测器选择停留时间，以便图像不会太嘈杂。由于舞台在录制此部分和此部分之间必须移动很长的距离，因此请使用 check protocol 选项至少在每个功能区的第一个部分上定义焦点值。然后开始对整个系列感兴趣的目标区域进行自动 SEM 成像。
完成后，将采集的数据导出为图像系列，最好是 TIF 格式。将图像系列作为虚拟堆栈导入斐济。接下来，通过尽可能靠近感兴趣结构的区域来裁剪堆栈以进行进一步处理。
此外，调整亮度和对比度并保存堆栈。裁剪和优化后，从 File （文件） 菜单中打开一个新的 TrakEM。右键单击图像字段，然后将堆栈作为每层一个切片导入 TrakEM。
右键单击，选择 Align layers（对齐图层）。选择 最小二乘法 作为众数，设置从第一个到最后一个的范围，然后选择 none 作为参考。接下来，选择默认设置值并选择 Rigid 作为所需的变换。
当注册完成并令人满意时，右键单击并选择 Export 来保存对齐的数据集。制作平面图像，设置从第一个图像到最后一个图像的范围，然后让软件显示结果堆栈。完成后，以 TIF 格式保存堆栈。
准备后，截面阵列显示为由多个序列截面带组成的阵列。本节显示了用碘化丙啶染色的拟南芥根尖的概述。该样本的序列部分按照协议中的描述对齐，并组合起来，将样本以 3D 形式显示为单个影片文件。
在这里，可以看到两个靶细胞，它们稍后将在 SEM 中以纳米分辨率成像。用乙酸铀酰和柠檬酸盐血额外染色后，在电子显微镜下对阵列成像。该静态图像显示了样品切片首先以 20 纳米分辨率成像，第二轮成像以 5 纳米分辨率成像。
在这里，按照协议中的描述对齐和裁剪来自电子显微镜的 210 个连续图像。该视频仅针对两个细胞，并展示了细胞内的液泡是如何排列的，有时还以 3D 形式连接。此处所示的 SEM 中阵列的自动分层成像可以在不同分辨率水平上提供无缝映射，从整个阵列的概览到亚细胞细节。
在最高放大倍率下，可以识别液泡、线粒体、细胞核和内质网。一旦掌握了，如果作得当，可以在几个小时内将切片带并排放在典型的基材上。这可能会在一个基材上提供数百个切片用于成像。
如此大量切片的成像时间可能因显微镜而异，如果您最喜欢的成像仪器具有不同的自动化水平，则更是如此。有趣的是，一般工作流程可以很容易地与其他成像技术相结合，例如标准组织染色甚至烛光发光，或者它可以简单地用作大体积关节结构成像的独立工具。此工作流的另一个方面是易于访问。
无需额外工具或自动化即可进行初步研究，这意味着无需大量投资。观看此视频后，您应该对工作流程以及如何使用多模态和分层成像以不同分辨率水平在大型 3D 体积中定位和成像感兴趣的结构有一个很好的了解。
概述
本协议描述了一种工作流程，用于在组织中识别用于超结构成像的特定细胞靶点，使用光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）。该方法增强了对可能在原始样品体积中被遮挡的结构的可视化能力。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 发育生物学
- 神经科学
- 病理学
背景
- 该技术基于阵列断层扫描，它允许将组织切片成连续切片。
- 最初为神经科学开发，可应用于各种生物系统。
- 挑战包括收集和保持连续切片完整性的难度。
- 正确的准备和处理对于避免切片丢失或错位至关重要。
研究目的
- 提供详细的成像工作流程，用于研究细胞和组织超结构。
- 促进在复杂生物样品中鉴定目标结构。
- 在各种研究领域改善成像分辨率和准确性。
使用的方法
- 光学显微镜用于初始目标识别。
- 树脂包埋样品的连续切片。
- 为SEM成像准备基底。
- 使用不同成像分辨率的特定协议进行分级成像。
主要结果
- 成功在组织切片中识别目标细胞。
- 通过SEM实现的细胞结构高分辨率成像。
- 证明了阵列断层扫描在各种生物学背景中的有效性。
- 提供了样品制备和成像程序的详细协议。
结论
- 成像工作流程增强了对组织超结构细节的研究能力。
- 阵列断层扫描是一种适用于多个生物学领域的多功能技术。
- 协议的仔细执行对于获得可靠的成像结果至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Hierarchical multimodal imaging of serial sections enables precise identification and ultrastructural analysis of specific cellular targets within large, heterogeneous tissue volumes. This workflow integrates light and electron microscopy, supporting high-confidence target selection and detailed 3D reconstruction, which is critical for de-risking early discovery and translational research. The approach enhances predictive confidence and continuity across discovery, screening, and preclinical inflection points in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially resolved identification of rare or functionally relevant cell types within complex tissues.
- Supports mechanistic de-risking by correlating molecular markers with ultrastructural features.
- Facilitates functional target validation through 3D mapping of cellular microenvironments.
- Improves predictive confidence for downstream biological hypotheses and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated section arrays for reproducible imaging and quantitative analysis.
- Standardizes imaging protocols across light and electron microscopy for robust assay development.
- Enables scalable, automated imaging workflows for high-content screening of tissue arrays.
- Supports reliable evaluation of compound effects at subcellular resolution.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant tissue architecture and biomarker localization.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling retrospective analysis of archived or biopsy samples.
- Reduces translational risk by supporting 3D ultrastructural correlation with functional endpoints.
- Enhances mechanistic insight into tissue pathology and therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal imaging workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical research by enabling high-resolution, quantitative mapping of cellular targets within large tissue volumes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking molecular labeling with ultrastructural context.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Provides 3D reconstructions and quantitative measurements for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and retrospective analysis of clinically relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, reusable platform adaptable to diverse biological systems and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables scalable, automated data acquisition.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, high-content data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both light and electron microscopy and serial section handling.
- Demands access to ultramicrotomy, fluorescence labeling, and SEM instrumentation.
- Benefits from cross-team standardization of imaging protocols and data management.
- Adaptable to a wide range of biological samples, including archived and prefixed tissues.
- Section collection and alignment can be technically challenging and may require specialized training.
