一种简便的定点乙酰化蛋白质制备方案 大肠杆菌

本研究将展示一种利用大肠杆菌作为表达宿主，在特定位点产生均一乙酰化蛋白质的简便方案。蛋白质赖氨酸乙酰化是一种可逆的修饰，是自然界中最常见的翻译后修饰之一，在基因转录、应激反应、细胞分化和代谢等多种生物学过程中发挥着重要作用。

在设计位置生成完全乙酰化的蛋白质对于研究蛋白质乙酰化具有重要意义。然而，大多数经典方法难以实现这一目标。该难题已通过遗传密码子扩展技术得以解决。

利用一种经过改造的吡咯赖氨酰-tRNA合成酶变体，将乙酰赖氨酸加载到tRNA-Pyl上，随后利用宿主的翻译机制抑制mRNA中的UAG终止密码子，并指导乙酰赖氨酸在目标蛋白的指定位置插入。首先，需要通过定点突变在目标基因的相应位置引入琥珀终止密码子。以含有野生型蛋白基因的模板质粒为模板，通过PCR反应，从引物中插入终止密码子突变。

PCR结束后，将扩增产物直接加入激酶-连接酶-DpnI酶混合液中，室温孵育1小时，以进行环化并去除模板。取5 µL该混合物加入含有25 µL已解冻的感受态E.coli细胞的离心管中。轻轻弹击离心管混匀，将混合物置于冰上30分钟。

将混合物在 42 摄氏度下热激 30 秒，然后置于冰上 5 分钟。向混合物中加入 600 微升室温 SOC 培养基。在 37 摄氏度下振荡孵育 60 分钟。

取100微升菌液涂布于含相应抗生素的平板上，37摄氏度过夜培养。挑取单菌落提取质粒送测序。第二步是表达并纯化位点特异性乙酰化蛋白。

从平板上挑取单个菌落，该菌落含有带突变TAG密码子的目标基因及乙酰赖氨酸整合系统。将其接种于15毫升含相应抗生素的新鲜LB培养基中，在37摄氏度下过夜培养。将15毫升过夜培养物转接至300毫升含抗生素的新鲜LB培养基中，在37摄氏度下继续培养。

当培养液在600纳米处的吸光度达到5时，以终浓度加入5毫摩尔的乙酰赖氨酸和20毫摩尔的烟酰胺。在37摄氏度下继续培养细胞1小时。然后加入蛋白表达诱导剂，在25摄氏度下过夜培养细胞。

通过在3,000 g条件下离心15分钟收集细胞。弃去上清液，并将细胞沉淀在负80度保存。将冻存的细胞沉淀置于冰上解冻，加入15毫升裂解缓冲液、5微升β-巯基乙醇和1微升核酸酶，重悬细胞。

通过超声处理破碎细胞。将粗提物在4°C条件下以20,000 g离心25分钟。用45微米的膜滤器过滤上清液。

将过滤后的样品上样至含有1 mL镍-NTA树脂的层析柱中，该树脂已用20 mL裂解缓冲液平衡。用20 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。目标蛋白用2 mL洗脱缓冲液洗脱。

通过PD-10柱对纯化的蛋白质进行脱盐，加入2.5毫升样品，并用3.5毫升脱盐缓冲液收集脱盐后的样品。下一步是对纯化的乙酰化蛋白质进行生物化学表征。使用SDS上样缓冲液在100摄氏度以上使蛋白质变性5分钟。

将混合物离心，上样至SDS-PAGE凝胶，以200伏电压电泳30分钟。用蒸馏水洗涤凝胶，并轻轻振荡。进行Western印迹转膜时，从阴极到阳极依次放置海绵、滤纸、转移缓冲液、浸透的SDS-PAGE凝胶、甲醇活化的PVDF膜、另一张滤纸，排除夹层中的气泡，最后再放上另一块海绵。

将凝胶-膜夹心结构放入转膜槽中。以350毫安的恒定电流运行45分钟。用25毫升TBST缓冲液轻轻振荡洗涤PVDF膜5分钟。

用5% BSA和TBST缓冲液在室温下封闭膜1小时。将膜与稀释的HRP标记的乙酰化赖氨酸抗体在室温下孵育1小时，或在4°C过夜，同时轻轻振荡。用20毫升TBST缓冲液在轻轻振荡条件下洗涤膜5分钟。

重复此步骤四次。将化学发光底物加入膜上，孵育一分钟。使用基于CCD相机的成像系统捕获信号。

将相同体积的洗脱组分和蛋白质纯化样品上样至SDS-PAGE凝胶。乙酰化蛋白质的产量约为野生型蛋白质的一半，效率较高；而相同表达菌株在不含乙酰赖氨酸及特定培养基的条件下无法产生可检测量的蛋白质，表明乙酰化蛋白质纯度很高，因为在该特定位点未掺入天然氨基酸。Western blot结果显示，野生型蛋白质中未检测到乙酰化信号，说明该表达系统的非特异性乙酰化背景很低，而乙酰化蛋白质则显示出清晰的条带。

串联质谱证实，乙酰化发生在基因中相应位点突变为终止密码子的正确位置。为了获得高产量和高纯度的乙酰化蛋白，应使用优化的乙酰赖氨酸整合系统，以实现高效率和高纯度。应使用BL21(DE3)细胞以降低背景信号和非特异性乙酰化，从而提高纯度。

该基因整合系统可用于真核系统，以实现更广泛的应用。