疟疾感染期间细胞外囊泡功能的评估

本实验的总体目标是研究疟原虫感染的红细胞所释放的细胞外囊泡的功能。该方法有助于回答疟疾研究领域中的关键问题，例如疟原虫如何调控寄生虫与宿主之间的通讯。该技术的主要优势在于能够通过受体细胞可视化囊泡运输过程，并研究囊泡RNA在受体细胞中的调控功能。

进行该实验操作的将是来自我实验室的研究生 Mya Alondez、Smartin Bagu 和 Bayo Babatunde。在微量离心管中加入 100 µg 细胞外囊泡和 1 毫升磷酸盐缓冲液。然后以最大 20,000 ×g 的速度离心 7 分钟，使细胞外囊泡沉淀形成沉淀物。

离心结束后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。随后将细胞外囊泡沉淀重悬于100 µL稀释液C中，反复吹打数次以确保充分混匀。接下来，在新的微量离心管中，将4 µL PKH67乙醇染料溶液加入100 µL稀释液C中，充分涡旋混匀。

在染色前立即配制40微摩尔的2X PKH67染料溶液。然后迅速将100微升的2倍细胞外囊泡悬液与等体积的PKH67乙醇染料溶液混合。随后用移液器吹打混合液10次，以确保充分混匀。

充分混匀后，将细胞外囊泡与PKH67乙醇染料溶液避光孵育5分钟。孵育过程中，每隔一段时间涡旋振荡混合液3至4次。为终止染色反应，向混合液中加入200 µL血清，并继续孵育1分钟，使过量染料与血清结合。

接下来，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞外囊泡三次。洗涤后，在20,000 ×g离心5分钟。然后将细胞外囊泡沉淀溶解于100微升磷酸盐缓冲液中，以获得终浓度为1微克/微升的溶液。

将内皮细胞用1 mL完全内皮细胞生长培养基转移至聚乙烯醇包被的盖玻片上。让细胞在盖玻片上生长形成单层。待单层细胞形成后，小心吸除培养基，并加入1 mL新鲜培养基洗涤细胞两次。

然后将50微克PKH67标记的细胞外囊泡加入盖玻片中，孵育4小时。孵育结束后，吸除培养基。为去除所有未结合的细胞外囊泡，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。

使用精细镊子对盖玻片进行染色操作时应格外小心，以避免细胞脱落和盖玻片破损。洗涤后，用含3%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定细胞15分钟。再次用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，然后加入250 µL含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液以透化细胞，并在室温下孵育5分钟。

接着，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次，并向细胞中加入400微升封闭缓冲液。然后在室温下孵育30分钟，以防止非特异性结合。封闭后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。

然后，将5微升鬼笔环肽储存液加入200微升含1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，为每张盖玻片配制染色液。随后，向盖玻片上加入200微升染色液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次。

然后，使用200微升磷酸盐缓冲液中含有终浓度为每毫升2微克的Hoechst 3342对DNA进行复染，染色30秒。染色后，加入400微升磷酸盐缓冲液，洗涤盖玻片两次。接着，用镊子小心地提起盖玻片，将其倒置在载玻片上的一滴抗荧光淬灭封片剂液滴表面。

用组织轻轻擦去多余的培养基，然后用指甲油密封周围区域。在显微镜观察过程中，应特别注意避免细胞接触过多染料，以防止细胞褪色。在孔径为0.4微米的24孔组织培养小室中接种内皮细胞。

然后让细胞在培养环境中生长五天，期间不进行干扰，以形成分化的单层细胞。每隔两天更换一次培养基。单层细胞形成后，在上层腔室中加入50微克的细胞外囊泡，溶于1毫升溶液中。

然后向顶部小孔中加入 20 毫克/毫升的罗丹明葡聚糖，并在 37 °C、5% 二氧化碳条件下孵育。通过检测 40 微升培养基上清液的荧光发射来监测荧光葡聚糖向小孔底部的迁移情况。随后将多功能微孔板读板仪的激发波长设定为 544 纳米，发射波长设定为 590 纳米。

使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。然后将内皮细胞重悬于完全内皮细胞培养基中，并在96孔板中每孔加入100 µL内皮细胞生长培养基接种细胞。为达到每毫升0.1至10微克的浓度，加入100 µL含抗生素的培养基。

每隔两天在光学显微镜下使用20倍物镜监测细胞的存活率。继续培养细胞10至14天，每两到三天根据细胞生长情况更换含抗生素的培养基。随后，向每个孔中加入10 µL MTS试剂，并混匀试剂。

将96孔板在37摄氏度下孵育4小时。4小时后，在摇床上短暂振荡混匀孔板。然后使用酶标仪在490纳米波长下读取经处理和未处理细胞的吸光度。

慢病毒转导前一天，将内皮细胞接种于1毫升完全培养基中。待细胞融合度达到50%至80%时，进行慢病毒转导。打开管子前，将慢病毒悬液在200 × g下离心30秒，以避免溢出。然后向细胞中加入六氨甲基溴化物，使其终浓度为8 µg/mL，并轻轻摇晃培养板。

将慢病毒加入细胞中，并再次轻轻晃动培养板30秒，以确保充分混匀。为提高慢病毒转导效率，将细胞-病毒混合物在室温下以300 × g离心45分钟。然后将细胞-病毒混合物在37°C孵育过夜。

次日，弃去含有病毒颗粒的培养基，并更换为预热的新鲜完全培养基。第二天开始嘌呤霉素筛选，将完全培养基更换为含有嘌呤霉素的培养基。

嘌呤霉素筛选后，收集细胞。根据制造商说明书，使用RNA提取试剂盒从细胞中提取RNA。利用逆转录试剂盒提取含有选定微小RNA的互补DNA。

然后建立定量PCR反应。为了监测内皮细胞对细胞外囊泡的内化作用，采用共聚焦显微镜分析PKH67标记的绿色囊泡。在该实验中，使用鬼笔环肽（phalloidin）和Hoechst 33342，分别将肌动蛋白染成红色、细胞核染成蓝色，以追踪囊泡在内皮细胞内的转位情况。

获得的共聚焦图像显示，内皮细胞在4小时后已明显摄取了这些囊泡。接下来，为研究内皮细胞单层的通透性，分析了罗丹明B异硫氰酸标记的葡聚糖的扩散能力。该实验表明，将内皮细胞与50和100微克/毫升的细胞外囊泡共孵育2小时后，内皮单层的通透性增加。

在图中，x 轴表示细胞外囊泡的浓度，y 轴表示在 590 纳米处测得的内皮通透性变化倍数。接下来，为了确定内皮细胞对嘌呤霉素处理的敏感性，绘制了杀伤曲线。该杀伤曲线显示，低至 0.15 µg/mL 的嘌呤霉素即可完全杀死所有细胞。

此外，为了确定从内皮细胞中分离的 micro-RNA451a 的表达水平，进行了实时定量 PCR 检测。柱状图显示，与内参基因 U6 相比，micro-RNA451a 转录本显著高表达。该技术建立后，为传染病领域的研究人员探索细胞外囊泡（Evs）在宿主相互作用及通过遗传物质转移介导的细胞间通讯中的作用提供了途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何可视化细胞外囊泡被受体细胞摄取的过程，以及如何研究小RNA（包括RNA）在调控内皮细胞功能中的作用。

请注意，操作疟原虫和人血时可能存在极高风险，进行本实验时必须采取预防措施，例如佩戴手套、穿上实验服，并在无菌操作台内进行操作。