疟疾感染中胞外囊泡功能的评价

在这项工作中, 我们描述了研究由恶性疟原虫感染的红细胞释放出的细胞外囊 (EVs) 作用的协议。特别是, 我们关注的是电动车与内皮细胞的相互作用。

该程序的总体目标是研究疟疾寄生虫感染的红细胞释放的细胞外囊泡的功能。这种方法可以帮助回答疟疾领域的关键问题，例如寄生虫如何调节寄生虫与宿主的交流。该技术的主要优点是在研究 indoterot 细胞对囊泡 RNA 的调节功能的情况下，使 indoterot 细胞的囊泡结构可视化。

演示该程序的是 Mya Alondez、Smartin Bagu 和 Bayo Babatunde，他们都是我实验室的研究生。在微量离心管中加入 100 微克细胞外囊泡和 1 毫升磷酸盐缓冲盐水。然后以最大 20， 000 次 g 的速度离心细胞外囊泡 7 分钟以形成沉淀。

离心结束后，丢弃上清液，不要干扰沉淀。然后将细胞外囊泡沉淀溶解在 100 微升稀释液中 C.To 确保完全混合，移液数次。接下来，在新的微量离心管中，将 4 微升 PKH67 乙醇染料溶液加入 100 微升 Dilmant C.然后充分涡旋混合物。

在染色过程之前准备 40 微摩尔的 2XPKH67 染料溶液。然后将 100 μL 两种细胞外囊泡悬浮液与等体积的 PKH67 乙醇染料溶液快速混合。然后移液混合物 10 次以确保正确混合。

完全混合后，将细胞外囊泡和 PKH67 乙醇染料溶液避光孵育 5 分钟。在孵育过程中，继续涡旋混合物 3 到 4 次。为了停止染色反应，向混合物中加入 200 μL 血清并孵育一分钟，使过量的染料结合。

接下来，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞外囊泡 3 次。洗涤后，将样品以 20， 000 次 g 离心 5 分钟。然后将细胞外囊泡沉淀溶解在 100 μL 磷酸盐缓冲盐水中，以达到每微升 1 μg 的最终浓度。

将 1 毫升完全内皮细胞生长培养基中的内皮细胞转移到聚烯烃包被的盖玻片中。让细胞在盖玻片上生长单层。形成单层后，小心去除培养基并加入 1 毫升新鲜培养基洗涤细胞两次。

然后将 50 μg PKH67 染色的细胞外囊泡添加到盖玻片中并孵育 4 小时。孵育后，吸出培养基。要去除所有未结合的细胞外囊泡，请用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞三次。

在染色过程中，应非常小心，使用细钳对盖玻片进行作，以避免细胞丢失和盖玻片破损。洗涤后，使用 3% 的多聚甲醛溶液在磷酸盐缓冲盐水中固定细胞 15 分钟。同样，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞 3 次，并加入 250 微升 0.1% Tritan x 100 的磷酸盐缓冲盐水以透化细胞并在室温下孵育 5 分钟。

接下来，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞 3 次，并向细胞中加入 400 微升封闭缓冲液。然后将细胞在室温下孵育 30 分钟，以防止非特异性结合。封闭后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞一次。

然后在 200 微升磷酸盐缓冲盐水和 1% 牛血清白蛋白中稀释 5 微升鬼笔环烯原液，以制备每个盖玻片的染色溶液。然后在盖玻片上加入 200 μL 染色液，并在室温下孵育 20 分钟。孵育结束后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞 3 次。

然后用终浓度为每毫升 2 μg 的钩状 3342 加入 200 μL 磷酸盐缓冲盐水对 DNA 进行复染 30 秒。染色后，加入 400 微升磷酸盐缓冲盐水，将盖玻片洗涤两次。然后用镊子小心地提起盖玻片，并将其倒置在载玻片上的一滴抗淬灭封固剂的顶部。

使用纸巾轻轻去除多余的介质，然后用指甲油密封周围。还应非常小心，在显微镜检查期间不要将细胞暴露于过多的染料中，以避免细胞漂白。在具有 0.4 微摩尔倾倒大小的 24 孔组织培养插入物中，接种内皮细胞。

然后让细胞在培养物中生长 5 天，不受干扰，形成分化的单层。每隔一天更换一次培养基。一旦单层形成，在上腔的 1 毫升细胞外囊泡中接种 50 μg。

然后将每毫升 20 毫克的 rotomine 葡聚糖添加到顶部孔中，并在 37 摄氏度下与 5% 的二氧化碳一起孵育。通过测量 40 μL 中等 avoquate 的荧光任务，监测荧光葡聚糖向孔底的迁移。然后为多标记微孔板读板机编程 544 纳米的激发波长和 590 纳米的发射波长。

使用血细胞计数器计数细胞数。然后将内皮细胞重悬于完全内皮培养基中，并将细胞接种在 96 孔板中的 100 μL 内皮细胞生长培养基中。要达到每毫升 0.1 至 10 μg 的浓度，请添加 100 μL 含抗生素的培养基。

在光学显微镜下使用 20 倍物镜每隔一天监测细胞的活力。继续培养细胞 10 至 14 天，并根据细胞生长情况每 2 至 3 天更换一次含抗生素的培养基。接下来，在每个孔中加入 10 μL MTS 试剂并混合试剂。

将 96 孔板在 37 摄氏度下孵育 4 小时。4 小时后，在摇床上短暂搅拌板。然后使用 490 纳米的读板器读取已处理和未处理细胞的吸收剂。

慢病毒转导前一天，将内皮细胞接种在 1 毫升完全培养基中。等到细胞达到 50% 至 80% 汇合度进行慢病毒转导 在打开试管之前，以 200 倍 g 的速度旋转慢病毒悬浮液 30 秒，以避免溢出。然后向细胞中加入己二甲肼溴化物，使其最终浓度为 8 μg/mL，然后轻轻旋转板。

将慢病毒添加到细胞中，然后再次轻轻旋转板 30 秒，以确保正确混合。为了提高慢病毒转导效率，在室温下以 300 x g 离心细胞-病毒混合物 45 分钟。然后将细胞病毒混合物在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，丢弃含有病毒颗粒的培养基，并替换为预热的新鲜完全培养基。第二天，开始选择嘌呤霉素。用含嘌呤霉素的培养基替换完全培养基。

选择嘌呤霉素后，收获细胞。按照制造商的说明，使用 RNA 分离试剂盒从细胞中分离 RNA。使用逆转录试剂盒分离带有所选 micro-RNA 的互补 DNA。

然后设置定量 PCR 反应。为了监测内皮细胞对细胞外囊泡的内化，使用共聚焦显微镜分析 PKH67 标记的绿色囊泡。在测定中，faloudine 和 hookst 33342 分别以红色和核蓝色起作用，用于追踪内皮细胞内囊泡的易位。

获得的共聚焦图像显示 4 小时后内皮细胞已准备好吸收囊泡。接下来，为了研究 rodamine b isothyosionadex聚糖的内皮细胞单层扩散能力的通透性，分析了外聚糖。该测定表明，用每毫升 50 和 100 μg 的细胞外囊泡孵育内皮细胞在两小时后增加了内皮单层通透性。

在图中，x 轴表示细胞外囊泡的浓度，y 轴表示在 590 纳米处读取的内皮通透性的折叠变化。接下来，为了确定嘌呤霉素处理后内皮细胞的敏感性，绘制了杀伤曲线。杀灭曲线显示，每毫升嘌呤霉素低至 0.15 μg 就足以杀死所有细胞。

此外，为了确定从内皮细胞中分离的 micro-RNA451a 的表达水平，进行了实时定量 PCR。条形图显示 micro-RNA451a 转录本对管家基因 U6 的显著过表达。开发后，这项技术为传染病领域的研究人员通过遗传物质转移探索 Evs 在宿主相互作用和细胞通讯中的作用铺平了道路。观看此视频后，您应该对如何可视化受体细胞的 EV 摄取以及如何研究内皮细胞调节中的小 RNA 功能（包括 RNA）有很好的了解。

不要忘记，与疟疾寄生虫和人类血液一起工作可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套、实验室外套和在无菌罩下工作。