Name: 生物哺乳动物细胞光交联图谱和 Bioorthogonal 化学中化学探针的遗传受体优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: 了解哺乳动物细胞中非经典氨基酸的高效掺入方法，利用荧光检测和光交联技术绘制G蛋白偶联受体的配体结合位点，实现活细胞中受体的生物正交标记与高分辨率成像。

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本工作由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号为 CO822/2-1（Emmy-Noether 项目）和 CO822/3-1，授予 I.C.。

1. 基于荧光的掺入效率筛选（图1）
<ol>
	<li>在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和 100 &#181;g/mL 链霉素在 37 &#176;C，95%湿度和5% CO₂2.</li>
	<li>转染前一天接种细胞。
	<ol>
		<li>将细胞分离 5 分钟 37 &#176;C 在含0.5 mM EDTA的0.05%胰蛋白酶/PBS中消化细胞。每10 cm培养皿使用1 mL胰蛋白酶/EDTA溶液。加入10倍体积的完全培养基终止反应，并用移液器吹打重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞悬液中的细胞数量进行计数49.</li>
		<li>接种 6.0 × 105 在6孔板的每孔中加入2 mL完全培养基，接种HEK293细胞。根据样本数量准备相应孔数，并额外准备两孔，分别用于野生型EGFP和空载体转染对照样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下观察细胞汇合度（细胞占据的面积），当细胞汇合度达到约70%时，使用聚乙烯亚胺（PEI）试剂进行转染。
	<ol>
		<li>转染前1小时，向所有孔中加入适量新配制的非天然氨基酸（ncAA）储备液，使ncAA终浓度为0.25–0.5 mM。包括野生型阳性对照组和空白转染细胞在内的所有孔均需添加ncAA，以避免因ncAA对细胞生长的影响而导致荧光信号差异。 
		注意： 配制储备液时，使用 0.2–0.5 M NaOH 将非天然氨基酸（ncAA）溶解至 0.1–0.5 M。然而，某些非天然氨基酸可能需要先溶于 DMSO，和/或在使用前用四倍体积的 1 M HEPES（pH 7.4）中和。通常情况下，生产商会推荐配制储备液的具体方案。</li>
		<li>在微量离心管中混合 1 &#181;g 质粒DNA&#160;用于测试ncAARS/tRNA配对的编码 1 &#181;g 报告质粒DNA（pcDNA3.0-EGFP）183TAG-mCherry)。在不同的离心管中，分别使用EGFP野生型参照和空白转染制备相同的转染体系。 
		注意： 质粒中编码ncAARS/tRNA配对的tRNA盒拷贝数取决于具体应用。为便于克隆，在筛选不同tRNA时建议使用1个tRNA拷贝；而在测试不同ncAARS或同一正交配对整合不同ncAA时，建议使用4个拷贝（尽管并非严格必需）。</li>
		<li>向每个含有 DNA 的试管中加入 100 &#181;L 含20 mM乳酸钠、pH 4.0、150 mM NaCl的乳酸盐缓冲盐水（LBS）。短暂混匀。</li>
		<li>向每个含有LBS中DNA的试管中加入 6 &#181;L 的 1 &#181;g/&#181;L PEI 与 LBS 混合（PEI/DNA 质量比为 3/1），立即涡旋振荡，室温孵育 10–15 分钟。</li>
		<li>取 400 &#181;L 吸出每孔的细胞培养基，并将其加入DNA-PEI混合物中以中和pH。将DNA混合物滴加到细胞上。 
		注意： DMEM 通常含有酚红作为 pH 指示剂。在中和步骤期间，加入试管中的混合物颜色会从黄色（酸性）变为红色（中性）。尽管在酸性 pH 的 LBS 中形成 DNA 复合物可获得最高的转染效率50，DNA-PEI 复合物也可在 pH 7.4 条件下直接形成（例如在无血清 DMEM 中）。若使用 DMEM 制备 DNA 复合物，则跳过中和步骤 1.3.5。无论何种情况，在形成复合物时，混合物中均不得含有血清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后48小时收集细胞。
	<ol>
		<li>吸弃培养基，用 2 mL 预热的 PBS 轻柔冲洗细胞一次（37 &#176;C）。加入 800 &#181;L 含0.5 mM EDTA的PBS缓冲液中孵育20分钟 37 &#176;C用移液器反复吹打使细胞脱离并悬浮。</li>
		<li>将细胞悬液转移至含有 1.5 mL 离心管中 200 &#181;L 含 5 mM MgCl 的 PBS2.</li>
		<li>800 × g 离心 2 分钟，弃上清液。 
		注意： 此处可暂停实验流程。若需暂停，应将沉淀物在液氮中速冻2 并储存在 -80 &#176;C 最长可达一个月。始终佩戴护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加 100 &#181;L 将Tris裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM EDTA及新鲜添加的PMSF）加入细胞沉淀中，冰上孵育30分钟。为促进裂解，每5分钟涡旋一次。</li>
	<li>离心去除细胞碎片，10 min， 4 &#176;C 和 14,000 × g 并转移 90 &#181;L 将上清液转移至黑色96孔板中。使用配备荧光检测模块的酶标仪测定EGFP和mCherry的荧光强度。 
	注意： 使用适用于EGFP的适当激发和发射滤光片（&#955;abs：488 nm； &#955;em：509 nm）和 mCherry（&#955;abs：588 nm； &#955;em：611 nm）。测得的EGFP值范围介于假转染细胞获得的最小值与通常来自野生型EGFP的最大值之间。请注意在仪器中设置正确的检测时间窗口。</li>
	<li>ncAA 掺入效率通过样品的荧光强度与野生型 EGFP 表达所得荧光强度的比值来计算。所有数值均以 mCherry 荧光强度进行归一化处理。 
	<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/57069/57069eq1.jpg" /></li>
</ol>
2. 将非天然氨基酸遗传整合到G蛋白偶联受体中以进行光交联作图分析配体-GPCR相互作用（图3）
<ol>
	<li>将 HEK293T 细胞培养于添加有 10 % (v/v) 胎牛血清、100 U/mL 青霉素的 DMEM 培养基中 100 &#181;g/mL 链霉素在 37 &#176;C，95% 湿度和 5% CO₂2.</li>
	<li>转染前一天接种细胞。
	<ol>
		<li>将细胞分离 5 分钟 37 &#176;C 在含0.5 mM EDTA的0.05%胰蛋白酶/PBS中消化。10 cm培养皿使用1 mL胰蛋白酶/EDTA。用10倍体积的完全培养基终止反应，并通过上下吹打重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞悬液中的细胞数量进行计数49.</li>
		<li>种子 5.0 × 105 6孔板中每孔接种293T细胞，加入2 mL完全生长培养基。针对每个待筛选位点，每种配体准备1个孔，另设1个结合对照孔33,38可额外设置一个转染野生型（wt）受体的孔，用于检测突变体的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，在显微镜下观察细胞汇合度（细胞占据的面积）。当细胞汇合度约为70%时，使用PEI进行转染。
	<ol>
		<li>转染前1小时，向所有孔中加入Azi，使其终浓度为0.5 mM。
		<ol>
			<li>配制 0.5 M 的 Azi 储存液。每 6 孔板，称取 1.2 mg Azi 置于离心管中，溶于 15 &#181;L 0.5 M NaOH。将原液用1.2 mL完全培养基稀释后加入 200 &#181;L 将混合液加入每孔。 
			注意： 每次实验均需制备新鲜的叠氮化合物储备液。叠氮基团在水溶液中半衰期较短，尤其在碱性pH条件下更不稳定，而AziRS会同时掺入完整的和已降解的形式。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>转染的总用量为 2 &#181;g 每孔DNA量： 1 &#181;g 携带目标位置TAG密码子的质粒编码FLAG标签GPCR及 1 &#181;g 编码正交对（专用于Azi，E2AziRS）的质粒51 以及4个拷贝的同源抑制性tRNA Bst山药33,38. 
		注意： 在进行野生型对照以检测表达水平时，转染较少量的质粒DNA&#160;对于野生型受体。根据GPCR的不同，0.2-0.5 &#181;g 编码野生型受体的质粒产生的水平相似 1.0 &#181;g 突变质粒的。在所有孔中转染相同量的DNA，用空载质粒（例如空载体）补足缺失的DNA量。</li>
		<li>按照1.3.3-1.3.5中的描述进行操作。</li>
		<li>转染后48 h，可选择进行步骤2.4对配体进行光交联，或进入步骤2.5直接收获并分析以验证受体表达。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配体的光交联
	<ol>
		<li>配制1,000倍配体储备液。将肽类配体溶解至相应浓度 100 &#181;M 在DMSO中。 
		注意： 配体浓度取决于解离常数 KD 配体-GPCR 相互作用。最终浓度为 100 x KD 建议采用。如果肽配体为三氟乙酸（TFA）盐，在计算分子量时需考虑TFA的重量（每分子肽中每个碱性氨基酸对应1个TFA）。此外，需注意肽类物质通常具有吸湿性。避免对肽粉末反复冻融，且在打开肽容器前，务必确保其已升至室温。</li>
		<li>将配体储备液用结合缓冲液按1:1,000比例稀释，结合缓冲液组分为0.1% BSA、0.01% Triton-X 100、5 mM MgCl2 在含有12.5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）-HCl（pH 7.4）、140 mM NaCl 和 5 mM KCl 的 HEPES 解离缓冲液（HDB）中进行。每种 Azi-GPCR 突变体准备 1 mL。将细胞培养基替换为 1 mL 配体溶液，室温孵育 10 分钟。 
		注意： 根据特定的 GPCR 调整孵育时间，考虑配体动力学和受体的内化过程。延长孵育时间并不能提高交联效率。</li>
		<li>在365 nm波长下，使用配备5根8 W灯管、灯管与细胞距离约5 cm的紫外交联仪对样品照射20 min。通过移液吹打使细胞脱离，转移至1.5 mL离心管中。在800 × g离心3 min收集细胞，弃去上清液。</li>
		<li>将一片蛋白酶抑制剂（PI）混合物溶于1 mL 25 mM EDTA/H中2O，以配制50倍浓度的储备液。分装PI储备液并置于-20 &#176;C. 将50倍浓缩储备液按1:25比例用HDB稀释，并用该溶液重悬细胞沉淀 50 &#181;L 在 HDB 中加入 2 倍体积 PI。将细胞在液氮中速冻2. 
		注意： 佩戴护目镜。此时，样品可在 -80 &#176;C 最长可保存一个月。继续进行步骤 2.6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直接细胞收获
	<ol>
		<li>吸弃培养基。加入 800 &#181;L 含0.5 mM EDTA的HDB中孵育10分钟，室温或冰上操作。</li>
		<li>用移液器反复吹打使细胞脱离，然后转移至1.5 mL离心管中。加入 200 &#181;L 5 mM MgCl2 在HDB中，以800 × g离心3分钟收集细胞，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于 50 &#181;L 在HDB中加入2倍PI，随后在液氮中快速冷冻2佩戴护目镜。 
		注意： 此时，样品可在 -80 &#176;C 长达1个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解。
	<ol>
		<li>在37℃水浴中解冻细胞 37 &#176;C 30-45 秒，短暂涡旋振荡。此后始终保持样品低温。在 2,500 x g 条件下离心收集膜组分 4 &#176;C 10 分钟后弃去上清液，其中含有大部分细胞质蛋白。</li>
		<li>将沉淀物重悬于 50 &#181;L 含50 mM HEPES-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl、10%甘油、1% Triton X-100、1.5 mM MgCl的HEPES裂解缓冲液2，1 mM EGTA，1 mM DTT 和新鲜添加的 2× 蛋白酶抑制剂混合液。充分混匀，冰上裂解细胞 30 分钟，每 5 分钟涡旋一次。</li>
		<li>离心细胞碎片，14,000 x g，10 分钟 4 &#176;C立即转移上清液至新的反应管中。 
		注意： 立即进行分析。裂解物可在 -20 &#176;C然而，每一次冻融循环都会降低实验结果的质量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Western印迹分析
	<ol>
		<li>准备样品时，取 3-5 &#181;L 裂解液并定容至 7 &#181;L 含 H2O. 添加 2 &#181;L 1 M DTT 和 3 &#181;L 含63 mM Tris-HCl（pH 6.8）、2% SDS、10%甘油和0.04%溴酚蓝的4倍上样缓冲液。30分钟孵育 37 &#176;C.</li>
		<li>当 GPCR 存在糖基化且出现微弱或弥散条带时，可用 PNGase F 对样品进行去糖基化处理，以增强信号强度并使条带更清晰。使用 3-5 &#181;L 裂解并去糖基化，总体积为 10 &#181;L 按照供应商提供的方案进行。添加 3 &#181;L 4 × 上样缓冲液 
		注意： 膜蛋白通常在多个位点和状态下发生糖基化，这会影响 SDS-PAGE 分析的分辨率质量。然而，在使用抗-FLAG 抗体分析 Azi-GPCR 突变体表达水平时，不要对样品进行去糖基化处理，因为有必要评估位于细胞表面的完全糖基化的成熟受体所占的比例。</li>
		<li>通过以下方法分离样品&#160;标准SDS-PAGE电泳并将蛋白质转印至PVDF膜。 
		注意： 丙烯酰胺具有神经毒性。请佩戴手套并做好眼部防护。</li>
		<li>在室温下封闭膜 1 小时，或在4°C过夜 4 &#176;C 在含20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、0.15 M NaCl和0.1% Tween 20的TBS-T缓冲液配制的5%脱脂牛奶中。</li>
		<li>用抗配体抗体孵育膜，随后使用HRP标记的二抗。每次孵育间用TBS-T洗涤。为检测Azi-GPCR的表达水平，使用商用HRP抗体孵育膜（参见 材料表).</li>
		<li>使用自制的增强化学发光（ECL）试剂进行ECL反应，并在暗处检测信号5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在活体哺乳动物细胞上对G蛋白偶联受体进行超快生物正交标记
注意：该方案已针对4孔板（每孔面积 = 2.2 cm2）优化。对于不同孔径大小，需相应调整方案。
<ol>
	<li>显微镜载玻片的表面包被。整个操作过程需在无菌操作台中进行。
	<ol>
		<li>用 50 mM 硼酸缓冲液（pH 8.5）配制聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（MW=500-550 kDa）（PDL）储备液，浓度为 1 mg/mL。4 °C 保存，最长可保存 6 个月。切勿冷冻。</li>
		<li>将 PDL 储备液用无菌超纯水按 1:40 稀释，得到终浓度为 25 µg/mL 的工作液，然后通过 0.22 µm 无菌滤器过滤。 
		注意： 工作液可在 4 °C 保存最多 3 个月。</li>
		<li>每孔加入 500 µL PDL 工作液，完全覆盖显微镜载玻片各孔底部。室温孵育 20 分钟后吸除 PDL 工作液。 
		注意： PDL 工作液最多可重复使用三次。若需重复使用，应将已用过的溶液从包被后的载玻片转移至新的无菌离心管中，并做好相应标记。切勿将回收的溶液与新鲜溶液混合。</li>
		<li>每孔用约 700 µL 无菌超纯水清洗 3 次，然后室温干燥至少 1 小时。 
		注意： 准确清洗各孔至关重要，因为 PDL 溶液残留对细胞具有毒性。包被后的载玻片可立即用于显微观察，或在 4 °C 保存最多一周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 37 °C、95 % 湿度和 5 % CO2 条件下，用含 10 %（v/v）FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 DMEM 培养基维持 HEK293T 细胞。</li>
	<li>转染前一天接种细胞。
	<ol>
		<li>在 37 °C 条件下，用含 0.5 mM EDTA 的 0.05 % 胰蛋白酶/PBS 消化细胞 5 分钟。10 cm 培养皿使用 1 mL 胰蛋白酶/EDTA。用 10 倍体积的完全培养基终止消化，并用移液器吹打重悬细胞。使用血细胞计数板49计数细胞悬液中的细胞数量。</li>
		<li>每孔（面积 2.2 cm²）接种 1.0 × 105 个 HEK293T 细胞，加入 600 µL 不含染料的完全 DMEM 培养基。 
		注意： 为便于成像，从一开始就使用不含染料的培养基非常方便。市面上有不含染料的 DMEM 培养基产品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在显微镜下观察细胞汇合度（细胞占据的面积），当细胞汇合度约为 70 % 时，使用脂质体转染试剂进行转染。
	<ol>
		<li>转染前 1 小时，用 0.2 M NaOH 和 15 %（v/v）DMSO 配制新鲜的 100 mM TCO*K 储备液。</li>
		<li>每孔加入 3 µL TCO*K 储备液与 12 µL 1 M HEPES（pH 7.4）混合，轻轻加入孔中，使 TCO*K 的终浓度为 0.5 mM。</li>
		<li>每孔准备总量为 500 ng 的 DNA。在微量离心管中，将 200 ng pcDNA3.1_CRF1R-95TAG-EGFP、200 ng 编码 MbPylRSAF/tRNAPyl 正交对（含四个 tRNAM15 表达盒）的质粒以及 100 ng pcDNA3.1_Arrestin3 质粒溶于 50 µL 培养基（无染料、无血清、无抗生素）中稀释。 
		注意： 通常情况下，共转染 Arrestin 并非观察 GPCR 内吞所必需。然而，共转染 Arrestin3 可加速 CRF1R 的内吞，这在分析多个突变体的内吞时非常方便。</li>
		<li>将 1.25 µL 脂质体转染试剂（每 1 µg DNA 使用 2.5 µL）溶于 50 µL 培养基（无染料、无血清、无抗生素）中，加入 DNA 混合液。立即涡旋混匀，室温孵育 5–10 分钟。将 DNA-脂质复合物加入细胞中。 
		注意： 根据我们的经验，使用脂质体转染的细胞形态比使用 PEI 转染的细胞更接近生理状态。由于 PEI 的转染效率更高，因此在 Western blot 等后续应用中应优先选用 PEI；而进行成像实验时，脂质体转染是更优选择。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染后 24 小时，用荧光染料标记受体。
	<ol>
		<li>用 DMSO 配制 0.5 mM 染料-四嗪&#160;储备液，用超纯 H2O 配制 10 mg/mL 的 DNA 染色染料储备液。</li>
		<li>从每孔取出 100 µL 培养基至 1.5 mL 反应管中，加入 1.8 µL 染料-四嗪&#160;储备液和 0.3 µL DNA 染色染料储备液。将含染料的培养基重新加回孔中，37 °C 孵育 5 分钟。 
		注意： 四嗪-橙色荧光染料的终浓度为 1.5 µM。</li>
		<li>吸除培养基，用 PBS 轻轻清洗细胞两次，以去除多余的染料。加入 600 µL 预热至 37 °C 的不含染料的完全生长培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光显微镜观察与受体内吞。
	<ol>
		<li>使用 63×（或类似）物镜，分别采用适合 GFP（λabs：488 nm；λem：509 nm）、橙色荧光染料（λabs：550 nm；λem：570 nm）和 DNA 染色染料（λabs：350 nm；λem：461 nm）的滤光片观察标记的受体。在激活受体前，使用各滤光片分别拍摄图像。</li>
		<li>使用 200 nM Ucn1 诱导受体内吞。
		<ol>
			<li>用 DMSO 配制 200 µM 的 1,000 倍 Ucn1 储备液。 
			注意： 根据肽段的溶解度，您可能也可用纯水或缓冲液配制该储备液。</li>
			<li>从孔中取出 100 µL 培养基至 1.5 mL 反应管中，加入 0.6 µL 肽类激动剂储备液。将培养基重新加回孔中。</li>
			<li>在显微镜下观察内吞过程。在内吞现象明显出现后（10–15 分钟至数小时，具体时间取决于受体类型及 Arrestin 的过表达水平），使用前述滤光片拍摄图像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案描述了一种简单且可靠的检测方法，用于评估正交对在哺乳动物细胞表达蛋白中引入非天然氨基酸（ncAAs）的效率。与广泛使用的基于流式细胞术（FACS）的检测方法相比，该方法的主要优势在于能够同时制备并测量大量样本，并且所得数据可使用常规软件轻松分析。在哺乳动物细胞中建立一种中等通量的正交对分析方法，对于开发新型正交对以及优化现有正交对具有重要意义。事实上，在哺乳动物系统中无法通过构建大规模随机文库并结合死/活筛选的方式进行正交对的定向进化。本检测方法可在相对较短的时间内，以合理的实验投入，实现对小型文库（数百个成员）的筛选。通过该方法对理性设计的tRNA集合进行筛选，我们成功获得了可显著提升吡咯赖氨酸系统效率的新型tRNA30。本方法采用经典的EGFP/mCherry组合进行荧光读数，其中EGFP作为非天然氨基酸掺入效率的报告蛋白，mCherry则作为内参对照。EGFP报告蛋白和mCherry对照蛋白被构建在同一质粒中，但分别位于两个独立的表达盒内，各自由不同的启动子驱动表达。因此，mCherry的表达水平反映转染效率和细胞数量，且不受EGFP表达的影响，从而可将测得的绿色荧光信号归一化...

将化学探针通过遗传手段整合到蛋白质中，是一种在活细胞的天然环境下直接研究蛋白质结构与功能动态特性的强大方法。如今，已有数百种携带不同化学基团的非天然氨基酸（ncAAs）可通过生物合成方式实现位点特异性地插入蛋白质中1,2,3,4。其中包括光敏感型非天然氨基酸，如光交联剂5、光保护基氨基酸6,7,8,9和光可切换氨基酸10,11；可用于无催化剂生物正交化学反应的含张力烯烃和炔烃的氨基酸2,12,13,14,15,16,17；携带丹磺酰（dansyl）18、香豆素（coumarin）9,19和 prodan20,21荧光团的氨基酸；以及携带其他生物物理探针或翻译后修饰基团的氨基酸1,2,3,4,22,23,24,25。
非天然氨基酸（ncAA）的遗传编码依赖于一对特异的氨酰-tRNA合成酶（AARS）与对应的抑制型tRNA（suppressor-tRNA），该对元件可在核糖体正常合成过程中响应琥珀终止密码子，将ncAA整合至多肽链中。ncAA的AARS/tRNA对经过工程化设计，使其在宿主生物体内具有正交性， 即 不会与内源性配对发生交叉反应。该技术在原核和真核宿主中均已建立完善，且易于应用于哺乳动物细胞。用于哺乳动物细胞中非天然氨基酸（ncAA）插入的配对主要基于三种正交系统：酪氨酰系统，该系统结合来自 E. coli26 使用酪氨酰琥珀抑制子从 B. stearothermophilus27 (EcTyrRS/Bst山药对）， E. coli 亮氨酰系统（EcLeuRS/tRNALeuCUA 对6,18,28 以及古菌吡咯赖氨酰系统（PylRS/tRNA）Pyl 对3，其中tRNAPyl 是一种天然的琥珀抑制子。通常情况下，每种非天然氨基酸（ncAA）由一种特异性的非天然氨基酸氨酰-tRNA合成酶（ncAARS）识别。根据ncAA的结构不同，ncAARS可通过对TyrRS、LeuRS或PylRS进行定向进化获得，尽管某些合成酶能够识别多种ncAA。
通过使用质粒载体即可将正交对导入细胞。最常用且高效的质粒为双顺反子结构，同时编码合成酶和构成正交对的tRNA29。另一携带目标蛋白基因的质粒，其在指定修饰位点含有琥珀密码子，需共转染进入细胞。非天然氨基酸（ncAA）只需添加至细胞培养基中即可。然而，不同专业研究组即使针对同一种ncAA的插入，也常使用不同的质粒构建体。这些构建体在载体中基因排列方式、合成酶类型、合成酶基因中的密码子使用、启动子选择、tRNA变体以及tRNA表达盒的数量等方面均存在差异。此外，由于不同合成酶的催化效率、tRNA质量及其他因素的差异，不同ncAA的插入效率可能相差极大30。因此，拥有一种快速且可靠的方法来评估正交对的效率至关重要，这不仅有助于为特定应用选择最合适的系统，还可用于优化实验条件以提高整体蛋白表达产量。
我们建立了一种简单且稳健的基于荧光的检测方法，用于评估正交对的效率29（图1）。在该检测中，细胞被共转染编码正交对的质粒以及一个双顺反子报告质粒，后者同时编码在允许位置带有琥珀终止密码子的绿色荧光蛋白（EGFPTAG）和mCherry基因。在96孔板中，使用酶标仪分别在不同通道检测全细胞裂解液的红色和绿色荧光。绿色荧光强度直接反映琥珀密码子抑制效率，而红色荧光强度则可直接用于评估检测样品量及转染效率。与基于荧光辅助细胞分选（FACS）读数的类似检测方法31,32相比，该方法能够对整个细胞群体中的蛋白表达进行即时且全面的评估，更接近常规实验条件，并且使用标准软件即可实现更简便的数据采集与处理。总体而言，该检测方法的主要优势在于可并行分析中等到大量样本。利用该检测方法，我们筛选了一个经过理性设计的抑制型tRNA文库，以提高Pyl正交系统的效率30。本研究描述了执行该检测的实验方案，并展示了其应用实例，包括针对光交联非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸（Azi）掺入效率优化的正交对优化，以及不同氨基酸掺入效率的比较（图2）。
近年来，非天然氨基酸（ncAA）工具已被证明在研究G蛋白偶联受体（GPCR）的结构与功能方面极为有效33,34,35,36,37,38。在人体中，GPCR构成一个庞大的膜受体家族（共800个成员），是治疗性药物的主要靶点。对GPCR进行直接的结构表征仍然具有挑战性，因此迫切需要互补的生化方法来开展相关研究。我们率先利用光交联非天然氨基酸来绘制GPCR表面图谱并发现配体结合口袋34。通过使用我们优化的Azi掺入系统，我们在活体哺乳动物细胞中系统性地将Azi掺入GPCR的整个膜近端结构域。在紫外光照射下，Azi会形成高反应性的氮宾物种，从而共价捕获邻近分子。当向体系中加入配体后，Azi可作为邻近探针，揭示受体中哪些位点靠近结合的配体。通过该方法，我们首次解析了神经肽激素Urocortin I（Ucn1）在B类GPCR促肾上腺皮质激素释放因子受体1型（CRF1R）上的结合模式33。近期，我们进一步揭示了同一受体上激动剂与拮抗剂的不同结合模式38。其他研究者也采用类似方法，揭示了其他肽类及小分子配体在不同GPCR上的正构和变构结合位点39,40,41,42。本文描述了我们在实验室中用于光交联绘制GPCR表面图谱的实验方案。该方法相对快速、简便，且无需任何特殊设备，因此可在标准的生物化学实验室中广泛应用。尤为重要的是，该方法不仅为在缺乏三维结构数据的情况下鉴定配体结合位点提供了有力工具，还可利用活细胞生理环境中完全翻译后修饰的受体所提供的信息，补充现有的体外（in vitro）研究数据。
新型非天然氨基酸（ncAAs）的侧链化学基团适用于超快无催化剂生物正交反应，其最新发展使得在活细胞中直接将新一代荧光团安装到蛋白质上用于超分辨率成像成为可能2,43. 这类化学锚包括SCOK中的张力环辛炔14，BCNK中的双环[6.1.0]壬炔12,17，以及 TCO*K 中的反式环辛烯13,15,17 含有降冰片烯的其他非天然氨基酸16,17,44 或环丙烯45,46 部分。用于生物正交化学的体积较大的非天然氨基酸（ncAAs）通常由一种称为PylRS的变体PylRS引入。AF （表示 Y271A 和 Y349F 突变） M. barkeri PylRS)，以及其他 临时的 进化获得的非天然氨基酸tRNA合成酶17,44生物正交锚与四嗪试剂发生反应47 通过逆电子需求的Diels-Alder环加成反应，可在数分钟内实现高标记产率43,48然而，由于正交非天然氨基酸（ncAA）插入系统的整体效率较低，将这一强大方法应用于G蛋白偶联受体（GPCR）的标记一直具有挑战性。利用我们增强的Pyl系统，我们近期已成功实现了在GPCR中高效插入此类氨基酸，并在活体哺乳动物细胞表面实现了GPCR的超快速标记30标记的受体仍具有功能，因其在激动剂激活受体后可发生生理性的内化。本文描述了将生物正交锚点引入G蛋白偶联受体（GPCR）以及后续标记步骤的实验方案。为GPCR装配小型且高亮度的荧光染料，是利用先进显微镜技术在活细胞中研究GPCR结构动态的第一步关键工作。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺 30% (37.5:1)</td><td>卡尔·罗斯</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>对叠氮苯丙氨酸（Azi）</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>苄氧羰基-L-赖氨酸（Lys(Z)）</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>环辛炔-L-赖氨酸（SCOK）</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>卡尔·罗斯</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>增强型化学发光试剂（ECL）&amp;nbsp;</td><td>自制</td><td></td><td>0.1 M Tris-HCl（pH 8.6）中含 10 mg/L 鲁米诺；1100 mg/L&amp;nbsp; DMSO 中的对香豆酸；30&amp;nbsp;% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (1,000 : 100 : 0.3)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>卡尔·罗斯</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>endo-双环[6.1.0]壬炔-L-赖氨酸（BCNK）</td><td>Sichem</td><td>SC-8014</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>卡尔·罗斯</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>卡尔·罗斯</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>鲁米诺</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>卡尔·罗斯</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>卡尔·罗特</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Gr&amp;uuml;ssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>对香豆酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐</td><td>康宁</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>罗氏</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜 Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>四嗪-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>反式环辛烯-L-赖氨酸（TCO*K）</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>卡尔·罗斯特</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 2.5%</td><td>赛默飞世尔科技（吉比科）</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>卡尔·罗斯特</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（30%）</td><td>默克</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293细胞</td><td>德国微生物和细胞培养物保藏中心有限公司（DSMZ）</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T细胞</td><td>德国微生物和细胞培养物保藏中心有限公司（DSMZ）</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>交联仪 Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 根 8 瓦灯管</td></tr><tr><td>BMG LABTECH FLUOstar Omega 酶标仪&amp;nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>质粒 E2AziRS</td><td>E2AziRS 的人源化基因由 Geneart（Life Technologies）合成。</td><td></td><td>含有4个串联拷贝的抑制型tRNA Bst-Yam（由人U6启动子驱动）和一个拷贝的人源化增强型Azi-tRNA合成酶（EAziRS）基因（由PGK启动子驱动）的质粒</td></tr><tr><td>POI-TAG 突变体质粒</td><td></td><td></td><td>编码目的蛋白（由CMV启动子驱动）的质粒，C末端融合FLAG标签，并在指定位置含有TAG密码子&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>克隆至 pcDNA3.1 的多克隆位点（MCS）中</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>克隆至 pcDNA3.1 的多克隆位点（MCS）中</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td><td>由 Genart（Life Technologies）合成</td><td></td><td>克隆至 pcDNA3.1 的多克隆位点（MCS）中</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 抗体偶联物&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&amp;nbsp;</td><td>单克隆，小鼠来源，M2 克隆株</td></tr><tr><td>山羊抗兔-HRP 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>兔抗CRF抗体</td><td>自制</td><td>PBL #rC69</td><td>多克隆 &lt;br/&gt;Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. 内分泌学, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr><tr><td>兔抗Ucn1抗体</td><td>自制</td><td>PBL #5779</td><td>多克隆 &lt;br/&gt;Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. 内分泌学, 140, (1), 71-78 (1999)</td></tr></tbody></table>

优化化学探针在g蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

通过琥珀终止密码子抑制技术将非经典氨基酸（ncAA）遗传整合到蛋白质中，是一种在活细胞内直接向蛋白质安装人工探针和反应基团的强大方法。每种ncAA均由一种特异的正交抑制性tRNA/氨酰-tRNA合成酶（AARS）配对系统导入宿主生物体中实现整合。不同ncAA的整合效率可能存在显著差异，在某些情况下效率不理想。可通过改造AARS或tRNA来优化正交配对系统的性能。然而，在哺乳动物细胞中，利用大规模文库结合生死筛选方法对tRNA或AARS进行定向进化是不可行的。本文介绍了一种简便且稳健的基于荧光的检测方法，用于评估正交配对系统在哺乳动物细胞中的效率。该方法可在适度工作量和合理时间内实现对数十至数百种AARS/tRNA变体的筛选。文中描述了利用该检测方法开发出显著提高吡咯赖氨酸正交系统效率的新tRNA，以及将ncAA应用于G蛋白偶联受体（GPCR）研究的实例——GPCR是ncAA诱变中具有挑战性的研究对象。首先，通过在受体胞外表面系统性地引入光交联ncAA，可在活细胞内直接绘制不同配体在完整受体上的结合位点图谱。其次，通过将最新一代ncAA引入GPCR，实现了在活细胞中利用生物正交应变促进的逆电子需求Diels-Alder环加成反应（SPIEDAC）进行超快速、无需催化剂的受体荧光标记。由于ncAA可普遍应用于任意大小的蛋白质，该方法在多种应用中具有广泛意义。此外，ncAA的整合无需特殊设备，可在标准生物化学实验室中轻松完成。

荧光检测方法的流程如图1所示。该检测方法用于三个应用场景。首先，筛选多种tRNA变体，用于Pyl正交系统介导Lys(Boc)的掺入。Lys(Boc)是一种空间位阻与Pyl相似的氨基酸。由于Pyl尚未商业化供应，Lys(Boc)通常被用作PylRS的标准底物。所筛选的tRNA基于tRNAPyl构建，每种tRNA变体在环区和茎区含有单碱基或碱基对的突变，这些突变经过理性设计，旨在提高tRNA的稳定性及其与真核翻译机制的兼容性。有关tRNA设计的所有细节已在我们近期的研究中详细描述30。典型结果见图2A：不同tRNA产生的抑制效率各不相同，这在测得的荧光信号强度上得到清晰体现。生物学重复实验的小误差棒表明数据具有高度可重复性。其次，评估两种E2AziRS26,51基因变体的性...

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

通过琥珀终止密码子抑制技术将非经典氨基酸（ncAAs）遗传整合到蛋白质中，是一种引入人工探针和……的强大方法。

本实验方案的总体目标是提高非天然氨基酸在哺乳动物细胞中的整合效率，以解决活细胞环境中的生物学问题，包括蛋白质-蛋白质相互作用表面的绘制以及细胞表面受体的生物正交标记。利用琥珀密码子抑制技术，不同非天然氨基酸的整合效率各异。我们建立了荧光检测方法，可在短时间内方便地比较非天然氨基酸在哺乳动物细胞中的整合速率。通过在 GPCR 表面系统性地引入光交联非经典氨基酸，可实现对配体结合位点的定位，并直接从活细胞中获取受体结合信息。通过引入新一代用于生物正交化学的非经典氨基酸，我们实现了在活体哺乳动物细胞中，利用小而明亮的荧光团对 GPCR 进行位点特异性、超快速、无需催化剂的标记，适用于高端成像应用。首先，在两块六孔板中，每孔接种 600,000 个 HEK 293 细胞，每孔加入两毫升完全培养基。准备的孔数应与样品数量相同，并额外准备两孔，分别用于野生型EGFP和空载体转染对照样品。转染前一小时，向所有孔中加入适量新配制的非天然氨基酸储备液，使最终氨基酸浓度为0.25至0.5毫摩尔。为转染细胞，在微量离心管中将一微克待检测的编码氨酰-tRNA合成酶-tRNA配对的质粒DNA与一微克报告质粒DNA混合。在不同的离心管中，使用 EGFP 野生型参照物进行相同的转染操作，并设置一次空白转染。随后，向每支含有 DNA 的离心管中加入 100 微升乳酸盐缓冲液。短暂混匀后，向每支离心管中加入 6 微升浓度为 1 微克/微升的 PEI 以及乳酸盐缓冲液。立即涡旋混匀，室温孵育10至15分钟。从每个孔中转移400微升细胞培养基至DNA-PEI混合物中，以中和pH值。然后，将DNA混合物缓慢滴加到细胞上。转染后48小时收获细胞，吸除培养基，用2毫升预温的PBS洗涤细胞一次。加入800微升含0.5毫摩尔/升EDTA的PBS，于37摄氏度孵育20分钟。孵育结束后，通过反复吹打使细胞脱离并悬浮。接下来，将细胞悬液转移至含有200 µL PBS（补充5 mM氯化镁）的微量离心管中。在800 × g条件下离心2分钟。离心结束后，弃去上清液。现在，向细胞沉淀中加入 100 µL Tris 裂解缓冲液，冰上孵育 30 分钟。为促进裂解，每 5 分钟涡旋振荡一次。在 4 °C、14,000 ×g 条件下离心 10 分钟，沉淀细胞碎片。将90微升上清液转移至黑色96孔板中。然后使用配备荧光检测模块的酶标仪测定EGFP和mCherry荧光。在两个六孔板中，每孔加入两毫升完全培养基，分别接种500,000个293 t细胞。针对每个待筛选的位置，每种配体准备一个孔，另加一个结合对照孔。转染前一小时，向所有孔中加入光交联剂对叠氮苯丙氨酸（p-azidophenylalanine）或 Azi，使其终浓度为 0.5 毫摩尔。每孔共转染总量为 2 微克 DNA，其中包含 1 微克编码在目标位置带有标签密码子的 F

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科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

生物哺乳动物细胞光交联图谱和 Bioorthogonal 化学中化学探针的遗传受体优化

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

本文介绍了一种利用光亲和标记技术鉴定小分子结合蛋白的方法。该技术的优势在于，目标蛋白的结合及共价标记过程均在活细胞环境中进行，从而避免了细胞裂解可能对天然蛋白结构及结合条件造成的破坏。...

通过活细胞光亲和标记在天然细胞环境中鉴定小分子结合蛋白

本文介绍了一种通过光遗传学控制和活细胞监测基因表达来分析细胞间振荡信息传递的实验方案。该方法为在多细胞系统中检验动态基因表达程序的功能意义提供了独特的研究平台。...

一种控制和分析细胞间相互作用中基因表达模式的光遗传学方法

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。...

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。...

使用&#967;CRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

可靠地控制光响应性哺乳动物细胞需要对光遗传学方法进行标准化。为实现这一目标，本研究以负反馈光遗传学基因回路为案例，提出了一套标准化研究光诱导基因表达的流程，包括基因回路构建、细胞工程、光遗传学设备操作以及验证性检测方法。...

在哺乳动物细胞中可靠地构建与调控稳定的光遗传学基因回路

我们介绍了一种实验方案和数据分析流程，用于在活细胞中结合现代荧光标记技术，开展活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与荧光共振能量转移（FRET）联用研究膜受体动力学。...

双色荧光交叉相关光谱法研究活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动力学

本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。...

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

本研究描述了一种利用3D打印LED阵列进行高通量实验的方法，用于优化HEK293T细胞中光诱导基因表达。...

快速优化光诱导系统以调控哺乳动物基因表达

了解哺乳动物细胞中非经典氨基酸的高效掺入方法，利用荧光检测和光交联技术绘制G蛋白偶联受体的配体结合位点，实现活细胞中受体的生物正交标记与高分辨率成像。

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

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