采用自动结晶耦合原位动态光散射的不同尺寸生长蛋白晶体

正如汉堡超快成像中心所研究的那样，这种方法可以帮助回答蛋白质结晶领域的关键问题，例如成核的时间点、晶体生长机制或如何制备纳米/微晶体。该技术的主要优点是实时监测样品演变，从而能够获取有价值的信息，例如不同结晶阶段溶液中颗粒的径向分布。虽然这种方法可以提供蛋白质微结晶的见解，但它也可用于用于经典晶体学的蛋白质或用于中子衍射的大蛋白质晶体的生长。

这种方法的视觉演示很重要，因为它展示了独特结晶装置的工作原理。首先，使用 2 微米无菌注射器过滤器过滤 16 毫升 1.2 摩尔酒石酸钠溶液和 16 毫升蒸馏水。在沉淀剂和水瓶中加入 5 毫升过滤后的溶液。

然后将瓶子安装在实验室的泵架上。在软件窗口中，设置温度为 20 摄氏度、相对湿度为 20 且以水为溶剂的实验参数。打开实验室的前门并取下盖玻片托架。

将干净的硅化盖玻片放在载体上，然后将其放回设备中。关闭实验室以确保环境条件。使用 Text Protocol 中的主要泵特性打开 Pump Zero，并创建一条水流。

通过手动作指定的调节螺钉，将位置对准盖玻片的中心，调整水流。关闭 Pump Zero，然后打开 Pump One 并创建液体流，就像以前一样。将泵 1 的流位置调整为泵 0 的固定位置。

关闭泵 1 后，用新的、干净的盖玻片替换用过的盖玻片进行结晶实验。使用软件包创建新的实验文件。在实验文件中，将蛋白质输入为 Thaumatococcus daniellii;蛋白质浓度为 14 毫克/毫升，沉淀剂为酒石酸钠，沉淀剂浓度为 1.2 摩尔。

加载新的实验文件以激活此信息后，使用 Pump Zero 添加一个小水滴，在蛋白质液滴上标记位置。按下 Tara' 按钮将微量天平归零。打开实验室的顶盖，在水地标上吸取 8 微升索马汀溶液。

要注册新的 Thaumatin drop，请先单击 New Drop'以归因实验文件中的初始条件。然后单击 Constant（常数）按钮以补偿水滴中水的自然蒸发。使用 CCD 相机检查 Pump Zero 是否瞄准蛋白质液滴。

如果水流对准水滴外部，请重新调整 Pump Zero 的位置。打开 DLS 激光器，并使用手动调节螺钉将激光束放入蛋白滴中。输入 DLS 参数，测量持续时间为 60 秒，两次测量之间的等待时间为 10 秒，测量次数为 300。

单击 Start（开始）按钮启动 DLS 测量。通过选择一种 DLS 图形表示来检查样本的质量。在计划表中输入蒸发步骤的条件，如文本协议所示。

然后通过单击 Automation（自动化）按钮激活样品蒸发步骤。样品蒸发步骤完成后，单击 Stop（停止）按钮。激活常数按钮以保持液滴的重量不变。

此功能将补偿样品自然蒸发的可能性，并确保在采取进一步措施之前不会发生浓度变化。接下来，在计划表中输入沉淀剂添加步骤的条件，如文本方案中所列。通过单击 Automation 按钮激活沉淀剂添加步骤。

要跟踪结晶液滴随时间的演变，请使用 CCD 相机检查索马甜晶体的外观。使用 DLS 图形表示检查粒度分布。还可以使用显示窗口检查重量和实验参数的演变。

此窗口中显示的所有信息都是根据结晶过程中的重量变化实时计算和显示的，这些变化由超灵敏天平在线记录。通过向板中加入 3 毫升石蜡油，涂布干净的标准 Terasaki 板。通过以不同的角度轻轻移动板，使油覆盖所有 72 个孔，将石蜡油涂抹在板孔上。

倒出漂浮在板上的任何油，去除多余的石蜡油。单击 Stop（停止）按钮完成结晶实验。小心地取出含有结晶液滴的样品载体。

使用移液管，将两微升结晶滴放入 Terasaki 板的孔中。通过在油下回收板中的结晶滴，可以使用显微镜或其他与 Terasaki 板配合使用的二元论技术定期检查样品在晶体生长中的稳定性。此处显示的是半径图分布，显示了从单体蛋白质到形成细胞核、纳米晶体和微晶体的整个结晶过程中蛋白质液滴中粒径的增长。

在这里，绘图表示蛋白质液滴重量随时间的变化，以及计算的蛋白质浓度和沉淀剂浓度。此处显示的是实验结束时索马甜微晶体的记录照片。液滴显示蛋白质溶液中饱和的非常丰富的小微晶体。

一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 1 小时 30 分钟内完成。在尝试此过程时，请务必将微剂量系统中的 DLS 激光器调整到蛋白质液滴中。看完这个视频后，您应该对如何轻松作这种结晶装置有一个很好的了解，以便成功地使蛋白质样品结晶。

由于原位动态光散射直接耦合到结晶液滴，因此这种方法是可能的。这使我们能够监测半径分布的所有变化，因此，我们可以确定结晶或蛋白质沉淀的某些分布模式。在此程序之后，可以应用其他方法（如冷冻电子显微镜或电子衍射）来回答其他问题，并验证溶液中亚微米级颗粒的结晶状态。

这项技术的影响延伸到成核的两步理论，因为 DLS 图显示了溶液中颗粒双倍大小的分布的清晰模式，这些颗粒在晶体生长之前。