使用自动化结晶技术培养具有不同尺寸的蛋白质晶体 原位 动态光散射

该方法有助于解答蛋白质结晶领域中的关键问题，例如成核时间点、晶体生长机制或如何制备纳米/微米级晶体，正如汉堡超快成像中心所研究的那样。该技术的主要优势在于能够实时监测样品的演化过程，从而获取有价值的信息，例如在不同结晶阶段溶液中颗粒的径向分布情况。尽管该方法可用于研究蛋白质微晶的形成过程，也可应用于传统晶体学所用的蛋白质，或用于生长用于中子衍射的大尺寸蛋白质晶体。

该方法的可视化演示非常重要，因为它展示了这一独特结晶装置的工作原理。首先，使用2微米无菌注射器滤器过滤16毫升1.2摩尔的酒石酸钠溶液和16毫升蒸馏水。将过滤后的溶液各取5毫升分别加入沉淀剂瓶和水瓶中。

然后将瓶子安装在实验腔室的泵架上。在软件窗口中设置实验参数：温度为 20 摄氏度，相对湿度为 20，溶剂为水。打开实验腔室的前门，取出盖玻片载体。

将洁净且经硅化处理的盖玻片放置在载片上，并将其放回装置中。关闭实验腔室以维持稳定的环境条件。开启零号泵，采用文本方案中所述的主要泵参数，建立水流。

通过手动操作指定的调节螺钉，调整水流，使水流位置对准盖玻片中心。关闭泵零，然后开启泵一，并像之前一样形成液流。调节泵一的液流位置，使其对准泵零已固定的位置。

关闭泵一后，将用过的盖玻片更换为新的洁净盖玻片，用于结晶实验。使用软件包创建一个新的实验文件。在实验文件中，输入蛋白质为来自丹尼尔索马甜植物（Thaumatococcus daniellii）的索马甜（Thaumatin），蛋白质浓度为 14 毫克每毫升，沉淀剂为酒石酸钠，沉淀剂浓度为 1.2 摩尔。

加载新的实验文件以激活此信息后，使用零号泵添加一滴少量水，在蛋白质液滴位置做标记。按下“去皮”按钮将微量天平归零。打开实验腔室的顶盖，用移液器将8微升的索马甜溶液滴加到水标记处。

要注册新的仙茅蛋白液滴，请首先点击“New Drop”按钮，以从实验文件中获取初始条件。然后点击“Constant”按钮，以补偿液滴中水分的自然蒸发。使用CCD相机检查Pump Zero是否对准了蛋白质液滴。

如果水流未对准液滴，需重新调整零号泵的位置。开启DLS激光器，并通过手动调节旋钮将激光束对准蛋白质液滴。设置DLS参数：测量持续时间为60秒，两次测量之间的等待时间为10秒，测量次数为300次。

点击“开始”按钮以启动动态光散射（DLS）测量。通过选择一种DLS图形表示方式来检查样品质量。在时间表中输入蒸发步骤的条件，具体操作如文本方案所示。

然后通过单击“自动化”按钮启动样品蒸发步骤。当样品蒸发步骤完成后，单击“停止”按钮。激活“恒重”按钮以保持液滴重量恒定。

此功能将补偿样品自然蒸发的可能性，并确保在采取进一步操作之前不会发生任何浓度变化。接下来，在时间表中输入文本方案中列出的沉淀剂添加步骤的条件。通过单击“自动化”按钮来启动沉淀剂添加步骤。

为了追踪结晶液滴随时间的演变过程，使用CCD相机观察甜蛋白（Thaumatin）晶体的形成情况。通过动态光散射（DLS）图示分析颗粒尺寸分布。同时，利用显示窗口监测重量及实验参数的变化情况。

本窗口中显示的所有信息均基于结晶过程中由超灵敏天平在线记录的重量变化，实时计算并显示。向干净的标准 Terasaki 板中加入 3 毫升石蜡油，以包被该板。通过轻轻倾斜板子至不同角度，使石蜡油均匀分布至板上的孔中，确保覆盖全部 72 个孔。

倒出板上漂浮的多余石蜡油，以去除过量的石蜡油。点击“停止”按钮以结束结晶实验。小心取出含有结晶液滴的样品载体。

使用移液器将两微升的结晶液滴分装至Terasaki板的孔中。通过在油下将结晶液滴回收至板内，可利用显微镜或其他适用于Terasaki板的微滴技术，定期检测样品在晶体生长过程中的稳定性。此处展示的是半径分布图，显示了在整个结晶过程中，蛋白质液滴内颗粒尺寸从单体蛋白逐步形成晶核、纳米晶体及微米晶体的生长情况。

此处的曲线图展示了蛋白质液滴重量随时间的变化过程，以及计算得到的蛋白质浓度和沉淀剂浓度。图中显示的是实验结束时甜蛋白微晶的拍摄照片。该液滴中含有大量微小晶体，蛋白质溶液已达到饱和状态。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在1小时30分钟内完成。在进行此操作时，重要的是要将动态光散射（DLS）激光准确调整至微剂量系统中的蛋白质液滴内。观看本视频后，您应能充分理解如何轻松操作该结晶装置，以成功实现蛋白质样品的结晶。

该方法得以实现得益于原位动态光散射技术，该技术直接与结晶液滴耦合。这使得我们能够监测半径分布中的所有变化，从而可以将特定的分布模式精确对应到结晶或蛋白质沉淀过程。在此基础上，可进一步采用其他方法，如冷冻电子显微镜或电子衍射，以回答更多科学问题，并验证溶液中亚微米级颗粒的晶体状态。

该技术的意义延伸至成核的两步理论，因为DLS图谱显示溶液中存在明显成对分布的颗粒，这些颗粒出现在晶体生长之前。