一种蓝鳉（Nothobranchius furzeri）实验室饲养方案

本实验方案的总体目标是成功建立蓝鳉鱼的实验室种群，以快速、高通量的方式研究衰老及与年龄相关的疾病。该方法有助于回答衰老研究领域中的关键问题，例如单个基因突变或环境干预是否能够调节脊椎动物物种的衰老过程。该技术的主要优势在于，通过遵循我们的基本操作规程，多个实验室现在均可开展基于蓝鳉鱼的实验研究。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到一些困难，因为鳉鱼的饲养具有一些独特的特点。例如，胚胎在孵化前需在干燥基质上培养，这与斑马鱼等经典鱼类模型有显著差异。开始时，准备若干个9.5升的繁殖缸，每缸放入一条五周龄的雄鱼和两条六至七周龄的雌鱼。

然后，用高压灭菌的沙子填充一个塑料容器，深度约为两到三厘米，并将沙盒置于繁殖缸的中央。让 turquoise killifish 持续繁殖，并每周收集一次胚胎用于胚胎孵化。为了获取可用于显微注射及转基因品系建立的单细胞期胚胎，按上述方法设置一个繁殖缸，其中放入一条雄鱼和两条雌鱼。

在收集胚胎前两天，将雄鱼转移至单独的鱼缸中，并使其与成年雌鱼保持视觉接触。收集当天，将雄鱼和产卵沙盒放入繁殖缸中，让鱼类产卵两小时。产卵结束后，将沙盒从鱼缸中取出，倒入筛网中，并用系统水冲洗沙盒。

然后将滤网部分浸入系统水中，轻轻旋转，使胚胎聚集在中央。使用一支2毫升的巴斯德移液管收集胚胎，并将其转移至含有约40毫升系统水的90毫米培养皿中。在光学显微镜下检查培养皿中的胚胎，移除具有破裂的卵膜及损伤迹象的胚胎。

根据文本方案漂白胚胎后，检查并移除任何被染成蓝色的死亡胚胎。待胚胎在新鲜的亚甲蓝溶液中孵育后，检查已发育的胚胎是否具有可见的黑色眼睛。然后使用一次性巴斯德吸管或精细弯头镊子，将胚胎转移至滤纸板上。

将未发育的胚胎保留在亚甲蓝中，并每天进行观察。一旦胚胎发育出黑色眼睛，即转移到固体基质培养基中。用镊子将胚胎分散开，每90毫米培养皿中最多放置100个胚胎，胚胎之间间距约为5毫米。

然后用石蜡密封培养皿，并将胚胎在28摄氏度下孵育两到三周，直至其虹膜完全发育呈金黄色，达到孵化阶段。若需长期保存长达一年，可在亚甲蓝溶液中孵育三天后，将胚胎转移至固体基质培养基平板上（方法如前所述），并在17摄氏度下继续孵育。孵化鱼类时，使用精细的弯头镊子小心地将50至100个发育完全的胚胎转移至孵化盒中，完全浸入浓度不超过两厘米深的腐殖酸溶液中，并在4摄氏度下进行孵化。

该方案中的一个关键步骤是孵化鳉鱼胚胎，具体方法是将已在干燥基质中孵育的胚胎转移至含有腐殖酸的孵化液中，并提供充足的通气。用盖子盖住孵化盒，并将其置于28摄氏度的孵化培养箱中孵育。为保证充足的通气，需通过软管将孵化盒连接至供气装置。

为保持孵化盒内充足的水质，从孵化后第二天开始，每天补充一次经高压灭菌的系统水，补充比例为1:1，最终水深维持在2厘米。将未孵化的胚胎转移回固体基质中，并于一周后再次尝试孵化。在孵化后第五天开始饲养幼鱼和成鱼时，使用一次性塑料移液管或塑料勺小心地将幼鱼转移至循环水系统中，每0.8升水体的养殖缸中放入5尾幼鱼，并配备孔径为400微米的幼鱼筛网。

在14日龄时，将幼鱼转移至装有850微米幼鱼筛网的2.8升水族箱中。此后，需在每个水族箱上标注鱼类编号。进行存活率检测时，每条鱼应单独饲养于一个水族箱中。用于存活率检测的鱼类也需单独饲养在2.8升的水族箱中。

在接下来的七天内，每天喂食幼鱼两次，每次给予五毫升卤虫，并补充一至三条活体血虫。在四周龄时，每天喂食每条鱼两次，食物包括卤虫和一毫升血虫。在此阶段，通过检查雄鱼是否具有较大的背鳍、肛鳍和尾鳍并出现体色着色迹象，以及雌鱼是否具有充满卵子的圆润腹部，来确保鱼类达到完全性成熟。

图中展示的是 70 条雄性青鳉鱼的代表性生存曲线。在 GRZ 品系中，适当的饲养管理可使中位生存期达到 12 至 28 周。中位生存期的差异取决于饮食、喂食频率和饲养温度条件。

在较差养殖条件下饲养的鱼类的生存曲线显示，与最佳养殖条件下的鱼类相比，其早期死亡率增加，并且在整个时间段内生存率反复出现突然下降。在遵循本方案时，密切监测水质以及初孵仔鱼的残余食物至关重要，因为必须确保这些鱼类处于清洁的环境中。该技术建立后，为研究人员探索青鳉鱼的实验操作铺平了道路，包括转基因、基因组编辑以及饮食干预等操作。

观看本视频后，您应能充分了解如何在实验室中成功培育 turquoise killifish，并利用这一模型研究可在人工饲养条件下存活的最短寿脊椎动物的衰老生物学。