Name: 绿松石鳉鱼实验室外壳的协议 (Nothobranchiusfurzeri) (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 了解绿松石鳉鱼实验室饲养方法，用于衰老及年龄相关疾病研究。本方案涵盖繁殖、胚胎孵化、幼鱼培育及成鱼管理，为高通量衰老生物学研究提供标准化操作流程。

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我们感谢Alessandro Cellerino、Tyrone Genade、Anne Brunet、Sabrina Sharp、Mickie Powell、Simone Keil、Yumi Kim、Patrick Smith、Kai Mathar以及马克斯·普朗克衰老生物学研究所Valenzano实验室的全体成员，多年来为当前鳉鱼饲养方案的各个部分做出了贡献。

鱼类在28 °C的循环水系统中饲养（参见水质参数），每天换水10 - 20%。推荐使用三种不同规格的水族箱：0.8 L、2.8 L和9.5 L。每个水族箱的水流速度保持恒定，为2 mL/s。
1. 试剂准备（材料中未包含）
注意：非洲 turquoise 鳉（Nothobranchius furzeri）可由已建立的实验室品系提供。这种一年生鳉鱼具有抗干燥的胚胎，可通过邮寄运输。运输时必须确保胚胎处于 8 - 30 °C 的温度范围内。
<ol>
	<li>通过将1 g/L的腐殖酸溶解于系统水中，配制腐殖酸（孵化）溶液。经高压灭菌后，于4 °C保存，最长可保存10周。</li>
	<li>配制HUFA强化的卤虫时，每日向卤虫孵化器中添加HUFA强化剂，浓度为每升卤虫溶液加入500 µL。</li>
	<li>将100 µL/L的亚甲蓝储备液溶于先前高压灭菌的系统水中，配制亚甲蓝溶液。由于亚甲蓝对光敏感，需将溶液保存于避光瓶中或用铝箔包裹。室温保存。</li>
	<li>准备椰纤作为胚胎孵育的固体基质。也可使用滤纸（见第1.5节）。
	<ol>
		<li>用蒸馏水预先浸泡椰纤。经高压灭菌后，于4 °C保存，最长可保存5周。</li>
		<li>在胚胎&#160;转移当天，准备含有湿润椰纤的培养皿。</li>
		<li>在通风橱内并靠近火焰处，向直径90 mm的培养皿中填充椰纤，以减少酵母和细菌污染。</li>
		<li>使用无菌组织将椰纤压实至1 cm高度。通过在培养皿表面覆盖纸巾并按压，去除椰纤中大部分水分，使纸巾吸收多余水分。将金属勺在火焰上加热后，压过椰纤整个表面，以防止真菌/细菌污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备滤纸作为胚胎孵育的固体基质。
	<ol>
		<li>在胚胎转移当天，放置三层适配90 mm培养皿的滤纸圆片，并加入5 mL腐殖酸溶液以维持湿度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 繁殖
<ol>
	<li>为品系维持繁殖青鳉鱼 
	注意：按照本方案，秀丽隐杆线虫在孵化后约4周达到性成熟，繁殖力在7至9周时达到高峰。需特别注意，繁殖力取决于喂食频率和食物质量；因此，每个繁殖用培养皿每天至少需喂食两次。&#160;建议提高胚胎产量（参见第5.6节）
	<ol>
		<li>设置一个9.5 L的繁殖缸，加入系统用水，并放入一条雄鱼和两条雌鱼。</li>
		<li>由于雄性非洲蓝鳉在交配时表现出支配行为，可能会骚扰雌性，因此选择体型略小于雌性的雄鱼，以减少交配压力并提高繁殖产出。将5周龄的雄鱼与6至7周龄的雌鱼配对饲养。</li>
		<li>将高压灭菌的沙子填充至一个塑料容器（10 × 10 × 5 cm）中，使沙层最终深度约为 2–3 cm，然后将沙盒置于繁殖缸中央。</li>
		<li>让 turquoise killifish 持续繁殖，并每周采集一次胚胎用于胚胎培养。 
		注意：使用沙质基质会对集中过滤系统造成挑战，未来应采用其他替代方法。可能的替代方案包括使用斑马鱼繁育缸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转基因育种 
	注意：用于显微注射的胚胎需在单细胞阶段保持同步，因此必须在受精后立即收集。
	<ol>
		<li>为获取可用于显微注射及转基因品系构建的单细胞期胚胎，设置一个繁殖缸，其中放入一条雄鱼和两条雌鱼（同2.1节）。</li>
		<li>在收集胚胎前两天，将雄鱼单独隔离于一个独立的水族箱中，并使其能够与成年雌鱼保持视觉接触。</li>
		<li>在采集当天，将雄鱼和一个沙盒放入繁殖缸中，让其产卵2小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胚胎培育
<ol>
	<li>胚胎收集 
	注意：胚胎收集通过筛网从沙箱中收获胚胎完成。在正常条件下，每个沙箱应含有 30 至 200 个胚胎。
	<ol>
		<li>在收集当天，将沙箱从繁殖缸中取出。将沙箱内容物倒入筛网（筛孔大小约 0.9 mm）中，并用系统水冲洗。此操作可在大型水族箱上方进行，以便回收沙子用于高压灭菌。</li>
		<li>将筛网部分浸入系统水中，轻轻搅动，使&#160;胚胎聚集于中心。</li>
		<li>使用 10 mL 巴斯德移液管收集胚胎。</li>
		<li>将胚胎转移至含有约 40 mL 系统水的 90 mm 培养皿中。</li>
		<li>在体视显微镜下检查培养皿中的胚胎，移除具有破裂卵膜或损伤迹象的胚胎。</li>
		<li>立即进入胚胎漂白步骤。 
		注意：始终为每种鱼品系使用单独的筛网，以防止不同品系胚胎之间可能的交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎漂白 
	注意：胚胎漂白可防止鱼缸中存在的微生物污染培养基。
	<ol>
		<li>漂白前，使用一次性巴斯德移液管将含有收集胚胎的培养皿中的系统水吸除。</li>
		<li>为防止真菌和细菌的非预期生长，向收集的胚胎中加入 50 mL 新鲜配制的 H2O2 溶液（1% v/v，溶于高压灭菌的系统水中）。</li>
		<li>在 90 mm 培养皿中，以低速振荡 50 mL 溶液中的胚胎 5 分钟。</li>
		<li>用一次性巴斯德移液管吸除 H2O2 溶液，并用 50 mL 亚甲蓝溶液洗涤胚胎三次，每次 5 分钟。随后吸除亚甲蓝溶液。</li>
		<li>向胚胎中加入 50 mL H2O2 溶液（1% v/v，溶于高压灭菌的系统水中），振荡 5 分钟。</li>
		<li>吸除 H2O2 溶液，并用 50 mL 亚甲蓝溶液洗涤三次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将胚胎在 28 °C 下孵育，以促进胚胎发育同步化，每 90 mm 培养皿中最多放置 100 个胚胎，置于 40 mL 亚甲蓝溶液中。 
		注意：切勿延长胚胎&#160;在漂白液中的孵育时间。这可能导致卵膜损伤，并增加胚胎死亡率。胚胎漂白可能引起卵膜显著的理化变化，从而影响卵膜生理功能及孵化成功率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亚甲蓝溶液中的胚胎孵育 
	注意：在亚甲蓝溶液中进行液体孵育可抑制寄生虫生长，并便于识别死亡胚胎和未受精卵。
	<ol>
		<li>检查孵育中的胚胎，从培养皿中移除任何死亡胚胎（被亚甲蓝染成蓝色），以防止真菌和细菌污染，从而影响健康活胚胎的存活。</li>
		<li>吸除旧的亚甲蓝溶液，并更换为新鲜溶液。</li>
		<li>将培养皿放回 28 °C 培养箱中（图 1A）。在 7 至 10 天内，确保发育中的胚胎出现可见的黑色眼点。将这些胚胎转移至椰壳纤维或滤纸等固体基质培养基中（图 1B）。</li>
		<li>将未发育的胚胎保留在亚甲蓝溶液中，每日监测，待其出现黑色眼点后转移至固体基质培养基。</li>
		<li>重复步骤 3.3.1–3.3.3，直至胚胎出现可见的黑色眼点。 
		注意：胚胎长期暴露于亚甲蓝可能诱导成年鱼生理上的长期改变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎转移至滤纸 
	注意：蓝鳉胚胎可在干燥基质上发育，模拟自然条件。此外，干燥孵育可使研究人员同步胚胎发育，并在同一时间孵化。
	<ol>
		<li>当胚胎在 7 至 10 天内发育出可见的黑色眼点时，使用一次性巴斯德移液管或精细弯头镊子将胚胎从亚甲蓝溶液中转移至预先准备好的滤纸培养皿上。</li>
		<li>用镊子将胚胎间隔约 5 mm 分布，每 90 mm 培养皿最多放置 100 个胚胎（图 1B）。</li>
		<li>用封口膜密封培养皿。</li>
		<li>在 28 °C 下孵育胚胎 2 至 3 周，直至其完全发育出金黄色虹膜并准备孵化（图 1C）。 
		注意：切勿将已准备孵化的胚胎孵育超过 2 周，否则其活力将显著下降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胚胎转移至椰壳纤维 
	注意：经高压灭菌的无菌椰壳纤维（或有机泥炭藓）可作为固体基质孵育的有效替代培养基。
	<ol>
		<li>使用一次性巴斯德移液管或精细弯头镊子将胚胎从亚甲蓝溶液中转移至可直接使用的椰壳纤维培养皿上。</li>
		<li>将胚胎间隔约 5 mm 分布，每 90 mm 培养皿最多放置 100 个胚胎（图 1B）。</li>
		<li>用封口膜密封培养皿。</li>
		<li>在 28 °C 下孵育胚胎 2 至 3 周，直至其完全发育出金黄色虹膜（例如 图 1C 所示）。 
		注意：如需长期保存（最长一年），可在收集后第 3 天将胚胎从亚甲蓝溶液转移至固体基质培养皿中，并在 17 °C 下孵育，直至其发育出黑色眼点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 孵化青鳉鱼
注意：青鳉鱼胚胎可在腐殖酸溶液中成功孵化14。
<ol>
	<li>使用精细的弯头镊子，小心地将50至100个发育良好的胚胎转移至装有腐殖酸溶液的孵化盒中，溶液温度为4 °C。腐殖酸溶液的成分为每升系统水中含1 g腐殖酸。溶液经高压灭菌后，于4 °C保存，最长可保存10周。确保所有胚胎完全浸没在溶液中。腐殖酸溶液应较浅，深度不得超过2 cm。 
	注意：较低的腐殖酸溶液温度有助于提高孵化率，且胚胎完全浸没可实现同步孵化。</li>
	<li>将孵化盒放入28 °C的孵化培养箱中，并用盖子盖好孵化盒。为提供充足的通气，通过软管将孵化盒连接至供气装置。 
	注意：孵化期间通气不足会导致仔鱼无法充气鳔（即出现&#34;腹滑&#34;表型，详见第5.1节注释）。</li>
	<li>从孵化后的第二天起，为维持孵化盒内良好的水质，每天添加一次经高压灭菌的系统水，添加比例为1:1，保持最终水深为2 cm。</li>
	<li>将未孵化的胚胎重新转移回固体基质中，并于一周后再次尝试孵化。 
	注意：孵化后， turquoise killifish（青鳉鱼）能够立即摄取并食用活体饵料。为获得最佳生长效果，每天投喂两次过量的 freshly hatched brine shrimp（卤虫无节幼体，Artemia salina）。每次投喂后10至15分钟，仔鱼腹部呈现橙色即为饱食标志。每日使用巴斯德移液管吸除多余、未食用及已分解的卤虫。</li>
</ol>
5. 幼鱼和成鱼的培育
<ol>
	<li>孵化后第五天，将幼鱼转移至水循环系统。使用一次性塑料移液管（或塑料勺），小心地将五尾幼鱼转移至每个配备400 µm幼鱼筛网的0.8 L水族箱中。图2). 
	注意：部分幼年鳉鱼可能尚未充气鱼鳔，从而表现出典型的 &#34;腹侧滑行器&#34; 表型特征为鱼类无法获得正常浮力，被迫持续游动，导致成鱼出现严重畸形。这些鱼类无法用于存活率检测或高效繁殖，需予以剔除。</li>
	<li>每天两次，以过量的 freshly hatched brine shrimp 喂养幼鱼，直至孵化后14天。每天用虹吸法清除每个水箱底部的残渣。</li>
	<li>在14日龄时，将幼鱼转移至配备850 µm幼鱼筛网的2.8 L水族箱中。此后，需在每个水族箱上标注鱼只编号，注明孵化日期、品系信息、鱼的性别及鱼只识别编号图3）。进行存活率检测时，从此刻起将每条鱼单独饲养在各自的容器中。</li>
	<li>在接下来的7天内，每天喂食幼体两次&#160;每天每条鱼喂食约 2 mL 的丰年虾。此阶段可额外补充 1 至 3 条活水蚤（若水蚤幼虫对鱼而言过大，可用刀片将其切成更小的片段）。为防止水质恶化，每周用虹吸法清除残余食物和其他废物两次。</li>
	<li>孵化3周后，从水箱后部移除幼鱼隔离网，开始每天两次投喂每条鱼约2 mL卤虫和0.5 mL血虫。在此阶段，幼鱼体长应已达到1 cm，能够摄食完整大小的血虫。</li>
	<li>在4周龄时，每天喂食每条鱼两次，每次约2 mL卤虫和1 mL血虫。雌鱼可共同饲养，密度最高可达每2.8 L水体饲养3条雌鱼。</li>
	<li>在此阶段，确保鱼类达到完全性成熟。检查雄鱼是否具有较大的背鳍、臀鳍和尾鳍，并出现体色着色迹象；检查雌鱼腹部是否圆润且充满卵子。 
	注意：将成年鱼在单独的鱼缸中饲养以进行生存队列研究可能会对鱼的行为和健康产生负面影响。然而，将鱼类群体饲养用于生存队列研究也会因社会优势关系和雄性领地的形成而引入显著的混杂因素，从而导致严格的社会等级结构。</li>
</ol>
6. 喂养
注意：实验室饲养的青鳉鱼可投喂卤虫（Artemia salina 无节幼体）和摇蚊（Chironomus spp. 幼虫）的混合饲料。青鳉鱼仔鱼仅投喂卤虫无节幼体。幼鱼和成鱼每天投喂两次卤虫和摇蚊（图2）。理想情况下，可每日多次投喂，超过本方案中所述的每日两次投喂频率。
<ol>
	<li>卤虫培养
	<ol>
		<li>向卤虫孵化器中加入 10 L 反渗透（RO）水和 350 g 红海盐，通过曝气管进行曝气以充分溶解。</li>
		<li>向培养液中添加 5 mL 高度不饱和脂肪酸（HUFA）进行营养强化。</li>
		<li>向孵化液中加入 20 g 卤虫卵囊。检查卤虫卵囊是否未漂浮于水面，并确保培养体系具有充足的氧气供应和良好的循环。 
		注意：干燥的卤虫卵囊可每日取用，并在 4 °C 下储存。</li>
		<li>次日下午，向培养体系中再补充 5 mL HUFA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集孵化后的卤虫 
	注意：自开始培养约 36 小时后，卤虫即可收获（二龄幼体阶段）。
	<ol>
		<li>使用孵化器底部的出水口将 5 L 培养液收集至容器中，静置 10 分钟。</li>
		<li>10 分钟后，去除 5 L 容器液面的卤虫卵壳（呈棕色），并将孵化出的卤虫（呈橙色）通过筛网过滤。注意避免收集容器底部的沉淀物，因其含有未孵化的卵和死亡的卤虫。</li>
		<li>用 RO 水将孵化出的卤虫冲洗至 2 L 容器中，静置 10 分钟。</li>
		<li>10 分钟后，再次通过筛网过滤卤虫，并将其收集至 2 L RO 水中。</li>
		<li>重复上述三个步骤，直至卤虫溶液中无未孵化的卵囊和卵壳残留。</li>
		<li>将 2 L 容器中的卤虫转移至挤压瓶中，用于投喂。 
		注意：卤虫培养过程较为稳定可靠。然而，为避免孵化失败导致卤虫供应不足，可使用较小容量（500 mL）的备用孵化器作为补充。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>备用孵化器的设置
	<ol>
		<li>在 500 mL RO 水中加入 17.5 g 红海盐，通过曝气使其溶解。</li>
		<li>向培养液中添加 500 µL HUFA 进行营养强化。</li>
		<li>加入 2 g 卤虫卵囊。</li>
		<li>18 至 24 小时后，再次向培养液中补充 500 µL HUFA。 
		注意：卤虫约在 24 小时后即可收获。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体摇蚊幼虫的制备
	<ol>
		<li>投喂前立即用 RO 水通过滤网过滤适量的活体摇蚊幼虫。 
		注意：活体摇蚊幼虫可在 4 °C 下保存 7 至 10 天。</li>
		<li>用少量 RO 水将摇蚊幼虫冲洗至塑料容器中。</li>
		<li>使用去尖端的塑料巴斯德吸管吸取摇蚊幼虫混合物，用于投喂。 
		注意：使用来源未经控制的活体食物喂养实验室鳉鱼种群，可能引入寄生虫及潜在致病微生物群落，带来外部污染风险。未来应开发专用的无菌鱼类饲料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 非洲鳉鱼实验室品系基因分型
注意：为了区分 turquoise killifish 的不同品系，并确定每个品系内的性别，可使用特定的遗传标记（微卫星标记）9（表1）。
<ol>
	<li>取样
	<ol>
		<li>将鱼牢固地固定在湿润海绵上方的网中。</li>
		<li>使用棉签从鱼体鳃盖至尾鳍处擦拭 2 - 3 片鳞片。</li>
		<li>从棉签上取下鳞片，并将 2 - 3 片鳞片转移至含有 NaOH 溶液（200 µL 0.5 mol/L NaOH、1% β-巯基乙醇和 0.5% 聚乙烯吡咯烷酮）的 1 mL 离心管中。</li>
		<li>将 PCR 管短暂离心 15 秒，确保鳞片完全浸入 NaOH 溶液中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因组 DNA 提取
	<ol>
		<li>在 95 °C 下孵育样品 20 分钟。</li>
		<li>室温冷却，加入 1/10 体积的 1 M Tris-HCl（pH 8.0）中和样品。</li>
		<li>在最大转速下离心 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 水质参数
注意：若实验目的为成体表型分析，则其生物饲养需在整个目标物种生命周期内保持高度稳定的饲养条件。因此，饲养 turquoise killifish 等水生生物时，必须严格控制水质参数。采用带有额外四步水过滤系统的循环水系统，可有效稳定水质参数，确保所有养殖缸在长时间内维持一致的水质条件。建议使用反渗透（RO）水配制系统用水，并添加商用海水盐和碳酸氢钠进行重构。
<ol>
	<li>水循环系统示意图：首先，来自鱼缸的废水流经金属颗粒过滤器，捕获所有未食用的残饵和较大颗粒。金属过滤器每周冲洗三次；其次，经过初步机械过滤后，水被输送至大型集水井，然后泵送至生物过滤器，在生物过滤器中，细菌将氨转化为亚硝酸盐和硝酸盐；第三，水从生物过滤器泵送至25-µm滤筒，以截留更细小的颗粒。最后，水经过紫外线（UV）灯照射，杀灭水中的细菌和病毒。经过这四个步骤后，过滤后的水返回鱼缸。</li>
	<li>为减少鱼缸中微生物的生长、防止硝酸盐积累并降低整体盐度，每天排放系统总水量的10–20%。</li>
	<li>保持水温恒定在28 °C，水的pH值恒定在7.0至7.5范围内。</li>
	<li>尽管鳉鱼能耐受较宽范围的盐度，但为避免卵甲病（oodinosis），应将电导率维持在650–710微西门子范围内。全年保持12小时光照/12小时黑暗的光周期，以确保种群健康和繁殖能力。 
	注：鳉鱼可耐受高达1500微西门子的水电导率。</li>
</ol>

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<li>Harel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+rapid+exploration+of+aging+and+diseases+in+a+naturally+short-lived+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A platform for rapid exploration of aging and diseases in a naturally short-lived vertebrate.</a> Cell. 160 (5), 1013-1026 (2015).</li>
<li>Valenzano, D. R., Sharp, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-Mediated+Transgenesis+in+the+Short-Lived+African+Killifish+Nothobranchius+furzeri%2C+a+Vertebrate+Model+for+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Transposon-Mediated Transgenesis in the Short-Lived African Killifish Nothobranchius furzeri, a Vertebrate Model for Aging.</a> G3. 1 (7), Bethesda. 531-538 (2011).</li>
<li>Harel, I., Valenzano, D. R., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+approaches+for+the+short-lived+African+turquoise+killifish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering approaches for the short-lived African turquoise killifish.</a> Nat Protoc. 11 (10), 2010-2028 (2016).</li>
<li>Polacik, M., Blazek, R., Reichard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+breeding+of+the+short-lived+annual+killifish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laboratory breeding of the short-lived annual killifish Nothobranchius furzeri.</a> Nat Protoc. 11 (8), 1396-1413 (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在竞争性财务和非财务利益。

我们介绍了一种蓝鳉鱼的实验室培养方案，包括胚胎采集、孵化以及成年鱼的饲养、繁殖和喂养。本方案特别针对以成年鱼为主要研究对象的实验室，尤其是开展衰老和寿命相关实验研究的实验室。蓝鳉鱼可在标准的斑马鱼养殖设施中进行培育；然而，蓝鳉鱼的饲养管理在某些重要方面与标准的斑马鱼护理有所不同16。这些调整包括从仅喂食卤虫的食谱早期过渡到添加富含蛋白质的血虫的混合食谱，以及胚胎孵化过程中的特定步骤，即经历液体孵化和干燥孵化两个阶段。
实验方案中的关键步骤包括：运输胚胎时需保持在 8 - 30 °C 的温度范围内。在繁殖过程中，繁殖力取决于投喂频率和食物质量，因此我们建议每个繁殖缸每天至少投喂两次，以提高胚胎产量（参见第 5.6 节）。进行胚胎漂白时，切勿延长胚胎在漂白液中的孵育时间，否则可能导致卵壳受损并增加胚胎死亡率。使用亚甲蓝孵育胚胎时，即将孵化的胚胎孵育时间不应超过 2 周，否则其活力将显著下降。孵化青鳉鱼时，较低温度的腐殖酸溶液有助于提高孵化率，且将胚胎完全浸没于溶液中可实现同步孵化。孵育期间若通气不足，会导致大量仔鱼无法充气鳔（&#34;腹滑型&#34;表型，参见第 5.1 节注释）。
该繁殖方案的局限性包括使用了沙质基质，这会对集中过滤系统造成挑战，未来应采用其他替代方法。可能的替代方案包括使用斑马鱼繁殖缸。胚胎漂白可能导致卵壳发生显著的理化改变，从而影响卵壳生理功能及孵化成功率。胚胎持续暴露于亚甲蓝可能诱导成鱼生理上的长期变化。为存活队列研究而将成鱼饲养于单独水族箱中，可能对鱼类行为和健康产生负面影响。然而，在存活队列研究中采用群体饲养会因社会等级的建立以及雄性领地行为而引入显著的混杂因素，导致严格的等级支配关系。因此，我们认为在存活研究中将雄鱼隔离饲养是一种合理的折中方案。使用来源未经控制的活体食物喂养实验室中的鳉鱼种群，会带来寄生虫以及潜在致病微生物群落等外来污染的风险。未来应开发一种专门的无菌鱼类饲料。
未来对该方案的改进将集中于使用可控的非活体饲料，仍可在3至4周内完成性成熟。总之，本方案为广泛的科学界提供了便捷的蓝鳉实验室培养途径。

由于其寿命较短且生命周期迅速，青鳉鱼正迅速成为生物学中一个极具前景的新型模式生物1,2,3。该物种具有独特的硬骨鱼类生命周期，包括胚胎滞育、快速性成熟以及延长的生殖后生命阶段4,5。近年来的研究进展加深了我们对青鳉鱼在人工饲养及自然环境中生物学特性的理解6,7。青鳉鱼栖息于季节性淡水水体中，这些水体在津巴布韦和莫桑比克的非洲稀树草原雨季期间形成。在旱季，其胚胎以一种称为滞育的抗逆境生命阶段存活于干燥的泥土中，无需水环境&#160;&#160;。
该物种的遗传图谱已经绘制完成8,9，且最近其基因组已被测序并完成组装10,11已培育出多种近交系实验鱼类品系，且该物种中已可应用转基因技术和基于CRISPR/Cas9的基因组编辑。 事实上的 推广 turquoise killifish 作为一种具有竞争力的实验室脊椎动物模型生物12,13,14.
尽管该物种的实验室方案已有文献发表15，但本方案旨在建立一套完整的实验操作指南，专门用于衰老与生存研究。本方案使已熟悉斑马鱼和青鳉鱼养殖的研究人员只需进行少量关键调整，即可掌握蓝鳉鱼的养殖技术。同时，本方案也为无鱼类养殖经验的研究人员&#160;提供了建立健康蓝鳉鱼种群所需的基本技术工具。

<table><tbody><tr><td>pH=7.0 的探针校准缓冲液</td><td>Roth</td><td>A518.1</td><td>1L pH=7.0 缓冲液，用于校准水系统 pH 电极</td></tr><tr><td>pH=4.0 的探针校准缓冲液</td><td>Roth</td><td>P712.1</td><td>1L pH=4.0 缓冲液，用于校准水系统 pH 电极</td></tr><tr><td>电导率标准品</td><td>VWR</td><td>83607.260</td><td>500 mL 电导率标准品，1,413 µS/cm，用于校准水系统电导电极</td></tr><tr><td>Easy Strips 6 合一测试条</td><td>JBL</td><td>2533900</td><td>用于测定系统水中余氯含量的试纸条</td></tr><tr><td>氨测试剂</td><td>JBL</td><td>2536500</td><td>用于测定系统水中氨含量的测试剂</td></tr><tr><td>Red Sea 盐</td><td>Red Sea</td><td></td><td>22 kg 桶装</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>VWR</td><td>27780.360</td><td></td></tr><tr><td>腐殖酸</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>53680-50G</td><td></td></tr><tr><td>新型 HUFA 卤虫强化剂</td><td>ZM Systems UK</td><td></td><td>75g 瓶装</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Roth</td><td>AE64.1</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>31642-1L</td><td>30% (w/w)</td></tr><tr><td>椰糠纤维</td><td>Dragon</td><td>ZCS010</td><td></td></tr><tr><td>沃特曼滤纸</td><td>GE healthcare</td><td>3030-690</td><td></td></tr><tr><td>纯乙醇</td><td>VWR</td><td>20821.467</td><td>100%</td></tr><tr><td>石英砂</td><td>本地宠物店</td><td></td><td></td></tr><tr><td>优质级卤虫卵</td><td>Sanders</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血虫</td><td>本地经销商</td><td></td><td>Poseidon Aquakultur 德国</td></tr><tr><td>dNTP 溶液混合物</td><td>Biolabs</td><td>N04472</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>5 U/µL</td></tr><tr><td>PCR 10× 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>50 mM</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S8045-500g</td><td>50 mM</td></tr><tr><td>Tris-HCl 溶液，pH=8.0</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T2694-1L</td><td>1 M</td></tr><tr><td>37% 盐酸</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>鱼缸</td><td>Aquaneering</td><td></td><td>容积：0.8 L、2.8 L、9.5 L；配备挡板、幼鱼滤网和盖子</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>VWR</td><td>89032-100</td><td>型号 5000</td></tr><tr><td>微生物培养箱</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>50125882</td><td>型号 IMC18；用于液相保存胚胎，设定温度 t=27–28&amp;deg;C</td></tr><tr><td>制冷培养箱</td><td>Binder</td><td>9020-0209</td><td>型号 KT115；用于固相保存胚胎，设定温度 t=27–28&amp;deg;C</td></tr><tr><td>孵化培养箱</td><td>Thermo Scientific, Heratherm</td><td>51028114</td><td>型号 OGS180；用于胚胎孵化，设定温度 t=27–28&amp;deg;C</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>型号 M80</td></tr><tr><td>繁殖砂/孵化盒</td><td>Roth</td><td>1598.1</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473</td><td>92×16 mm</td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>一次性塑料巴斯德吸管</td><td>Roth</td><td>EA71.1</td><td>2 mL；用于投喂血虫，或选择胚胎时剪去吸管尖端，开口直径为 3–4 mm</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1689.001</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4100-000V0</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>金属筛网</td><td></td><td></td><td>孔径 &amp;lt;1 mm；用于收集胚胎</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>0508-5/45-PO</td><td>型号 5/45；用于转移胚胎</td></tr><tr><td>25 L 卤虫孵化器</td><td>Aquaneering</td><td>ZHBS25</td><td>主用孵化器</td></tr><tr><td>500 mL 卤虫孵化器</td><td>JBL</td><td>6106100</td><td>型号 Artemio 1；备用孵化器</td></tr><tr><td>细网鱼网</td><td>JBL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>砂杯</td><td>VWR</td><td>BURK7102-5000</td><td>5000 mL</td></tr><tr><td>卤虫分离杯</td><td>VWR</td><td>BURK7102-2000</td><td>2000 mL</td></tr><tr><td>塑料自封袋</td><td>Roth</td><td>P279.2</td><td>用于存放死亡鱼类</td></tr><tr><td>移液器助吸器</td><td>Integra</td><td>155000</td><td>型号 Pipetboy acu2</td></tr><tr><td>封口膜</td><td>P-Lab</td><td>P701605</td><td></td></tr><tr><td>通气管</td><td>www.zajac.de</td><td>AQ380</td><td>直径 4–6 mm</td></tr><tr><td>1 L 玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td></td></tr><tr><td>2 L 玻璃瓶</td><td>VWR</td><td>215-1596</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 挤压瓶</td><td>Roth</td><td>K665.1</td><td>用于投喂卤虫</td></tr><tr><td>120-&amp;#956;m 卤虫筛网</td><td>Florida Aqua Farms</td><td>BB-PC2</td><td>用于收集卤虫/血虫</td></tr><tr><td>末端过滤袜</td><td>Aquaneering</td><td>MFVB025C</td><td>25-&amp;#956;m</td></tr><tr><td>中央过滤鱼类饲养系统</td><td></td><td></td><td>Aquaneering、Techniplast、Aquatic Habitats、Aqua Schwarz</td></tr></tbody></table>

一种蓝鳉（nothobranchius furzeri）实验室饲养方案

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

实验用非模式实验室鱼类的养殖技术发展极大地受益于斑马鱼和青鳉等参考鱼类模型系统的建立。近年来，一种新兴的鱼类—— turquoise killifish（Nothobranchius furzeri）——因其独特的生物学特性而受到关注。Nothobranchius furzeri）已被越来越多从事衰老生物学和生态学研究的科研团队所采用。该物种在人工饲养条件下的寿命为4至8个月，是目前已知最短命的脊椎动物，使科学界能够在较短时间内测试各种实验性干预措施对衰老速率和预期寿命的影响。鉴于该物种具有独特的生物学特征，包括胚胎滞育、性成熟爆发式发展、显著的形态与行为上的性二型性，以及相对较短的成年寿命，&#160;特设的 集约化养殖实践亟待发展。本方案介绍了一套关键的养殖措施，可实现 turquoise killifish 在实验室条件下的最佳饲养，从而推动科研界将该物种作为强有力的实验动物模型加以应用。

turquoise鳉鱼的适当饲养条件下，GRZ品系的中位生存期通常在12至18周之间（例如图4A）。中位生存期的差异取决于饮食、喂食频率和饲养温度条件。饲养不当会导致生存曲线出现早期死亡率升高，并在时间进程中反复出现突然的生存率下降，表现为多个拐点（图4B）。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig1.jpg" /> 
图1：不同孵化基质下的代表性胚胎发育阶段。（A） 新采集的胚胎，置于孵育箱中28 °C的亚甲蓝溶液内孵育。（B） 准备转移至固体培养基（滤纸或椰壳纤维）的胚胎。（C） 即将孵化的胚胎，表现出典型的金黄色虹膜。比例尺等于1 mm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig2.jpg" /> 
图2：青鳉鱼孵化后发育的各个阶段。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig3.jpg" /> 
图3：适用于第3阶段及以后阶段鱼类的代表性鱼类ID标签。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57073/57073fig4.jpg" /> 
图4：70条雄性青鳉鱼的代表性生存曲线。（A） 实验室饲养的青鳉鱼典型的生存曲线。（B） 在理想饲养条件（黑色）与不良饲养条件（红色和蓝色）下获得的生存曲线比较。虚线红横线表示50%存活率，与生存曲线的交点对应中位寿命（在x轴上标示）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57073/57073fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ID</td>
			<td colspan="2">正向引物</td>
			<td colspan="2">反向引物</td>
			<td>片段大小范围 (bp)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*NfuSU0007</td>
			<td colspan="2">GGCTAAGCCTTGCTGACAGA</td>
			<td colspan="2">CAGGGAGCTGAAAACCTCAG</td>
			<td>166 - 214</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*NfuSU0010</td>
			<td colspan="2">CGCAGTCTGATCAAATCGTGT</td>
			<td colspan="2">TGTTTGAAGGTTCACATTCATTATC</td>
			<td>220 - 272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0016</td>
			<td colspan="2">CATGGCTAAACCGTGATGAA</td>
			<td colspan="2">GAAGGACGCCAGCTATGAAG</td>
			<td>209 - 240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0022</td>
			<td colspan="2">AACACAGCTCTCGTAAGGAGGTA</td>
			<td colspan="2">TTCAGACTTGTCTTACTACCATGTTT</td>
			<td>198 - 238</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0027</td>
			<td colspan="2">TCCAGCTGAATCGGTAATGA</td>
			<td colspan="2">AAACTCGAGGGTGCAATCTG</td>
			<td>164 - 226</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0049</td>
			<td colspan="2">CTGGACAAAGTGCCAATCAC</td>
			<td colspan="2">CTCCCACAGTCCCAAAACAT</td>
			<td>196 - 197</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0050</td>
			<td colspan="2">CCAGAATGAACAATACTCAGATCAA</td>
			<td colspan="2">GCAGCTTAGTTTAATGATATCACAATG</td>
			<td>252 - 295</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuSU0060</td>
			<td colspan="2">CTAGCCACTCCCCTGGTTTA</td>
			<td colspan="2">CCGTCACGATGTGCTGATAC</td>
			<td>216 - 248</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NfuFLI0030</td>
			<td colspan="2">CAGAAGCTAAAGGCCAGACG</td>
			<td colspan="2">GGGAAACAATAGGGAACCAC</td>
			<td>174 - 205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*NfuFLI0091</td>
			<td colspan="2">ACGCTGACTCTACCCAGTC</td>
			<td colspan="2">CTGCCTGCTACTGACAATG</td>
			<td>355 - 373</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="6">*- 性别鉴定标记</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：菌株鉴定的基因分型引物。

蓝鳉的实验室饲养可进行规模化扩展&#160;，利用与标准斑马鱼饲养设施相同的基础设施，在集中式水过滤系统中高效地饲养数千尾个体。本文详细列出了一套标准化操作流程，以实现蓝鳉的高效维护。

一种蓝鳉（Nothobranchius furzeri）实验室饲养方案

实验用非模式实验室鱼类养殖技术的发展，得益于……的建立而取得了巨大进步

本实验方案的总体目标是成功建立蓝鳉鱼的实验室种群，以快速、高通量的方式研究衰老及与年龄相关的疾病。该方法有助于回答衰老研究领域中的关键问题，例如单个基因突变或环境干预是否能够调节脊椎动物物种的衰老过程。该技术的主要优势在于，通过遵循我们的基本操作规程，多个实验室现在均可开展基于蓝鳉鱼的实验研究。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到一些困难，因为鳉鱼的饲养具有一些独特的特点。例如，胚胎在孵化前需在干燥基质上培养，这与斑马鱼等经典鱼类模型有显著差异。开始时，准备若干个9.5升的繁殖缸，每缸放入一条五周龄的雄鱼和两条六至七周龄的雌鱼。然后，用高压灭菌的沙子填充一个塑料容器，深度约为两到三厘米，并将沙盒置于繁殖缸的中央。让 turquoise killifish 持续繁殖，并每周收集一次胚胎用于胚胎孵化。为了获取可用于显微注射及转基因品系建立的单细胞期胚胎，按上述方法设置一个繁殖缸，其中放入一条雄鱼和两条雌鱼。在收集胚胎前两天，将雄鱼转移至单独的鱼缸中，并使其与成年雌鱼保持视觉接触。收集当天，将雄鱼和产卵沙盒放入繁殖缸中，让鱼类产卵两小时。产卵结束后，将沙盒从鱼缸中取出，倒入筛网中，并用系统水冲洗沙盒。然后将滤网部分浸入系统水中，轻轻旋转，使胚胎聚集在中央。使用一支2毫升的巴斯德移液管收集胚胎，并将其转移至含有约40毫升系统水的90毫米培养皿中。在光学显微镜下检查培养皿中的胚胎，移除具有破裂的卵膜及损伤迹象的胚胎。根据文本方案漂白胚胎后，检查并移除任何被染成蓝色的死亡胚胎。待胚胎在新鲜的亚甲蓝溶液中孵育后，检查已发育的胚胎是否具有可见的黑色眼睛。然后使用一次性巴斯德吸管或精细弯头镊子，将胚胎转移至滤纸板上。将未发育的胚胎保留在亚甲蓝中，并每天进行观察。一旦胚胎发育出黑色眼睛，即转移到固体基质培养基中。用镊子将胚胎分散开，每90毫米培养皿中最多放置100个胚胎，胚胎之间间距约为5毫米。然后用石蜡密封培养皿，并将胚胎在28摄氏度下孵育两到三周，直至其虹膜完全发育呈金黄色，达到孵化阶段。若需长期保存长达一年，可在亚甲蓝溶液中孵育三天后，将胚胎转移至固体基质培养基平板上（方法如前所述），并在17摄氏度下继续孵育。孵化鱼类时，使用精细的弯头镊子小心地将50至100个发育完全的胚胎转移至孵化盒中，完全浸入浓度不超过两厘米深的腐殖酸溶液中，并在4摄氏度下进行孵化。该方案中的一个关键步骤是孵化鳉鱼胚胎，具体方法是将已在干燥基质中孵育的胚胎转移至含有腐殖酸的孵化液中，并提供充足的通气。用盖子盖住孵化盒，并将其置于28摄氏度的孵化培养箱中孵育。为保证充足的通气，需通过软管将孵化盒连接至供气装置。为保持孵化盒内充足的水质，从孵化后第二天开始，每天补充一次经高压灭菌的系统水，补充比例为1:1，最终水深维持在2厘米。将未孵化的胚胎转移回固体基质中，并于一周后再次尝试孵化。在孵化后第五天开始饲养幼鱼和成鱼时，使用一次性塑料移液管或塑料勺小心地将幼鱼转移至循环水系统中，每0.8升水体的养殖缸中放入5尾幼鱼，并配备孔径为400微米的幼鱼筛网。在14日龄时，将幼鱼转移至装有850微米幼鱼筛网的2.8升水族箱中。此后，需在每个水族箱上标注鱼类编号。进行存活率检测时，每条鱼应单独饲养于一个水族箱中。用于存活率检测的鱼类也需单独饲养在2.8升的水族箱中。在接下来的七天内，每天喂食幼鱼两次，每次给予五毫升卤虫，并补充一至三条活体血虫。在四周龄时，每天喂食每条鱼两次，食物包括卤虫和一毫升血虫。在此阶段，通过检查雄鱼是否具有较大的背鳍、肛鳍和尾鳍并出现体色着色迹象，以及雌鱼是否具有充满卵子的圆润腹部，来确保鱼类达到完全性成熟。图中展示的是 70 条雄性青鳉鱼的代表性生存曲线。在 GRZ 品系中，适当的饲养管理可使中位生存期达到 12 至 28 周。中位生存期的差异取决于饮食、喂食频率和饲养温度条件。在较差养殖条件下饲养的鱼类的生存曲线显示，与最佳养殖条件下的鱼类相比，其早期死亡率增加，并且在整个时间段内生存率反复出现突然下降。在遵循本方案时，密切监测水质以及初孵仔鱼的残余食物至关重要，因为必须确保这些鱼类处于清洁的环境中。该技术建立后，为研究人员探索青鳉鱼的实验操作铺平了道路，包括转基因、基因组编辑以及饮食干预等操作。观看本视频后，您应能充分了解如何在实验室中成功培育 turquoise killifish，并利用这一模型研究可在人工饲养条件下存活的最短寿脊椎动物的衰老生物学。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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一种蓝鳉（Nothobranchius furzeri）实验室饲养方案

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