Name: 一种简便、有效的心肌注射小鼠心脏特异基因操作方法--体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习通过心肌内腺病毒注射实现成年小鼠心脏特异性基因操作的方法。该技术无需通气、恢复迅速且可重复，为心血管疾病基因治疗研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作得到国家杰出青年科学基金（81625002）、国家自然科学基金（81470389、81270282、81601238）、上海市学术带头人计划（18XD1402400）、上海市教委高峰临床医学 grant 支持（20152209）、上海申康医院发展中心（16CR3034A）、上海交通大学（YG2013MS42）、上海交通大学医学院（15ZH1003 和 14XJ10019）、上海市扬帆计划（18YF1413000）以及蚌埠医学院研究生创新计划（Byycx1722）的资助。我们感谢高厄和博士（Dr. Erhe Gao）此前在本实验室提供的帮助。

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》进行，并经研究所动物伦理委员会批准。所有实验均使用雄性C57BL/6J小鼠（8至10周龄）。小鼠饲养于无病原体环境中，温度为24 °C ± 4 °C，光照/黑暗周期为12小时，可自由获取水和食物。
1. 腺病毒溶液的制备
<ol>
	<li>纯化的腺病毒溶液到达后，将其储存于 -80 °C 冰箱中。 
	注意：腺病毒注射在活体小鼠中进行。为确保腺病毒载体的无菌性，腺病毒（编码荧光素酶、VDR 或靶向 VDR 的 shRNA）由商业途径制备并纯化9,10。</li>
	<li>手术当天，从 -80 °C 冰箱中取出纯化的腺病毒溶液（3 x&#160;1010 空斑形成单位 [pfu]/mL），并在冰上解冻腺病毒载体溶液。</li>
	<li>佩戴口罩、无菌手套和无菌手术服。</li>
	<li>准备一支已在手术前一天灭菌的 50-µL Hamilton 注射器。 
	注意：灭菌时，将 Hamilton 注射器用纱布包裹后放入高温高压灭菌器中，选择&#34;固体灭菌&#34;模式，按下&#34;启动&#34;按钮开始灭菌。</li>
	<li>腺病毒溶液完全解冻后，用 75% 乙醇喷洒含有腺病毒溶液的管子，并将腺病毒溶液转移至超净台中。</li>
	<li>在超净台内，使用不带针头的 Hamilton 注射器吸取 50 µL 腺病毒溶液，然后将 30 G 针头连接至 Hamilton 注射器上。</li>
	<li>手持带有 30 G 针头的注射器，针头朝上，轻轻推动注射器推杆，直至腺病毒溶液充满针头（以针尖出现第一滴液体为准）。 
	注意：填充 30 G 针头约需 45 µL 溶液，因此此时注射器内几乎看不到剩余液体。</li>
	<li>使用上述准备好的注射器小心吸取另外 30 µL 腺病毒溶液，并将针帽松松盖上的注射器置于冰上备用。</li>
</ol>
2. 麻醉与手术准备
<ol>
	<li>向异氟烷挥发罐中加入 20 mL 异氟烷，并将异氟烷挥发罐连接至氧气瓶。</li>
	<li>打开阀门，使氧气从氧气瓶流入异氟烷挥发罐。通过异氟烷挥发罐中的氧气流量监测装置，将氧气流速维持在 2 L/min。</li>
	<li>在连接至异氟烷挥发罐的塑料箱内，以 100% 氧气（流速 2 L/min）为载体，使用 4% 异氟烷诱导小鼠麻醉，持续 2 分钟。</li>
	<li>将已麻醉的小鼠从塑料箱中取出，俯卧位固定于层流无菌操作台内的塑料平台上，并通过鼻罩以 100% 氧气（流速 2 L/min）中含 2% 异氟烷维持麻醉状态。</li>
	<li>通过夹捏足趾无反应确认麻醉深度充分。</li>
	<li>在每只眼睛上涂抹无菌眼用软膏，以防止角膜干燥。</li>
	<li>剃除胸部和上腹部的毛发。在剃毛区域涂抹市售脱毛膏 1 分钟。用湿纱布擦去脱毛膏及残留毛发。</li>
	<li>使用碘-氯己定类消毒剂（如安替福民）对术区（胸部左下部）进行三次消毒涂擦。用无菌洞巾覆盖手术区域。</li>
</ol>
3. 小鼠心脏内腺病毒注射
<ol>
	<li>脱掉手套，换上一副新的无菌手套。</li>
	<li>在手术前一天，将镊子、微型蚊式止血钳、手术剪和持针器放入高温高压灭菌器中进行灭菌（参见步骤1.4的注释）。</li>
	<li>沿剑突与腋窝连线做一道0.5 cm的皮肤切口。使用镊子和微型蚊式止血钳钝性分离胸大肌和胸小肌。</li>
	<li>牵开胸大肌和胸小肌以暴露肋间隙。用微型蚊式止血钳穿刺并打开第四肋间隙（或根据观察选择最宽的肋间隙）。</li>
	<li>用非优势手的食指轻轻按压胸壁右侧，将心脏推向切口，使心脏外翻。</li>
	<li>用非优势手的食指和拇指轻柔固定外翻的心脏。</li>
	<li>用优势手持装有腺病毒的Hamilton注射器，在左心室心肌的三个部位（左心室前壁、背侧壁和侧壁）分别注射腺病毒溶液，共注射30 µL（图1C）。</li>
	<li>注射完成后，立即将心脏复位至胸腔内。</li>
	<li>通过轻轻按压胸壁向皮肤切口方向手动排出胸腔内的空气。 
	注：成功排气的表现为被排出气体引起的胸大肌和胸小肌扑动现象。</li>
	<li>使用5-0丝线行水平褥式缝合关闭皮肤。 
	注：不应缝合胸大肌和胸小肌，因为这些肌肉仅进行了钝性分离，其解剖结构在整个手术过程中保持完整。</li>
</ol>
4. 术后管理
<ol>
	<li>术后最初48小时内，通过皮下注射给予布托啡诺（3 mg/kg），每日两次，以减轻术后疼痛11。</li>
	<li>手术后立即将小鼠置于加热垫（37 °C）上保温，直至其完全恢复意识。待小鼠完全苏醒后，将其放回笼中。</li>
	<li>使用高温高压灭菌器对已使用的汉密尔顿注射器和30 G针头进行灭菌处理（参见步骤1.4的注释）。将灭菌后的30 G针头收集至锐器盒中。</li>
</ol>
5. 体内 用于测量心脏荧光素酶表达的成像技术
<ol>
	<li>在腺病毒注射后第5天，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制浓度为15 mg/mL的新鲜荧光素工作液。经0.2 µm滤膜过滤。</li>
	<li>向清醒的小鼠腹腔内注射荧光素溶液，剂量为每公斤体重150 mg。</li>
	<li>打开成像系统。</li>
	<li>成像系统自动自检后，选择成像模式为 &#34;发光，“，并进行以下设置：曝光：自动；像素合并：8；光圈：1；激发光：阻断；发射光：开放。</li>
	<li>在注射荧光素后10分钟，通过注射水合氯醛（300 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果充分。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠俯卧位固定在加热的成像台上，胸部朝向相机。</li>
	<li>采集图像（每只小鼠采集1张图像），并通过在胸部周围绘制相同大小的圆形感兴趣区域（ROI）来量化信号强度。</li>
	<li>成像完成后，处死小鼠，并按照下节所述方法收集组织。</li>
</ol>
6. 组织收获
<ol>
	<li>在病毒注射后的不同时间点（图1B），使用4%异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过鼻罩以2%异氟烷维持麻醉状态，将小鼠俯卧位固定于塑料平台上。</li>
	<li>于颈部前侧做腹侧正中切口，牵开肩胛舌骨肌和胸锁乳突肌，暴露右侧颈总动脉。</li>
	<li>通过横断右侧颈总动脉放血，处死小鼠。</li>
	<li>于腹部做腹侧正中切口，沿锁骨中线从两侧剪开肋骨，并横断膈肌。</li>
	<li>抬起剑突暴露心脏，找到升主动脉，并轻轻去除血管周围脂肪组织。</li>
	<li>将连接1 mL注射器（内含0.5 mL、4 °C的磷酸盐缓冲液，PBS）的30 G针头插入主动脉，逆行灌注心脏。</li>
	<li>灌注完成后，取出心脏，并将其分为左心室和右心室；同时取出肝脏、肺和脾脏。</li>
	<li>所有采集的组织经冷PBS（4 °C）洗涤两次后，分别置于冻存管中，并立即存入液氮中保存。</li>
</ol>
7. 蛋白质表达的测定
<ol>
	<li>按1:100的比例将蛋白酶抑制剂混合物加入市售裂解缓冲液中，配制匀浆缓冲液。根据待处理样本的数量计算所需总体积。将配制好的匀浆缓冲液置于4 °C保存，以备后续使用。</li>
	<li>从液氮罐中取出组织，在高精度天平上称重（每份组织约60 mg）。</li>
	<li>将组织转移至新的1.5 mL微量离心管中，立即加入200 µL匀浆缓冲液和预冷（4 °C）的1.5 mm钢珠。</li>
	<li>将微量离心管固定在预冷（4 °C）的金属夹具中，放入自动组织研磨仪，启动仪器进行匀浆，设置参数如下：频率：70 Hz；时间：120 s。</li>
	<li>匀浆完成后，将匀浆液在16,000 × g、4 °C条件下离心，用100 µL移液器小心将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>按1:4的比例向上清液中的蛋白质中加入上样缓冲液（5x）&#160;，于100 °C变性5 min。</li>
	<li>按照先前描述的方案12，通过Western blot分析进一步检测心脏及其他器官组织中的蛋白质表达水平（代表性结果见图2C和图3）。</li>
</ol>

<ol><li>Yancy, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2017+ACC%2FAHA%2FHFSA+Focused+Update+of+the+2013+ACCF%2FAHA+Guideline+for+the+Management+of+Heart+Failure%3A+A+Report+of+the+American+College+of+Cardiology%2FAmerican+Heart+Association+Task+Force+on+Clinical+Practice+Guidelines+and+the+Heart+Failure+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22J+Card+Fail%22%5BJournal%5D)">2017 ACC/AHA/HFSA Focused Update of the 2013 ACCF/AHA Guideline for the Management of Heart Failure: A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Clinical Practice Guidelines and the Heart Failure Society of America.</a> J Card Fail. 23 (8), 628-651 (2017).</li>
<li>Pu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte-expressed+farnesoid-X-receptor+is+a+novel+apoptosis+mediator+and+contributes+to+myocardial+ischaemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte-expressed farnesoid-X-receptor is a novel apoptosis mediator and contributes to myocardial ischaemia/reperfusion injury.</a> Eur Heart J. 34 (24), 1834-1845 (2013).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+melatonin+receptor+ROR%CE%B1+is+a+novel+endogenous+defender+against+myocardial+ischemia_reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">The nuclear melatonin receptor RORα is a novel endogenous defender against myocardial ischemia_reperfusion injury.</a> J Pineal Res. (3), 313-326 (2016).</li>
<li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+receptor+activation+protects+against+myocardial+reperfusion+injury+through+inhibition+of+apoptosis+and+modulation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Vitamin D receptor activation protects against myocardial reperfusion injury through inhibition of apoptosis and modulation of autophagy.</a> Antioxid Redox Signal. 22 (8), 633-650 (2015).</li>
<li>He, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+liver-X-receptor+alpha+but+not+liver-X-receptor+beta+protects+against+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Activation of liver-X-receptor alpha but not liver-X-receptor beta protects against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> Circ Heart Fail. 7 (6), 1032-1041 (2014).</li>
<li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rAAV9+to+Overexpress+or+Knockdown+Genes+in+Mouse+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Bish, L. T., Sweeney, H. L., Muller, O. J., Bekeredjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+vector+delivery+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus vector delivery to the heart.</a> Methods Mol Biol. 807, 219-237 (2011).</li>
<li>Michael, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+gene+delivery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac gene delivery with cardiopulmonary bypass.</a> Circulation. 104 (2), 131-133 (2001).</li>
<li>Lei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Hepatic+Fatty+Acids+Uptake+and+Oxidation+by+LRPPRC-Driven+Oxidative+Phosphorylation+Reduces+Blood+Lipid+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased Hepatic Fatty Acids Uptake and Oxidation by LRPPRC-Driven Oxidative Phosphorylation Reduces Blood Lipid Levels.</a> Front Physiol. 7, 270(2016).</li>
<li>Zhang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+the+contractile+phenotype+in+corpus+cavernosum+smooth+muscle+cells+by+Myocardin+gene+therapy+ameliorates+erectile+dysfunction+in+bilateral+cavernous+nerve+injury+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of the contractile phenotype in corpus cavernosum smooth muscle cells by Myocardin gene therapy ameliorates erectile dysfunction in bilateral cavernous nerve injury rats.</a> Andrology. 5 (4), 798-806 (2017).</li>
<li>Virag, J. A., Lust, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+artery+ligation+and+intramyocardial+injection+in+a+murine+model+of+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22N+Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Gao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+efficient+model+of+coronary+artery+ligation+and+myocardial+infarction+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">A novel and efficient model of coronary artery ligation and myocardial infarction in the mouse.</a> Circ Res. 107 (12), 1445-1453 (2010).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+protective+role+of+nuclear+melatonin+receptor+ROR%CE%B1+in+diabetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Novel protective role of nuclear melatonin receptor RORα in diabetic cardiomyopathy.</a> J Pineal Res. 62 (3), (2017).</li>
<li>Nduhirabandi, F., Lamont, K., Albertyn, Z., Opie, L. H., Lecour, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+toll-like+receptor+4+in+melatonin-induced+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Role of toll-like receptor 4 in melatonin-induced cardioprotection.</a> J Pineal Res. 60 (1), 39-47 (2016).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNK-TLR9+signal+pathway+mediates+allergic+airway+inflammation+through+suppressing+melatonin+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">JNK-TLR9 signal pathway mediates allergic airway inflammation through suppressing melatonin biosynthesis.</a> J Pineal Res. 60 (4), 415-423 (2016).</li>
<li>de Luxan-Delgado, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+reduces+endoplasmic+reticulum+stress+and+autophagy+in+liver+of+leptin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin reduces endoplasmic reticulum stress and autophagy in liver of leptin-deficient mice.</a> J Pineal Res. (1), 108-123 (2016).</li>
<li>Scofield, S. L., Singh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Myocardial+Ischemia+and+Reperfusion+Injury+in+Mice+Using+Surface+Pad+Electrocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Myocardial Ischemia and Reperfusion Injury in Mice Using Surface Pad Electrocardiography.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Cai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+H19+mediates+melatonin+inhibition+of+premature+senescence+of+c-kit%28%2B%29+cardiac+progenitor+cells+by+promoting+miR-675%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA H19 mediates melatonin inhibition of premature senescence of c-kit(+) cardiac progenitor cells by promoting miR-675.</a> J Pineal Res. 61 (1), (2016).</li>
<li>Chua, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardioprotective+effect+of+melatonin+and+exendin-4+treatment+in+a+rat+model+of+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">The cardioprotective effect of melatonin and exendin-4 treatment in a rat model of cardiorenal syndrome.</a> J Pineal Res. 61 (4), 438-456 (2016).</li>
<li>Pei, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+attenuates+postmyocardial+infarction+injury+via+increasing+Tom70+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin attenuates postmyocardial infarction injury via increasing Tom70 expression.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+receptor-dependent+Notch1_Hes1+activation+by+melatonin+protects+against+myocardial+ischemia-reperfusion+injury_+in+vivo+and+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane receptor-dependent Notch1_Hes1 activation by melatonin protects against myocardial ischemia-reperfusion injury_ in vivo and in vitro studies.</a> J Pineal Res. 59 (4), 420-433 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melatonin+rescues+cardiac+thioredoxin+system+during+ischemia-reperfusion+injury+in+acute+hyperglycemic+state+by+restoring+Notch1%2FHes1%2FAkt+signaling+in+a+membrane+receptor-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pineal+Res%22%5BJournal%5D)">Melatonin rescues cardiac thioredoxin system during ischemia-reperfusion injury in acute hyperglycemic state by restoring Notch1/Hes1/Akt signaling in a membrane receptor-dependent manner.</a> J Pineal Res. 62 (1), (2017).</li>
<li>Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramyocardial+cell+delivery%3A+observations+in+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts.</a> J Vis Exp. (83), e851064(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告介绍了一种改良的心肌内注射病毒载体用于心脏基因操作的技术，该技术是在Gao et al.13报道的诱导心肌梗死方法基础上改进而来。目前，对特定基因功能的体内研究通常依赖于构建基因敲除或转基因小鼠3,14,15,16,17，但此类方法成本高、耗时长且劳动强度大。作为替代方案，通过全身性或局部注射递送基因载体或siRNA也已在心血管研究中广泛应用4,5,7。尤其在某些情况下，心肌内注射在心脏基因操作中具有不可替代性：例如需要靶向特定部位注射时（<...

心脏疾病是全球范围内发病率和死亡率的首要原因1,2。对于心肌梗死和心力衰竭等危及生命的心脏疾病，由于缺乏有效的治疗策略，人们正深入探索其潜在的病理机制，并致力于寻找新的治疗方法3。在这些科学研究中，心脏特异性基因操作被广泛应用4,5。心脏基因操作可通过基因组编辑技术实现，例如利用高效的转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）以及规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR 相关蛋白9（Cas9）工具；也可通过递送外源性遗传物质（例如，携带目的蛋白编码基因的病毒载体）来完成6。尽管基因组编辑能够在活体小鼠中实现精确且具有时空特异性的基因组修饰，但该方法仍然耗时较长且劳动强度大6。作为替代方案，通过病毒载体或小干扰RNA（siRNA）复合物递送实现心脏特异性基因操作的方法已被常规采用6。
将病毒载体递送至成年小鼠心脏主要有两种策略：全身注射或局部注射。全身注射嗜心肌型腺相关病毒（如AAV9）可非侵入性地实现心脏特异性基因操作7。然而，该方法需要相对较高剂量的载体才能实现有效的转导和基因表达，并可能导致骨骼肌和肝脏等非靶器官发生显著的转导7。局部病毒注射可通过心肌内注射或冠状动脉内递送实现7。与心肌内注射相比，冠状动脉内递送可在心脏内实现更均匀的病毒分布。但该技术的缺点是病毒载体迅速被冲刷进入体循环，导致非靶器官发生转导8，且操作过程中需要压力测量设备。相比之下，心肌内注射可实现心肌组织中更好的病毒滞留以及特定部位的递送，但无法使病毒载体均匀分布7。对于小型动物而言，冠状动脉内递送在技术上较难实施，而全身AAV9注射和心肌内注射则更为常用4,5,7。尽管全身注射操作简便，但传统的心肌内注射需要机械通气和开胸手术，会造成广泛的组织损伤，且耗时较长。
本报告中，我们介绍了一种简便、省时且高效的经心肌注射方法。通过注射编码荧光素酶和维生素D受体（VDR）的腺病毒，或靶向VDR的shRNA，实现对心脏基因表达的调控。一旦掌握该技术，即可用于小鼠心脏的基因操作，以及细胞或其他物质的注射。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>层流无菌罩</td><td>丰实动物实验&amp;nbsp; 设备技术有限公司（中国苏州）</td><td>FS-CJ-2F</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆）</td><td>75005282</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨机</td><td>中国宁波 Scientz 生物技术有限公司</td><td>Scientz-48</td><td></td></tr><tr><td>高温高压灭菌器</td><td>日本埼玉县平山</td><td>HVE-50</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器&amp;nbsp;</td><td>Matrix（Orchard Park，美国）</td><td>VIP3000</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&amp;nbsp; Lumina III 成像系统</td><td>PerkinElmer（美国沃尔瑟姆）</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>精确度&amp;nbsp;天平</td><td>赛多利斯（G&amp;ouml;德国蒂宾根</td><td>28091873</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器（100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf（美国韦斯特伯里）</td><td>&amp;nbsp;4920000059</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器（10 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf（美国韦斯特伯里）</td><td>&amp;nbsp;4920000113</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司&amp;nbsp;</td><td>JD4020</td><td>弯曲尖端</td></tr><tr><td>哈密顿注射器</td><td>美国，内华达州，汉密尔顿</td><td>80501</td><td>第50卷 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>微型蚊式止血钳</td><td>F.S.T（美国福斯特市）</td><td>13011-12</td><td>弯曲，尖端宽度 1.3mm</td></tr><tr><td>持针器&amp;nbsp;</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司（中国上海）</td><td>J32110</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>F.S.T（美国福斯特城）</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>1-mL 注射器</td><td>中国山东，威高集团医用高分子有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;材料与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体</td><td>CST（Danvers，&amp;nbsp; 美国</td><td>#2118</td><td></td></tr><tr><td>抗荧光素酶抗体</td><td>Abcam（英国剑桥）</td><td>ab187340</td><td></td></tr><tr><td>抗兔IgG</td><td>CST（Danvers，&amp;nbsp; 美国</td><td>&amp;nbsp;#7074</td><td></td></tr><tr><td>抗VDR抗体</td><td>Abcam（英国剑桥）</td><td>&amp;nbsp;ab109234</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆）</td><td>PA175056</td><td></td></tr><tr><td>水合氯醛</td><td>凌峰化学（中国上海）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆）</td><td>375418</td><td>1.8 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet（中国上海）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Gibco（美国格兰德岛，&amp;nbsp; 美国</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Entoiodine</td><td>LiKang（中国上海）</td><td>310132</td><td></td></tr><tr><td>EP管</td><td>Sarstedt（Newton，美国）</td><td>PCR001</td><td></td></tr><tr><td>过滤</td><td>默克密理博（贝德福德，美国）</td><td></td><td>孔径 0.2 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>一品制药有限公司（中国河北）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素</td><td>普洛麦格（美国麦迪逊）</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>用于 Western 的裂解缓冲液&amp;nbsp; 印迹</td><td>碧云天（中国上海）</td><td>P0013J</td><td>无抑制剂</td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Apex Laboratories（墨尔本，澳大利亚）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco（美国格兰德岛，&amp;nbsp; 美国</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>赛默飞世尔科技（美国沃尔瑟姆）</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>上海医疗器械（集团）有限公司（中国上海）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>钢球</td><td>宁波科学生物技术有限公司（中国宁波）</td><td></td><td>宽度 1.5 mm</td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>康丽医疗设备有限公司（中国浙江）</td><td></td><td>30 号针头&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>中国广东省，Warmtact电气加热技术有限公司</td><td>NF-GNCW</td><td></td></tr></tbody></table>

一种简单高效的方法 体内 小鼠心肌内注射实现心脏特异性基因操作

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

特异性地在心脏中进行基因操作可显著促进对心脏疾病发病机制及其治疗潜力的研究。体内心脏特异性基因递送通常通过全身性或局部递送实现。通过尾静脉进行全身注射，使用重组腺相关病毒9型（AAV9）可简便高效地调控心脏基因表达。然而，该方法需要相对较高剂量的载体才能实现有效转导，且可能导致非靶器官的基因转导。本文介绍一种简单、高效且省时的小鼠体内心脏特异性基因操作方法——心肌内注射。在不进行通气的麻醉条件下，钝性分离胸大肌和胸小肌，通过第四肋间的小切口手动将小鼠心脏快速暴露。随后使用汉密尔顿注射器将编码荧光素酶（Luc）和维生素D受体（VDR）的腺病毒，或靶向VDR的短发夹RNA（shRNA），注射至心肌组织中。后续的体内成像结果显示，荧光素酶在心脏中实现了特异性成功过表达。此外，Western blot分析证实了VDR在小鼠心脏中成功过表达或被有效沉默。一旦掌握该技术，即可用于小鼠心脏中的基因操作，以及细胞或其他材料（如纳米凝胶）的注射。

实验方案及所报道方法的一些关键步骤如下所示 图1在注射编码荧光素酶的腺病毒（Adv-luc）至心肌后第5天 体内 在注射了 adv-luc 的小鼠中进行成像，结果显示荧光素酶在心脏中特异性显著过表达（图2A, B），该结果经蛋白质印迹分析（Western blot）证实（图2C)，提示无非靶器官的转导。相比之下，对照小鼠中未检测到荧光素酶表达。与荧光素酶成功过表达结果一致，Western blot分析显示，注射编码VDR的腺病毒（adv-VDR）的小鼠左心室中VDR表达显著增加图3A）。此外，adv-shVDR 注射显著降低了左心室中的 VDR 表达水平（图3B）。相比之下，在注射了adv-VDR或adv-shVDR的小鼠中，...

本文介绍了一种在小鼠中实现心脏特异性基因操作的实验方案。在麻醉条件下，通过第四肋间切口将小鼠心脏暴露于体外，随后使用注射器将编码特定基因的腺病毒注入心肌组织，接着通过蛋白质表达检测方法进行分析。 体内 成像和蛋白质印迹分析。

心脏特异性基因操作显著增强了对心脏疾病病理机制及其治疗潜力的研究。

本实验的总体目标是通过向成年小鼠心肌内注射腺病毒，实现体内心脏特异性的基因操作。该方法有助于回答心血管研究领域中关于分子机制、心肌损伤修复以及基因治疗有效性的关键问题。该技术的主要优势在于无需进行呼吸机辅助，小鼠术后恢复迅速，且方法可重复、操作简便。现在，让我们开始操作。在实验当天，将纯化的腺病毒载体溶液从零下80摄氏度取出，置于冰上融化。当腺病毒溶液完全解冻后，戴上口罩、无菌手术衣和无菌手套。用75%乙醇喷洒腺病毒管。将病毒转移至无菌超净工作台，用50微升无菌Hamilton注射器吸取50微升病毒溶液。在注射器上安装30号针头。将注射器置于直立位置。轻轻推动推杆，直至针尖处出现一滴溶液，以使病毒充满针尖。然后，小心吸取另外30 µL的腺病毒溶液至注射器中，并将注射器放置在冰上。为了将腺病毒注射到小鼠心脏中，需通过夹捏脚趾无反应来确认动物已达到适当的麻醉水平，并在动物眼睛上涂抹眼膏。剃除动物胸部上部和腹部的毛发，并在暴露的皮肤上涂抹市售的脱毛膏。一分钟后，使用湿纱布擦去药膏及残留的毛发。使用三种含碘氯己定的消毒剂对胸部左下侧进行消毒。然后，用手术巾覆盖动物，在手术区域对应位置剪开一小孔，并戴上一副新的无菌手套。接下来，使用无菌技术和器械，从剑突至腋窝做一条0.5厘米的皮肤切口，并用镊子和微型蚊式止血钳钝性分离胸大肌和胸小肌。牵开胸大肌和胸小肌以暴露肋间间隙，然后使用微型蚊式止血钳穿刺并打开第四肋间间隙。用非优势手的食指轻轻按压胸壁右侧，将心脏向切口方向移动。然后用同一只手的食指和拇指小心固定外置的心脏，用优势手向左心室的腹侧、背侧和侧壁心肌分别注射10 µL的腺病毒溶液。最后一次注射完成后，立即将心脏复位至胸腔内。轻轻按压胸壁朝向切口位置，以手动排出胸膜腔内的空气。使用5-0丝线以水平褥式缝合法缝合皮肤，并将小鼠置于37°C加热垫上，在监测下直至完全恢复。随后，将使用过的Hamilton注射器及30号针头放入高温高压灭菌器中进行灭菌，并将灭菌后的针头丢弃至合适的锐器容器中。腺病毒介导的荧光素酶心肌内注射后第5天，活体成像显示心脏部位荧光素酶显著过表达，该结果可通过Western blot分析证实，提示未发生非靶器官的转导。Western blot分析还显示维生素D受体表达显著增加。此外，注射编码维生素D受体腺病毒的小鼠左心室也表现出相应变化。在注射了编码靶向维生素D受体RNA短发夹的腺病毒的动物中，该受体的表达明显降低。相比之下，在左心室注射的动物中，其右心室的维生素D受体表达未发生显著变化。一旦掌握，若操作得当，该方法可在两分钟内完成。采用此方法后，还可进行其他技术，如心肌细胞注射，以回答更多科学问题，例如特定细胞疗法在心肌梗死中的有效性。

a-simple-efficient-method-for-vivo-cardiac-specific-gene-manipulation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种简便、有效的心肌注射小鼠心脏特异基因操作方法--体内

在小鼠急性缺血/再灌注损伤和慢性重塑的研究中，涉及多种基因操作和/或心肌内注射基因、蛋白质、细胞和/或生物材料，这些操作随时间维度叠加进行。本视频展示了缺血/再灌注、永久性冠状动脉结扎以及心肌内注射研究的显微外科操作步骤。...

冠状动脉结扎与心肌内注射在小鼠心肌梗死模型中的应用

一种用于在活体生物中随时间追踪细胞融合的方法。该方法利用 Cre-LoxP 通过细胞融合诱导荧光素酶表达的重组。所产生的发光信号可在活体生物中利用生物发光成像系统进行检测，其检测灵敏度为...

一种用于检测细胞融合的Cre-LoxP重组方法 体内

在心血管疾病（如高血压或心肌梗死）的鼠类模型中，心肌内细胞移植被广泛用于评估不同细胞类型在再生研究中的治疗潜力。因此，对该手术操作进行详细描述并提供清晰的可视化展示，将有助于明确在小型啮齿类动物中开展心血管细胞治疗分析的局限性与优势。...

心肌内细胞递送：小鼠心脏中的观察

我们描述了一系列方法，用于在小鼠胚胎发育第9.5天（E9.5）及之后阶段，向胚胎内注射染料、DNA载体、病毒和细胞，以监测来源于胚胎或 pluripotent...

发育中胚胎小鼠心脏的细胞标记与注射

超声心动图引导下的经皮心肌内注射是一种高效、可靠且可靶向的小鼠心脏基因转导剂或细胞递送方法。按照本方案所述步骤操作，实验人员可迅速掌握这种用途广泛且微创的技术。...

超声引导下经胸心肌内注射小鼠技术

在考虑将新型治疗策略应用于人体之前，心脏再生医学领域需要在大型临床前动物模型中进行广泛而详细的研究。本文中，我们演示了一种在兔模型中通过经皮对比超声心动图引导下进行心肌内注射的技术，该技术对于验证此类新型疗法的有效性具有重要的假说检验价值。...

经皮对比超声心动图引导下心肌内注射及细胞递送在大型临床前模型中的应用

该方法中，胚胎心脏组织经过显微手术分离、解离、荧光标记后，植入宿主胚胎组织。这为研究异位血流动力学条件下和/或改变的旁分泌/邻近分泌环境下的细胞或组织水平发育调控提供了平台。...

基于显微注射的禽类胚胎体内植入胚胎心肌细胞系统

本方案介绍了一种在小鼠心肌梗死后利用修饰型mRNA（modRNA）瞬时上调目的基因的简单且连贯的方法。...

在心肌梗死小鼠模型中递送修饰的mRNA

本方案描述了在超声心动图引导下，通过直接心肌内注射病毒在大鼠和小鼠心脏中实现外源基因表达的方法。同时，本文还介绍了通过程序性电刺激离体、Langendorff灌注心脏来评估心脏对心室心律失常易感性的方法。...

啮齿类动物心脏中的病毒转基因表达及心脏心律失常风险评估

本方案介绍了一种基于电穿孔技术在发育中鼠心心脏细胞中进行转基因操作的详细方法学框架。所提供的视频资料将有助于学习和掌握这一多功能技术。...

一种高效转基因方法用于小鼠胚胎心脏的基因递送

本文详细介绍了一种采用29 G x 88...

超声心动图引导下靶向且可靠的干细胞心肌内注射在心肌梗死大鼠模型中的应用

学习通过心肌内腺病毒注射实现成年小鼠心脏特异性基因操作的方法。该技术无需通气、恢复迅速且可重复，为心血管疾病基因治疗研究提供可靠工具。

一种简单高效的方法体内小鼠心肌内注射实现心脏特异性基因操作

探索更多视频

一种简单高效的方法 体内 小鼠心肌内注射实现心脏特异性基因操作

探索更多视频

一种简单高效的方法体内小鼠心肌内注射实现心脏特异性基因操作