从黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫中提取血细胞用于微生物感染与分析

该技术有助于解答细胞感染与微生物学领域的关键问题，例如血细胞如何参与果蝇的整体免疫反应。该技术的主要优势在于可在实验室中进行，使用先前已被感染的幼虫。或者，也可采用未感染幼虫的血细胞进行离体感染实验。

该方法的可视化演示至关重要，因为共聚焦显微镜操作复杂，且三维模型重建存在多种选项，使得成像步骤难以掌握。开始实验方案时，在体视显微镜下放置两到三层10厘米×10厘米的石蜡膜。接着，通过将毛细管极加热器设置为最大功率的55%，对玻璃毛细管进行预处理。

将毛细管拉制成尖端直径约十微米的锐利尖端。用矿物油从后端填充毛细管。将填充好的毛细管安装到纳米注射仪上。

用镊子折断融合毛细管的尖端以打开管口。尽可能将毛细管尖端中的油排出，然后用果蝇血细胞分离培养基（DHIM）填充毛细管。为了便于观察血淋巴与油之间的界面，可在油与 DHIM 之间留一个气泡。

用镊子从培养瓶内壁轻轻夹取十只三龄果蝇幼虫，放入一个100微米的筛网中。将5毫升无菌水倒入筛网中的幼虫上，并摇晃筛网5秒钟。然后将筛网置于实验用纸巾上，以去除多余的水分。

将幼虫转移至1.5毫升微量离心管中，用CO2气体麻醉5秒。随后，在体视显微镜下将幼虫置于石蜡膜上，背面向上。用玻璃毛细管轻轻压住幼虫后部以固定其位置，并用尖头镊子撕开后部表皮。

让血淋巴流到石蜡膜上。每次在石蜡膜上汇集20至50只幼虫的血淋巴（包含血细胞），形成血淋巴液滴。使用纳米注射器上的玻璃毛细管吸取汇集的血淋巴。

将血淋巴排出至含有500微升DHIM的1.5毫升微量离心管中。在葡萄汁琼脂平板上放置酵母糊。在琼脂上划出细小切口，以便幼虫迁移，避免干燥。

使用石蜡膜和持针镊组装一支尖端为0.001毫米的钨针。在体视显微镜下，将50微升高滴度表达mCherry的贝氏柯克斯体（C. Burnetii）移液至石蜡膜上，并将幼虫放入细菌液滴中。用钨针刺穿幼虫。

将幼虫转移至琼脂平板上。将剩余的病原体培养基也转移至该琼脂平板上，并用石蜡膜密封平板。将幼虫置于潮湿空气中培养，直至达到所需的感染后时间点。

将感染贝氏柯克斯体（C. Burnetii）的幼虫置于培养板中孵育24小时。在24孔板的每个孔中放入一个直径12毫米的圆形盖玻片。用移液器向孔中加入500 µL DHIM培养基。

吸取并收集先前感染的幼虫血淋巴，然后将血淋巴排入孔板中。以1000 G离心5分钟。配置共聚焦显微镜，进行DAPI、EGFP和mCherry的三色成像。

将样品置于显微镜下，使用数值孔径为1.4的63倍物镜对样品进行聚焦。在视野中找到需要成像的目标血细胞。然后，调节激光功率和探测器增益，以获得合适的样品曝光。

检查多个Z平面，以确保曝光水平适用于整个样本厚度。接下来，确定一个完整血细胞在Z轴上的顶部和底部位置，并将这两个位置分别设置为Z轴层切的起始和终止位置。

使用扫描缩放功能成像包含血细胞的区域。以适当的分辨率采集图像序列，例如在X Y平面为1024×1024像素，Z轴方向间距为0.3 µm。将Z轴分层的图像序列文件导入共聚焦显微镜配套的软件中，进行三维模型重建。

选择一个细胞，该细胞显示经 DAPI 染色的细胞核与表达 mCherry 的 C. burnetii 在表达 EGFP 的血细胞中发生共定位。将图像序列裁剪至仅包含该单个细胞。选择 3D 查看器选项，该选项将利用软件预置的算法重建 3D 模型。

在融合、表面和混合选项中选择所需的3D成像类型。在本方法中，血细胞、细胞核和贝氏柯克斯体使用表面模型显示。通过按住鼠标按钮并在屏幕周围拖动光标，从不同视角观察3D重建的细胞。

调整细胞方向和模拟光源的位置以优化图像。最后，使用裁剪和切片命令对模型进行横截面处理，以观察血细胞内部结构。通过对多张图像中提取的活体血细胞进行可视化观察，这些血细胞在hemolectin驱动下表达EGFP，结果显示大多数DAPI阳性细胞也呈EGFP阳性。

对感染贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）的血细胞进行横切面观察，证实了表达mCherry的细菌存在于细胞内部。图像被重建为三维模型，我们观察到体内感染的血细胞表现出更多的胞质突起，形态更为扁平；而体外感染的血细胞则更接近球形。

两种模型的横截面均证实，表达 mCherry 的考克斯体位于细胞内部。提取的血细胞用 IIV6 感染后进行定量反转录 PCR 分析，结果显示 IIV6-193R 转录本在 IIV6 感染细胞中的水平显著高于对照组细胞。在进行该实验操作时，务必提前准备好所有培养基，并将其平衡至室温，以避免细胞因缺乏适当营养而暴露过久。

完成此操作后，还可进行其他方法，例如单细胞RNA测序，以回答更多问题，如宿主对感染的整体反应。该技术建立后，有助于免疫学和微生物学领域的研究人员利用果蝇或其他具有开放循环系统的动物，探索病原体侵袭过程及宿主反应。