A Blood-based Test for the Detection of ROS1 and RET Fusion Transcripts from Circulating Ribonucleic Acid Using Digital Polymerase Chain Reaction

该程序的总体目标是通过液滴数字 PCR 从全血样本中分离和表征肿瘤来源的循环核糖核酸。这种方法可以帮助回答肿瘤诊断领域的关键问题。例如如何从循环 RNA 和血液样本中检测肿瘤衍生的基因融合转录物。

该技术的主要优点是它使用高度优化的方法来稳定、提取和检测低频和血液样本中存在的 RNA 变体。基于血液的检测是传统组织活检的补充，其优点是利用微创技术，可以快速提供结果。虽然这种方法可以提供对临床上显着突变和 NSCLC 的见解，但它也可以应用于需要可访问和快速识别全血中循环 RNA 分子的其他系统。

用于逆转录反应的循环 RNA 如文本方案中所述，从供体的血液样品中分离出来。使用市售的逆转录反应试剂盒（包括随机引物）将浓缩的循环 RNA 样品转化为 cDNA。包括无反向转汇酶对照样品和无 RNA 对照样品。

逆转录反应完成后，使用市售的 DNA 浓缩离心柱从反应混合物中分离 cDNA。此步骤有助于去除酶、引物和游离的脱氧核苷酸三磷酸。如果 cDNA 不会立即用于 PCR 反应，请在负 80 摄氏度下储存。

执行此程序时，请穿上一次性实验服和丁腈手套，并有专门的试剂制备区域。盖住探针以保护它们免受光线照射，因为连续的光线会使附着在探针上的荧光染料变白。首先制备 PCR 混合物，最终反应体积为 20 μL，如下表所示，但尚未添加 cDNA。

接下来，将混合物加盖避光运输到位于单独预扩增区域的 PCR 洁净罩中。将混合物分配到 PCR 板中。将要检测的 cDNA 添加到 PCR 混合物中。

用可拆卸的板密封剂覆盖板。短暂离心板以收集孔底部的样品。在摇板机上以较低的设置混合 10 秒钟。

再次短暂离心板以收集孔底部的样品。在执行手动液滴生成之前去除板密封剂。加载样品时，尽量减少移液器吸头中的气泡，然后将液滴从小柱缓慢转移到板中，以防止液滴损坏。

小心地将 20 μL PCR 混合物转移到液滴发生柱上的样品孔中。加入 70 微升液滴生成油。盖上橡胶垫圈，将小柱转移到手动液滴发生器中，以开始产生液滴。

液滴生成后，使用制造商推荐的吸头将液滴转移到新的 PCR 板中。缓慢吸液和分配液滴，每个液滴需要 5 到 6 秒，不要将吸头末端接触液滴小柱或板。用铝箔板密封机密封板。

使用以下设置在热循环仪中进行 PCR。热循环仪运行完成后，使用微滴读数仪读取板。为微孔板检测仪软件创建板布局，识别对照和样品的位置，并加载到软件中以开始读取。

使用市售软件分析微孔板读取结果。首先导航到分析菜单以查看二维或 2D 振幅图。通过检查快捷批处理数据来评估数据的总体质量。

使用 events 菜单，评估接受的事件总数的数据。每个井应有超过 10， 000 个事件。如果不是，则必须仔细评估数据是否存在其他问题。

接下来，检查数据中是否有令人讨厌的荧光振幅。重复样品之间的显著振幅差异和浓度差异表明样品处理或混合不良。记下在 45 度轴上带有喷雾图案的液滴簇，这表示液滴质量差或样品有问题。

首先检查阳性对照、无逆转录酶对照和无 RNA 对照的数据。选择所有对照样品并通过 2D 图检查簇质量以获得适当的阈值，液滴簇之间的明显分离应该是明显的。对于每个分析变体，根据对照孔设置阈值。

使用十字准线工具在 2D 图上设置阈值，以在 x 轴上将双阴性液滴群与对照基因群分开，在 y 轴上将变异基因群（如果存在）分开。单个样品的每个复制体孔中的一些副本。最后，将测试结果表示为检测到的变体拷贝数。

使用表达 SDC4-ROS1 融合和 CCDC6-RET 融合的细胞系，在人野生型 RNA 总 RNA 的背景下稀释，每个融合变异的检测限为 0.2%。未检测到 5% 脱离靶细胞系来源的 RNA 制备，证明检测特异性。在同一天的三次运行中测量高、中和低浓度的分析多重 RNA 标准品。

连续三天运行三次，由两名独立作员作。结果表明，准确检测了感兴趣的融合转录本以及内部对照基因 GUSB。每个临床样本也用阳性对照、无逆转录酶对照和无 RNA 模板对照进行运行。

融合变体沿 y 轴表示，而 GUSB 在 x 轴上。当在 21 天内评估批次对照时，在所有运行中观察到 ROS1 和 RET 的融合阳性液滴和 GUSB 对照基因液滴。在无逆转录酶对照中存在污染、无 RNA 对照中存在污染、液滴共享和聚结以及 PCR 条件优化不佳或 PCR 抑制的情况下，显示了代表性的次优结果。

一旦掌握，整个方案可以在大约 12 小时内完成。在尝试此程序时，使用处理 RNA 和人类血液样本的最佳实践非常重要。分离 RNA 后，可以进行其他方法，如下一代测序，以回答其他问题，例如鉴定新的融合变体。

观看此视频后，您应该对如何从全血和血浆中分离循环 RNA，然后处理回收的 RNA 以识别循环中的罕见变异（如 RET 和 ROS1）有很好的了解。开发后，这项技术为从全血中检测临床可作的突变铺平了道路。我们已经扩展了这些方法以检查流通中过度表达的转录本。