Name: 从酿酒酵母中组蛋白修饰的染色质沉淀 (芯片) (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学习从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中进行组蛋白修饰的染色质免疫沉淀技术。该方法可用于分析基因组中组蛋白翻译后修饰的丰度与定位，揭示基因表达调控机制。

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作者感谢 Green 实验室成员提供的有益讨论。本工作部分由 NIH 资助项目 R03AG052018 和 R01GM124342 支持，资助对象为 E.M.G。

1. 将抗体预结合至磁珠
<ol>
	<li>充分混匀蛋白A/G磁珠，每份免疫沉淀（IP）样品取20 µL磁珠转移至1.5 mL离心管中。 
	注意：吸取磁珠时，请使用宽孔、低吸附的枪头。</li>
	<li>将装有磁珠的离心管置于磁力架上，静置使磁珠吸附至管壁一侧，随后小心移除上清液。</li>
	<li>用1 mL预冷的Tris缓冲盐水（TBS）（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl）洗涤磁珠3次。</li>
	<li>向磁珠中加入200 µL TBS及适量抗体，于4 °C、8 rpm条件下旋转孵育过夜。 
	注意：对于多数组蛋白PTM抗体，每份IP使用1–3 µg抗体已足够。但建议通过梯度稀释实验确定最佳浓度。已充分表征的商业化组蛋白PTM抗体，其推荐使用浓度通常准确，可参考已发表文献或产品说明书。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上，待磁珠吸附后移除上清液，再用1 mL TBS洗涤一次。</li>
	<li>每份IP样品加入20 µL TBS重悬磁珠，并额外加入5 µL TBS（以补偿移液误差）。 
	注意：磁珠悬液可在4 °C短期保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 培养酵母细胞
<ol>
	<li>取适量YPD培养基（10%酵母提取物、20%蛋白胨和20%葡萄糖）10 mL，接种适当菌株的单菌落，于30 °C、220 rpm摇床培养箱中过夜培养。</li>
	<li>使用分光光度计测定酵母培养物在600 nm处的光密度（OD600），将培养物用新三角瓶中的100 mL YPD培养基稀释至OD600 = 0.2。</li>
	<li>将细胞在30 °C、220 rpm摇床培养箱中继续培养，直至达到对数中期（OD600 = 0.6–0.8）。</li>
</ol>
3. 体内 蛋白质与DNA的交联
<ol>
	<li>当培养物达到对数中期时，直接向培养基中加入 2.7 mL 的 37% 甲醛，使甲醛终浓度为 1%。将培养瓶转移至 25 °C（或室温）的摇床上，以 50 rpm 振荡 15 分钟。</li>
	<li>向培养基中加入 5 mL 的 2.5 M 甘氨酸，并在室温下继续以 50 rpm 振荡 5 分钟，以淬灭甲醛反应。</li>
	<li>将细胞转移至离心瓶中，在 4 °C 条件下以 5800 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
	<ol>
		<li>用 45 mL 冷 TBS 重悬细胞进行洗涤，并将悬液转移至 50 mL 圆底离心管中。在 4 °C 条件下以 2800 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用 10 mL 冷的 chIP 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），1% 非离子去污剂 NP-40）洗涤细胞，缓冲液储存于 4 °C。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 2800 × g 离心 3 分钟，弃去上清液。 
		注意：细胞可用液氮速冻后于 -80 °C 保存，直至后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 制备酵母裂解液
<ol>
	<li>在含有1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）和1:1,000稀释的酵母蛋白酶抑制剂混合物的1 mL冷ChIP裂解缓冲液中重悬细胞。将悬液转移至含有200 µL玻璃珠的2.0 mL螺口管中。</li>
	<li>将细胞置于珠磨仪中，在4 °C下高速振荡，每次珠磨30秒，共进行6次。每次珠磨之间将细胞置于冰上至少1分钟。</li>
	<li>使用加样枪头将裂解物转移至1.5 mL离心管中。在4 °C下以15,500 × g离心20分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用250 µL MNase消化缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，10 mM NaCl，3 mM MgCl2，21 mM CaCl2，1% NP-40，4 °C保存）轻轻吹打重悬沉淀。</li>
	<li>向反应体系中加入2.5 µL MNase。轻轻颠倒混匀4–6次，立即在37 °C水浴中孵育20分钟。 
	注意：当使用新的MNase批次时，应优化消化条件。参见步骤10中的方案。</li>
	<li>立即将离心管置于冰上以终止反应，并加入5 µL 0.5 M EDTA，使EDTA终浓度为10 mM。轻轻颠倒混匀。</li>
	<li>在4 °C下以15,500 × g离心15分钟，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。 
	注意：可溶性（已消化）染色质位于上清液中。沉淀物包含未消化物质及不溶性细胞碎片。</li>
</ol>
5. 免疫沉淀（IP）修饰组蛋白
<ol>
	<li>使用Bradford法测定每个MNase释放的染色质组分的蛋白浓度。在8个一次性比色皿中各加入1 mL Bradford试剂，并为每个待测蛋白样品额外准备一个比色皿。
	<ol>
		<li>配制浓度为2 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）储备液。</li>
		<li>向1 mL Bradford试剂中加入适当体积的BSA溶液，使其终浓度分别为：0 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL和10 μg/mL。向额外的比色皿中各加入2 μL MNase释放的染色质组分。</li>
		<li>用一小块封口膜覆盖每个比色皿口，倒置混匀4–6次，充分混匀溶液。室温孵育15分钟。</li>
		<li>使用可见光分光光度计，在595 nm处测定标准曲线样品和实验样品的吸光度。 
		注意：在进行首次测量前，使用不含BSA（0 μg/mL）的比色皿作为空白对照校准分光光度计。</li>
		<li>利用分光光度计配套软件或电子表格软件，根据不同BSA浓度对应的吸光度值绘制标准曲线。根据标准曲线及所用稀释倍数（1:500），计算各染色质组分样品的蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于每次免疫沉淀（IP），取MNase释放的染色质组分中含50 µg总蛋白的样品，加入ChIP裂解缓冲液，调整终体积至1 mL。 
	注意：若每份裂解液需进行多次IP，可先将裂解液与ChIP裂解缓冲液配制成主混合液，再分装1 mL至各个独立离心管中用于IP。</li>
	<li>从IP反应体系中取出100 µL作为输入（input）样品进行后续处理。将输入样品于-20 °C冷冻保存，直至步骤7.1使用。 
	注意：如有剩余的染色质样品，也可在-20 °C冻存，根据需要用于后续的IP实验。</li>
	<li>向每个IP样品中加入20 µL预先与抗体结合的磁性Protein A/G珠。在4 °C、8 rpm条件下旋转孵育3小时（常规）或过夜（如需要）。</li>
</ol>
6. 洗涤免疫沉淀物并洗脱组蛋白-DNA复合物
<ol>
	<li>将试管放入磁力架中，使磁珠吸附在管壁一侧。用移液器吸去上清液。随后依次用以下每种缓冲液各1 mL洗涤磁珠。
	<ol>
		<li>每次洗涤均在4 °C下以8 rpm转速旋转5分钟，然后将试管置于磁力架上，吸去上清液，再加入下一种缓冲液：ChIP裂解缓冲液（2次）、高盐洗涤缓冲液（2次）（50 mM Tris-HCl pH 7.5，500 mM NaCl，1 mM EDTA，1% NP-40，4 °C保存）、LiCl/去垢剂洗涤缓冲液（1次）（10 mM Tris-HCl pH 8.0，250 mM LiCl，1 mM EDTA，1% NP-40，1% 脱氧胆酸钠，4 °C保存）、TE缓冲液（1次）（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA，4 °C保存），以及TE缓冲液（1次）。</li>
		<li>最后一次使用TE缓冲液洗涤时，先用0.5 mL TE缓冲液将大部分磁珠转移至新管中，再用另外0.5 mL TE缓冲液冲洗原管并将残留磁珠转移至新管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向磁珠中加入250 µL新鲜配制的ChIP洗脱缓冲液（1% SDS，1 mM NaHCO3）。短暂涡旋混匀。室温下以8 rpm转速旋转样品15分钟。</li>
	<li>将试管置于磁力架上，使磁珠吸附。小心地将上清液转移至新管中，避免接触磁珠。 
	注意：洗脱液中含有免疫沉淀的蛋白质及其结合的DNA。</li>
	<li>向磁珠中再加入250 µL ChIP洗脱缓冲液。室温下以8 rpm转速旋转样品15分钟。</li>
	<li>小心地将上清液转移至含有第一次洗脱液的同一管中。如有必要，可减少取液体积（如240 µL），以避免扰动磁珠，所有免疫沉淀实验均应保持一致。</li>
</ol>
7. 反向蛋白质-DNA 交联
<ol>
	<li>解冻输入样品，并向每个输入样品中加入 400 µL ChIP 洗脱缓冲液。</li>
	<li>向输入样品和免疫沉淀（IP）样品中分别加入 20 µL 5 M NaCl、5 µL 20 mg/mL 甘油、以及 12.5 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K。通过轻轻颠倒或弹击管壁充分混匀。将样品置于 65 °C 水浴中孵育过夜。</li>
</ol>
8. 纯化并浓缩 DNA
<ol>
	<li>向输入样品和免疫沉淀（IP）样品中加入 10 µL 的 10 mg/mL RNase A。将样品置于 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
	<li>向水相溶液中加入 600 µL 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1 PCI），充分混匀。在室温下以 15,500 × g 离心 5 分钟。
	<ol>
		<li>将上层水相转移至新离心管中。加入 600 µL PCI，充分混匀。在室温下以 15,500 × g 离心 5 分钟。将水相转移至新的离心管中。 
		注意：使用 PCI 时应在通风橱内操作，并佩戴适当个人防护装备。液体和固体废弃物应按照机构规定进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠和 1 mL 冷的 100% 乙醇以沉淀 DNA。轻轻颠倒离心管 4–6 次，充分混匀溶液。在 -20 °C 下孵育过夜。
	<ol>
		<li>在 4 °C 下以 15,500 × g 离心 20 分钟。用移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>用 1 mL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。在 4 °C 下以 15,500 × g 离心 10 分钟。用移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>在通风橱中将沉淀空气干燥约 20 分钟（直至完全干燥）。将 IP 样品重悬于 50 µL 无核酸酶水中，将输入样品重悬于 100 µL 无核酸酶水中。将 DNA 样品储存于 -20 °C，直至进行 qPCR 分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 定量 PCR（qPCR）检测富集的基因组区域
<ol>
	<li>为每对引物配制qPCR预混液。每次反应包含5 µL的2x qPCR预混液、0.25 µL的20 µM正向引物和0.25 µL的20 µM反向引物。 
	注意：qPCR实验的引物设计与验证方法在其他文献中有详细描述14,15,16。</li>
	<li>为每个DNA样本配制DNA预混液。每次反应包含0.5 µL DNA和4.0 µL无核酸酶水。</li>
	<li>向384孔qPCR板的每个孔中加入5.5 µL相应的引物预混液和4.5 µL相应的DNA预混液。 
	注意：首先向每个孔中加入5.5 µL引物预混液。在加入4.5 µL DNA预混液之前，将qPCR板在室温下以200 × g离心1分钟。</li>
	<li>将封膜贴合到qPCR板上，并在室温下以200 × g离心1分钟。</li>
	<li>使用实时qPCR系统进行qPCR扩增，反应条件如下：95 °C预变性3分钟；40个循环（95 °C变性10秒，55 °C退火30秒）；熔解曲线分析从65 °C升至95 °C，每步0.5 °C，每步停留5秒。</li>
	<li>对于每对引物，根据qPCR中使用的5% input样本，计算IP样本相对于input的百分比输入量。使用技术重复三次的qPCR平均值进行计算。 
	注意：如果qPCR技术重复之间存在显著差异，建议重新进行qPCR实验，并重点关注预混液配制、移液误差以及384孔板中孔间交叉污染等问题。
	<ol>
		<li>通过从原始Cq值中减去代表稀释倍数的循环数，将input样本的Cq值校正为100% input。 
		注意：5% input代表20倍稀释，相当于4.32个循环数（log2 20 = 4.32）。</li>
		<li>按公式2^(Cqinput - CqIP) × 100计算百分比输入量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 确定MNase消化条件（建议在首次完整的chIP实验前进行）
<ol>
	<li>按照前述方案的步骤 2.1 至 4.4 操作。扩大实验规模，以获得足量裂解物，用于对含染色质的沉淀进行多个样品的 MNase 消化。在步骤 4.4 中，将沉淀重悬于 1.25 mL MNase 消化缓冲液中。将样品分装至 5 个管中，每管含有 250 µL 重悬于 MNase 消化缓冲液中的染色质沉淀。</li>
	<li>向每管分别加入 0、1.5、2.5 或 5 µL MNase。通过倒置混合 4–6 次，轻柔混匀，并立即将各管置于 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。</li>
	<li>立即把各管置于冰上，并加入 5 µL 0.5 M EDTA（终浓度为 10 mM）以终止反应。通过倒置轻柔混匀溶液。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 15,500 × g 离心 15 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 管中。</li>
	<li>向 1.5 mL 管中的样品加入 SDS 至终浓度 1%（25 µL 10% 储存液）和 NaHCO3 至终浓度 0.1 M（25 µL 1 M 储存液）。</li>
	<li>向 1.5 mL 管中的样品加入 20 µL 5 M NaCl、5 µL 甘油原和 12.5 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K。在 65 °C 孵育过夜。</li>
	<li>加入 10 µL 10 mg/mL RNaseA。在 37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>向水相溶液中加入 300 µL PCI，充分混匀。在室温下以 15,500 × g 离心 5 分钟。
	<ol>
		<li>将水相层转移至新管。加入 300 µL PCI，充分混匀。在室温下以 15,500 × g 离心 5 分钟。将水相层转移至新管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 3 M 醋酸钠体积的 0.1 倍（通常约为 30 µL）和 1 mL 冷的 100% 乙醇以沉淀 DNA。倒置混匀 4–6 次。在 -80 °C 孵育 1 小时或在 -20 °C 过夜。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下以 15,500 × g 离心 20 分钟。用移液器小心吸除上清液。</li>
		<li>用 1 mL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。在 4 °C 条件下以 15,500 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>将沉淀在通风橱中晾干约 20 分钟（或直至完全干燥）。用 30 µL 无核酸酶水重悬沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 DNA 上样染料，取 20 µL 样品在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，以观察消化后的 DNA。</li>
</ol>

<ol><li>Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+Your+Own+Adventure%3A+The+Role+of+Histone+Modifications+in+Yeast+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate.</a> J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).</li>
<li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+combinatorial+functions+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals and combinatorial functions of histone modifications.</a> Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Lefrançois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+yeast+ChIP-Seq+using+multiplex+short-read+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing.</a> BMC Genomics. 10, 37(2009).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins+associated+with+specific+genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins associated with specific genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAP-MS%3A+a+method+for+identification+of+proteins+and+histone+posttranslational+modifications+at+a+single+genomic+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li>
<li>Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+systems+approaches+for+the+analysis+of+histone+modification+readout%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout.</a> Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein%3ADNA+associations+in+a+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li>
<li>Meluh, P. B., Broach, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+analysis+of+yeast+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunological analysis of yeast chromatin.</a> Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).</li>
<li>Rozen, S., Skaletsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).</li>
<li>Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+RT-qPCR-Publishing+data+that+conform+to+the+MIQE+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines.</a> Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).</li>
<li>Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+primers+and+probes+for+quantitative+real-time+PCR+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods.</a> Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).</li>
<li>Briggs, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+lysine+4+methylation+is+mediated+by+Set1+and+required+for+cell+growth+and+rDNA+silencing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H3+Lys+4+in+coding+regions+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes.</a> P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).</li>
<li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p%3A+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li>
<li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li>
<li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3%27-end+antisense+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).</li>
<li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li>
<li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li>
<li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法可通过免疫沉淀高效回收酵母细胞中与修饰组蛋白结合的DNA。随后使用可扩增目标区域的引物进行qPCR，以确定特定组蛋白修饰在局部区域的富集或耗竭情况。尽管染色质免疫沉淀（chIP）技术已有近20年的发展历史，它仍然是研究不同基因组区域及多种条件下组蛋白修饰状态的决定性实验方法。虽然将chIP与下一代测序技术联用可实现全基因组范围内的组蛋白修饰分析6,7，但这些方法的成本和所需的数据分析工作量可能限制其在某些实验室环境中的应用。此外，这些表观基因组学实验之后通常还需进行与qPCR联用的chIP实验，以验证某些基因组位点处组蛋白修饰状态的观察结果。目前尚无多少其他方法能够像chIP一样，有效地将组蛋白标记（或其他蛋白质）在物理上与基因组中的特定位置关联起来，并分析该相互作用在不同环境或生物学条件下的动态变化。尽管近期已有成功从定义明确的基因组区域分离染色质，并利用质谱技术鉴定局部组蛋白修饰的报道8,9</sup...

组蛋白的动态翻译后修饰（PTM）是调控多种以DNA为模板的生命过程的关键机制，包括转录、复制和DNA修复1,2因此，确定这些过程中修饰组蛋白的丰度及其精确定位的能力，对于理解细胞在不同条件下对这些过程的调控机制至关重要。染色质免疫沉淀（chIP）技术的发展在很大程度上源于蛋白质与DNA相互作用的生化研究，特别是 体外 使用化学交联剂的方法，结合评估蛋白质-DNA 相互作用动态特性的需求 体内 以及基因组的特定区域3,4,5定量PCR（qPCR）和测序技术的进步也增强了开展染色质免疫沉淀（chIP）实验的能力，可实现定量比较并覆盖整个基因组，使其成为在多个层面解析DNA-蛋白质相互作用的有力工具。
目前，对于任何关注染色质介导的基因组调控的研究团队而言，染色质免疫沉淀（chIP）是一种必需的方法，因为在体内直接探究组蛋白修饰与特定基因组位点之间物理联系的方法中，尚无其他可与之相比的技术。in vivo。尽管已有采用下一代测序技术来全基因组范围内绘制组蛋白修饰图谱的chIP方法变体6,7，但这些方法可能适用于不同的科学问题，且其规模、成本和技术资源需求可能限制部分研究团队的应用。此外，靶向chIP-qPCR对于补充上述方法至关重要，它既可用于测序前优化chIP实验流程，也可用于验证表观基因组数据集的结果。基于质谱的技术也已发展用于鉴定与基因组区域相关的完整组蛋白修饰谱8,9,10,11，然而这些技术在可检测的基因组区域范围方面存在一定局限性，且需要特定的技术专长和仪器设备，并非所有研究团队均具备。因此，在不同实验条件下分析组蛋白修饰的丰度与分布，chIP仍是所有关注表观遗传学、染色质及基因组功能调控的研究团队所依赖的基础性方法。
本文介绍了一种利用芽殖酵母模型Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)进行染色质免疫沉淀（chIP）的方法，用于研究组蛋白翻译后修饰（PTMs）在染色质上的分布。该方法基于在酵母中建立并已广泛应用于多种模式系统的chIP核心技术12,13。通过甲醛交联固定细胞内修饰组蛋白与DNA之间的相互作用。在制备裂解液后，利用微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）将染色质片段化为大小均一的片段。使用商业化或实验室自制的抗体对修饰组蛋白进行免疫沉淀，随后分离与其结合的DNA，并通过qPCR检测特定基因组区域的富集情况（图1）。对于多数组蛋白修饰，本方案所获得的DNA量足以通过qPCR检测超过25个不同的基因组位点。
该ChIP方法具有高度的通用性，可用于监测单一组蛋白修饰在多个突变菌株或不同环境条件下的分布情况，也可用于检测野生型细胞中多个基因组位点上的多种组蛋白修饰。此外，该实验方案的多个组分均可灵活调整，以优化对高丰度或低丰度组蛋白标记的检测效果。最后，在酿酒酵母中进行修饰组蛋白的ChIP实验，可利用一些关键的对照来验证抗体的特异性，而这些对照在其他系统中大多无法实现。具体而言，可构建在特定修饰位点发生氨基酸残基定点突变的酵母菌株；在某些情况下，某一特定组蛋白残基的修饰仅由单一酶催化完成。例如组蛋白赖氨酸甲基转移酶）。因此，可在组蛋白突变株或酶缺失菌株中进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验，以检测抗体非特异性结合的程度，并评估其是否导致假阳性结果。该对照对于新开发的抗体尤为重要，甚至可用于在其他系统中应用前，验证抗体对保守组蛋白修饰的特异性。该方法可与其他检测抗体特异性的方法相互补充，后者包括使用不同修饰状态（如单甲基化、二甲基化和三甲基化）的修饰肽芯片进行检测，以及对具有明确修饰的组蛋白或核小体进行蛋白质印迹（Western blot）分析。总体而言，在酿酒酵母中进行ChIP是一种强大的方法，可用于评估组蛋白PTM在全基因组范围内的动态变化，并解析调控这些修饰的分子机制。

<table><tbody><tr><td>酵母提取物</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-壬基苯基-聚乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>等同于 NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>酵母蛋白酶抑制剂混合物</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 酚:24 氯仿:1 异戊醇</td><td>VWR Life Science</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>微球菌核酸酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNase A&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Bradford 法检测试剂</td><td>ThermoScientific</td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BSA 标准品 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4</td><td>EMD Millipore</td><td>04-858</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H4K16ac</td><td>EMD Millipore</td><td>ABE532</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha; H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;高 Rox qPCR 混合液</td><td>Accuris qMax Green, 低 Rox qPCR 混合液</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G 磁珠</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>适用于 1.5 mL 管的磁力架</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>酸洗玻璃珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;微型管匀浆器</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>带密封圈的 2.0 mL 螺口管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>加样枪头（凝胶上样用）</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>384 孔 PCR 板</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;旋转式摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>型号 G10</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

组蛋白修饰的染色质免疫沉淀（chip）实验——以酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）为材料

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

组蛋白翻译后修饰（PTMs），如乙酰化、甲基化和磷酸化，由一系列酶动态调控，这些酶根据细胞接收到的信号添加或去除这些修饰标记。这些PTMs在基因表达调控和DNA修复等过程的调控中起着关键作用。染色质免疫沉淀（chIP）已成为解析在不同细胞扰动条件下全基因组范围内多种组蛋白PTMs丰度与定位的重要手段。本文介绍一种适用于酿酒酵母中翻译后修饰组蛋白的染色质免疫沉淀的通用方法。 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 该方法描述如下：利用甲醛处理酵母培养物，实现蛋白质与DNA的交联；通过珠击法裂解酵母细胞制备裂解液；使用微球菌核酸酶消化使染色质片段溶解；随后对组蛋白-DNA复合物进行免疫沉淀。与目标组蛋白修饰相关的DNA被纯化后，通过定量PCR分析，评估其在基因组多个位点的富集程度。文中讨论了在野生型和突变型酵母中检测组蛋白修饰H3K4me2和H4K16ac定位的代表性实验，以展示数据分析与解释方法。该方法适用于多种组蛋白翻译后修饰（PTMs），可应用于不同突变菌株，或在多种环境胁迫条件下进行，是研究不同条件下染色质动态变化的有力工具。

该实验方案的一个关键步骤是优化微球菌核酸酶（MNase）的浓度，以将染色质消化成可溶性片段，如步骤10所述。这对于获得组蛋白修饰在基因组特定区域分布的高分辨率数据至关重要。应进行MNase梯度实验，以确定最适浓度，使可溶性染色质组分中主要为单核小体，并含有少量双核小体。可通过提取染色质沉淀经MNase消化后的DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳来观察结果（图2）。在本实验所用MNase的制备条件下，2.5 µL酶液（20单位/µL）可主要产生单核小体，因此该用量被用于后续的染色质免疫沉淀实验（chIP）。
本研究展示了该染色质免疫沉淀（chIP）实验的两组代表性结果（图3）。在第一个示例中，检测了野生型细胞与缺失催化该甲基化修饰的甲基转移酶的细胞中组蛋白甲基化标记的情况。具体而言，在野生型和set1Δ细胞中，分别使用针对H3...

本文介绍了一种从芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae中进行染色质免疫沉淀以富集修饰组蛋白的实验方案。免疫沉淀所得的DNA随后用于定量PCR，以检测组蛋白翻译后修饰在整个基因组中的丰度和定位情况。

组蛋白修饰的染色质免疫沉淀（ChIP）实验——以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为材料

组蛋白翻译后修饰（PTMs），例如乙酰化、甲基化和磷酸化，由一系列酶动态调控……

本染色质免疫沉淀实验方案的总体目标是确定组蛋白修饰在芽殖酵母基因组各个特定区域的丰度和定位。该方法有助于解答染色质调控中的关键问题，例如组蛋白修饰如何与基因表达调控相关联，以及这些修饰如何响应不同环境条件而发生变化。该方案具有高度通用性，可同时用于研究多种不同的组蛋白修饰及多个酵母菌株。尽管该方法可用于研究组蛋白修饰，但也可通过使用表位标签或现有抗体来研究其他染色质结合蛋白。首先接种酵母细胞：在新试管中，向10毫升YPD培养基中接种各适当菌株的单个菌落，并在30摄氏度、220 rpm条件下于摇床中过夜培养。次日，测定培养物在600纳米处的光密度（OD600），然后将培养物用新烧瓶中的100 mL YPD培养基稀释至OD600为0.2。将细胞在30 °C、220 rpm的摇床培养箱中培养至对数生长中期。当培养物达到对数生长中期时，向每瓶培养基中直接加入2.7 mL的37%甲醛，使甲醛终浓度为1%。将培养瓶转移至室温下的摇床，以50 rpm振荡15分钟。向培养基中加入5毫升2.5摩尔的甘氨酸，并在室温下以50转/分钟继续振荡5分钟，以淬灭甲醛。随后，离心收集细胞，并按照文本方案中所述进行洗涤。最后一次离心后弃去上清液，继续进行酵母裂解液的制备。将细胞重悬于含有1毫摩尔PMSF和1:1000稀释的酵母蛋白酶抑制剂混合液的1毫升冷染色质免疫沉淀或ChIP裂解缓冲液中。将悬液转移至含有200微升玻璃珠的2.0毫升螺旋盖管中。将细胞置于珠磨仪中，在4摄氏度下进行高速振荡处理。珠磨30秒，冰浴1分钟。总共进行六次珠磨，每次30秒的珠磨后，将细胞在冰上放置至少1分钟。使用加样枪头将裂解液转移至1.5毫升离心管中。在4 °C条件下，以15,500 ×g离心裂解液20分钟。弃去上清液，将沉淀物用250 µL微球菌核酸酶消化缓冲液轻轻吹打重悬。向每管反应体系中加入2.5 µL微球菌核酸酶。轻轻翻转混匀4至6次，立即在37摄氏度水浴中孵育20分钟。20分钟后，将离心管置于冰上以终止反应，加入5毫升0.5摩尔EDTA，使EDTA终浓度为10毫摩尔，再轻轻翻转混匀。在4摄氏度下以15,500 ×g离心15分钟。然后，将每份上清液转移至新的1.5毫升离心管中。为了获得最一致的结果，关键是要确保每次氨基酸沉淀反应中所用的蛋白浓度相同。根据氨基酸沉淀或免疫沉淀（IP）反应的数量，配制微球菌核酸酶释放的染色质组分与ChIP裂解缓冲液的主混合液，并将含有50微克总蛋白的1毫升混合液分装至各个独立的离心管中。从每个免疫沉淀混合物中取出 100 微升用于制备输入样品。将输入样品在 -20 摄氏度下冷冻，以备后续使用。同时，确保每次免疫沉淀所用的与抗体结合的磁珠量保持一致也非常重要。使用宽口移液器吸头，向每个免疫沉淀（IP）样品中加入20微升预先与抗体结合的磁性蛋白AG微珠。在4°C、8 rpm条件下旋转孵育样品3小时。免疫沉淀完成后，将离心管置于磁力架上，使微珠吸附至管壁一侧。使用移液器吸除上清液。向珠子中加入1毫升ChIP裂解缓冲液，在4°C、8 rpm条件下旋转孵育5分钟。然后将离心管置于磁力架上，吸除上清液。以这种方式，用以下缓冲液按指定次数依次洗涤磁珠：ChIP 裂解缓冲液、高盐洗涤缓冲液、LiCl/去污剂洗涤缓冲液和 TE 缓冲液。最后一次使用 TE 洗涤时，先用 0.5 毫升 TE 将大部分磁珠转移至新管中，再用另外 0.5 毫升 TE 洗涤原管并将剩余磁珠转移。向每根管中加入 250 微升新鲜配制的 ChIP 洗脱缓冲液，并短暂涡旋混匀。在室温下以每分钟8转的速度旋转样品15分钟。将离心管置于磁力架上。小心地将上清液转移至新的离心管中，避免触碰磁珠。向珠子中再加入 250 微升 ChIP 洗脱缓冲液。在室温下以 8 rpm 的速度旋转样品 15 分钟。小心地转移上清液至含有第一次洗脱液的管中，注意不要扰动珠子。解冻先前收集的输入样品，向每个输入样品中加入400微升ChIP洗脱缓冲液。为逆转蛋白质与DNA的交联，向输入样品和免疫沉淀样品中分别加入20微升5摩尔的氯化钠、5微升糖原和12.5微升蛋白酶K。通过轻轻颠倒或弹击离心管充分混匀。将样品置于65摄氏度水浴中过夜孵育。开始此实验步骤时，为每对引物配制QPCR预混液，将适量的QPCR混合液、正向引物和反向引物混合均匀。为每个DNA样本配制DNA预混液，每反应包含0.5微升DNA和4.0微升无核酸酶水。向384孔QPCR板的每个孔中加入5.5微升相应的引物预混液。在室温下以200 × g离心1分钟。然后，向每个孔中加入4.5 µL的相应DNA预混液。密封反应板，在室温下以200 ×g离心1分钟。使用实时定量PCR系统进行定量PCR扩增，反应条件如下：95 °C预变性3分钟；进行40个循环，每个循环为95 °C变性10秒，55 °C退火30秒；最后进行熔解曲线分析，从65 °C升至95 °C，每步升高0.5 °C并维持5秒。该实验方案的一个关键步骤是优化微球菌核酸酶的浓度，以将染色质消化成可溶性片段。此例为在染色质沉淀物中使用不同量的微球菌核酸酶消化后，对分离的DNA进行琼脂糖凝胶电泳所得到的结果，显示每微升20单位的酶用量为2.5微升时，主要产生单核小体。该代表性ChIP实验在野生型和set1基因敲除细胞中使用了针对组蛋白甲基化标记H3K4me2和组蛋白H3的抗体。Set1 敲除细胞缺乏催化该修饰的甲基转移酶。柱状图表示在指定低科学性区域 H3K4me2 的相对富集程度。野生型菌株在已知为 Set1 直接靶基因的 PMA1 和 ERG11 两个基因的 5' 端显示出明显的 H3K4me2 富集，而在 Set1 敲除细胞中未观察到信号。正如预期，TEL07L 位点没有 H3K4me2 修饰的富集；SPR3 的表达也曾被报道受 Set1 调控，但这些结果表明其调控机制可能不同于 PMA1 或 ERG11。一旦掌握，该技术若操作得当，可在四天内完成。在进行该实验时，重要的是要牢记使用适当的对照，仔细验证所用抗体的特异性。如果条件允许，应在定量PCR（QPCR）中同时检测阳性对照区域和阴性对照区域。在完成此操作后，还可进行其他方法，例如GP测序，以通过组蛋白修饰的分布来确定基因组。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过设计良好的对照实验，在独特的基因组区域一致地检测不同组蛋白修饰的水平。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

从酿酒酵母中组蛋白修饰的染色质沉淀 (芯片)

ESC的分化伴随着染色质结构和组成的细胞类型特异性变化。检测这些变化可为定义干细胞特性及细胞分化的机制提供重要见解。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有价值的手段，可用于解析干细胞分化背后的分子机制。...

人类胚胎干细胞的染色质免疫沉淀

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。...

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

我们描述了染色质内源性切割联合高通量测序技术（ChEC-seq），这是一种与染色质免疫沉淀（ChIP）正交的方法，利用微球菌核酸酶（MNase）融合蛋白在全基因组范围内定位蛋白质结合位点。...

全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库构建方案，用于从稀有鸡胚样本中生成全基因组表观基因组谱图。...

低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

染色质环境的调控是实现基因正常表达所必需的重要过程。本文中，我们描述了一种通过在特定基因位点可逆性地招募染色质修饰机器来控制基因表达的方法。...

利用化学表观遗传修饰剂重定向细胞机制以抑制基因转录

该方法旨在追踪细胞系中由PRC2介导的染色质结构域的形成过程，并且可适用于许多其他系统。...

一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

本方案重点介绍从速冻组织中制备染色质的方法，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）后续进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或高通量测序（X-ChIP-seq）。...

从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

本文介绍了一种用于分析组蛋白修饰全基因组分布的实验方案，该方法可鉴定稻瘟病菌及其他丝状真菌致病过程中的新靶基因。...

使用染色质免疫沉淀测序方法对中国稻瘟菌Magnaporthe oryzae进行全基因组组蛋白修饰分布分析

本方案介绍了一种基于位点特异性重组的基因座特异性染色质分离方法，用于从酿酒酵母（Saccharomyces...

单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

学习从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中进行组蛋白修饰的染色质免疫沉淀技术。该方法可用于分析基因组中组蛋白翻译后修饰的丰度与定位，揭示基因表达调控机制。

组蛋白修饰的染色质免疫沉淀（ChIP）实验——以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为材料

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