组蛋白修饰的染色质免疫沉淀（ChIP）实验——以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为材料

本染色质免疫沉淀实验方案的总体目标是确定组蛋白修饰在芽殖酵母基因组各个特定区域的丰度和定位。该方法有助于解答染色质调控中的关键问题，例如组蛋白修饰如何与基因表达调控相关联，以及这些修饰如何响应不同环境条件而发生变化。该方案具有高度通用性，可同时用于研究多种不同的组蛋白修饰及多个酵母菌株。

尽管该方法可用于研究组蛋白修饰，但也可通过使用表位标签或现有抗体来研究其他染色质结合蛋白。首先接种酵母细胞：在新试管中，向10毫升YPD培养基中接种各适当菌株的单个菌落，并在30摄氏度、220 rpm条件下于摇床中过夜培养。次日，测定培养物在600纳米处的光密度（OD600），然后将培养物用新烧瓶中的100 mL YPD培养基稀释至OD600为0.2。

将细胞在30 °C、220 rpm的摇床培养箱中培养至对数生长中期。当培养物达到对数生长中期时，向每瓶培养基中直接加入2.7 mL的37%甲醛，使甲醛终浓度为1%。将培养瓶转移至室温下的摇床，以50 rpm振荡15分钟。

向培养基中加入5毫升2.5摩尔的甘氨酸，并在室温下以50转/分钟继续振荡5分钟，以淬灭甲醛。随后，离心收集细胞，并按照文本方案中所述进行洗涤。最后一次离心后弃去上清液，继续进行酵母裂解液的制备。

将细胞重悬于含有1毫摩尔PMSF和1:1000稀释的酵母蛋白酶抑制剂混合液的1毫升冷染色质免疫沉淀或ChIP裂解缓冲液中。将悬液转移至含有200微升玻璃珠的2.0毫升螺旋盖管中。将细胞置于珠磨仪中，在4摄氏度下进行高速振荡处理。

珠磨30秒，冰浴1分钟。总共进行六次珠磨，每次30秒的珠磨后，将细胞在冰上放置至少1分钟。使用加样枪头将裂解液转移至1.5毫升离心管中。

在4 °C条件下，以15,500 ×g离心裂解液20分钟。弃去上清液，将沉淀物用250 µL微球菌核酸酶消化缓冲液轻轻吹打重悬。向每管反应体系中加入2.5 µL微球菌核酸酶。

轻轻翻转混匀4至6次，立即在37摄氏度水浴中孵育20分钟。20分钟后，将离心管置于冰上以终止反应，加入5毫升0.5摩尔EDTA，使EDTA终浓度为10毫摩尔，再轻轻翻转混匀。在4摄氏度下以15,500 ×g离心15分钟。

然后，将每份上清液转移至新的1.5毫升离心管中。为了获得最一致的结果，关键是要确保每次氨基酸沉淀反应中所用的蛋白浓度相同。根据氨基酸沉淀或免疫沉淀（IP）反应的数量，配制微球菌核酸酶释放的染色质组分与ChIP裂解缓冲液的主混合液，并将含有50微克总蛋白的1毫升混合液分装至各个独立的离心管中。

从每个免疫沉淀混合物中取出 100 微升用于制备输入样品。将输入样品在 -20 摄氏度下冷冻，以备后续使用。同时，确保每次免疫沉淀所用的与抗体结合的磁珠量保持一致也非常重要。

使用宽口移液器吸头，向每个免疫沉淀（IP）样品中加入20微升预先与抗体结合的磁性蛋白AG微珠。在4°C、8 rpm条件下旋转孵育样品3小时。免疫沉淀完成后，将离心管置于磁力架上，使微珠吸附至管壁一侧。

使用移液器吸除上清液。向珠子中加入1毫升ChIP裂解缓冲液，在4°C、8 rpm条件下旋转孵育5分钟。然后将离心管置于磁力架上，吸除上清液。

以这种方式，用以下缓冲液按指定次数依次洗涤磁珠：ChIP 裂解缓冲液、高盐洗涤缓冲液、LiCl/去污剂洗涤缓冲液和 TE 缓冲液。最后一次使用 TE 洗涤时，先用 0.5 毫升 TE 将大部分磁珠转移至新管中，再用另外 0.5 毫升 TE 洗涤原管并将剩余磁珠转移。向每根管中加入 250 微升新鲜配制的 ChIP 洗脱缓冲液，并短暂涡旋混匀。

在室温下以每分钟8转的速度旋转样品15分钟。将离心管置于磁力架上。小心地将上清液转移至新的离心管中，避免触碰磁珠。

向珠子中再加入 250 微升 ChIP 洗脱缓冲液。在室温下以 8 rpm 的速度旋转样品 15 分钟。小心地转移上清液至含有第一次洗脱液的管中，注意不要扰动珠子。

解冻先前收集的输入样品，向每个输入样品中加入400微升ChIP洗脱缓冲液。为逆转蛋白质与DNA的交联，向输入样品和免疫沉淀样品中分别加入20微升5摩尔的氯化钠、5微升糖原和12.5微升蛋白酶K。通过轻轻颠倒或弹击离心管充分混匀。将样品置于65摄氏度水浴中过夜孵育。

开始此实验步骤时，为每对引物配制QPCR预混液，将适量的QPCR混合液、正向引物和反向引物混合均匀。为每个DNA样本配制DNA预混液，每反应包含0.5微升DNA和4.0微升无核酸酶水。向384孔QPCR板的每个孔中加入5.5微升相应的引物预混液。在室温下以200 × g离心1分钟。

然后，向每个孔中加入4.5 µL的相应DNA预混液。密封反应板，在室温下以200 ×g离心1分钟。使用实时定量PCR系统进行定量PCR扩增，反应条件如下：95 °C预变性3分钟；进行40个循环，每个循环为95 °C变性10秒，55 °C退火30秒；最后进行熔解曲线分析，从65 °C升至95 °C，每步升高0.5 °C并维持5秒。

该实验方案的一个关键步骤是优化微球菌核酸酶的浓度，以将染色质消化成可溶性片段。此例为在染色质沉淀物中使用不同量的微球菌核酸酶消化后，对分离的DNA进行琼脂糖凝胶电泳所得到的结果，显示每微升20单位的酶用量为2.5微升时，主要产生单核小体。该代表性ChIP实验在野生型和set1基因敲除细胞中使用了针对组蛋白甲基化标记H3K4me2和组蛋白H3的抗体。

Set1 敲除细胞缺乏催化该修饰的甲基转移酶。柱状图表示在指定低科学性区域 H3K4me2 的相对富集程度。野生型菌株在已知为 Set1 直接靶基因的 PMA1 和 ERG11 两个基因的 5' 端显示出明显的 H3K4me2 富集，而在 Set1 敲除细胞中未观察到信号。正如预期，TEL07L 位点没有 H3K4me2 修饰的富集；SPR3 的表达也曾被报道受 Set1 调控，但这些结果表明其调控机制可能不同于 PMA1 或 ERG11。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在四天内完成。在进行该实验时，重要的是要牢记使用适当的对照，仔细验证所用抗体的特异性。如果条件允许，应在定量PCR（QPCR）中同时检测阳性对照区域和阴性对照区域。

在完成此操作后，还可进行其他方法，例如GP测序，以通过组蛋白修饰的分布来确定基因组。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过设计良好的对照实验，在独特的基因组区域一致地检测不同组蛋白修饰的水平。