Name: 环境毒物暴露大鼠下颌切牙釉质器官的显微解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习大鼠下颌切牙釉质器官的显微解剖技术，用于分离不同分化阶段的成釉细胞。该方法无需预处理即可进行免疫组化等定量实验，有助于研究氟斑牙等釉质病理机制。

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本工作由巴黎狄德罗大学、法国国家健康与医学研究院（INSERM）和法国牙科研究学院（IFRO）资助。

本研究中使用的所有动物均按照法国农业部关于实验动物护理和使用的指南（A-75-06-12）进行饲养和管理。
1. 动物接触毒物
<ol>
	<li>在执行本方案之前，需获得必要的机构批准，并确保遵守所有动物护理指南。</li>
	<li>设计研究方案时，应设立不同的实验组，以检测所研究分子对成釉细胞分泌期和成熟期的影响。本实验中，根据是否暴露于氟化钠（NaF）以及是否联合双酚A（BPA）处理，将雄性Wistar大鼠分为四组（图1A）2。所有动物均在第65天进行观察和解剖（图1B）。</li>
</ol>
2. 成年大鼠半下颌骨的解剖
<ol>
	<li>通过 CO2 窒息法处死大鼠，必要时可随后进行断头以将头部与身体其余部分分离。在专用容器中使大鼠暴露于 CO2 环境中持续 5 分钟16。</li>
	<li>使用 #11 手术刀去除下唇的所有皮肤，以便于充分暴露下门齿。</li>
	<li>使用同一手术刀，在两个下门齿之间施加轻微压力进行切口，下颌骨将随之分裂为两个半侧。</li>
	<li>用手术刀切断颞下颌关节以分离下颌，并用精细镊子夹持半侧下颌骨。</li>
	<li>用手术刀切断周围软组织，并使用刮匙去除所有肌肉、肌腱和韧带，直至骨骼完全清洁。</li>
</ol>
3. 切牙的分离17,18
<ol>
	<li>将刀片与切牙的主要长轴平行，从靠近切牙尖端（近中端）的骨嵴处开始，沿近中向远中方向小心地削去骨组织，直至靠近颈环的切牙末端。</li>
	<li>用解剖刀在颈环远中侧做第一道切口，以去除下颌支的下颌角，从而便于完整取出切牙，同时避免损伤颈环或成釉细胞的分泌期组织（见图2中的红线）。</li>
	<li>在第二磨牙下方做第二道切口，将解剖刀插入骨组织与切牙内侧面之间。当所有基底骨被剥离后，向外旋转切牙，并使用精细镊子小心取出，避免损伤釉器官组织。</li>
</ol>
4. 在双目镜下进行釉质器官的显微解剖
<ol>
	<li>使用移液器将 200 µL 磷酸盐缓冲液（PBS 1X）滴加到切牙上。用精细镊子夹取切牙，使唇面朝上。在组织的无色部分与橙色部分之间用手术刀做一标记。该标记对应于其下方之后可见的白点（图2）。</li>
	<li>使用挖匙或类似工具，从手术刀标记处向根尖端刮取细胞表面，以获取分泌期（无色）成釉细胞；从手术刀标记处向切牙尖端刮取，以获取成熟期（橙色）成釉细胞。</li>
	<li>去除对应于过渡期的 2 mm 组织，方法如前所述19。在分离釉器官时不要切开切牙，以避免间充质污染。</li>
	<li>按先前所述方法20，切除位于切牙根尖部分的颈环（图2）。</li>
	<li>将其收集至 10% 福尔马林或裂解液中，用于后续分析（见材料表）。</li>
</ol>
5. 分离釉质器官组织的收集以用于进一步研究
<ol>
	<li>在切牙上滴加 200 µL 1× PBS 缓冲液。</li>
	<li>使用#11手术刀刀片，在缓冲液中借助先前做好的刀片标记，逐阶段小心地将牙上皮细胞逐步分离。</li>
	<li>用于细胞RNA和蛋白质提取时，将组织置于可同时提取蛋白质和RNA的裂解液中（参见 材料表). 
	注意：通过在管中转动组织研磨器来制备高质量RNA，然后研磨细胞直至获得均一的混合物。该混合物可用于后续RNA和蛋白质提取，具体操作按照制造商此前已描述的说明书进行2,8,17通常，每次制备可获得约 5–10 µg 总 RNA 和 150 µg 总蛋白。</li>
	<li>用于组织学分析、免疫组织化学（IHC）和 原位 原位杂交（ISH），将细胞层置于10%福尔马林中固定2小时，随后在4 °C下保存于1×PBS中。组织可包埋于石蜡或OCT包埋剂中，用于制备石蜡切片或冷冻切片。</li>
	<li>对于EMP提取，使用精细镊子夹取切牙。短时间暴露于空气中（轻微脱水）后，切牙唇面中段将出现可见的白色斑点，该斑点代表釉质矿化的起始位置。此白色斑点对应成釉细胞的过渡期/早期成熟阶段，可作为提取EMP的参考标志。21.</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

成釉细胞活性改变和（或）成釉细胞增殖、分化及成熟过程受阻可导致不可逆的釉质缺陷；反过来，对釉质缺陷的表征有助于理解成釉发生过程中异常的成釉细胞活性。因此，无论病因是环境因素还是遗传因素，对分离釉质器官的研究对于阐明导致釉质缺陷的病理事件至关重要。
该技术最初由 Hiller et al.17 和 Robinson et al.18 描述，用于展示对成釉器分化各阶段的特定影响。此后该技术被改进用于 EMP 提取19,24,25。目前我们采用此方法分离成釉器的主要部分，并在不同环境条件下收集生物样本，以通过定性和定量技术分析 RNA 及蛋白质（包括细胞内外蛋白质）。
显微解剖的精确性在应用前需要经过大量的训练，以确保...

许多发育性釉质缺陷可能由暴露于环境毒物和/或不适当的生活方式引起1,2,3,4。利用本文所述方法对影响成釉作用的干扰事件及分子机制进行表征，将有助于将由此产生的釉质缺陷作为早期暴露于多种毒物的生物标志物，并可能帮助重建每位患者在釉质合成期间（即围产期）的健康史1,2。根据成釉细胞的活动，釉质合成可分为四个主要阶段5。第一阶段包括前体细胞和前成釉细胞的增殖。第二阶段中，已分化的成釉细胞分泌釉基质蛋白（EMPs），主要包括釉原蛋白、釉蛋白和成釉蛋白，这些蛋白决定了最终釉质的厚度。因此，任何对EMPs合成的干扰都会导致釉质的数量缺陷。在完成全层釉质沉积后，进入成熟阶段。在此阶段，羟基磷灰石晶体在宽度和厚度方向上的生长使釉质达到生物组织中最高的矿化程度，按重量计可达96%。成熟阶段发生的干扰事件会导致釉质的质量缺陷。最后，成釉细胞进入后成熟阶段（在啮齿类动物中也称为着色阶段），并在牙齿萌出过程中发生凋亡，使得釉质缺陷（如果存在）无法修复且不可逆，因此这些缺陷可作为成釉细胞应激的潜在回溯性记录。在啮齿类动物中，成釉过程遵循类似的事件序列，其特点是门齿持续生长，这使其成为研究成釉作用一般机制的合适模型。因此，任何对成釉作用的干扰都会导致釉质质量 和/或 数量的改变，具体表现取决于干扰事件发生的时间窗口。已有研究表明，暴露于二噁英、铅以及内分泌干扰物（EDCs）如双酚A（BPA）、染料木黄酮和乙烯菌核利等，均可引起釉质低矿化1,2,3,6,7,8。在胎儿期及出生后第一个月暴露于低剂量BPA的大鼠门齿上，已观察到不对称的白色不透明斑点1。这些大鼠的釉质缺陷与人类磨牙-门齿低矿化症（MIH）具有相似的临床、结构和生化特征。MIH是一种近期被描述的牙釉质病理状态，尽管已有多种病因因素被提出假设9,10,11,12，但其确切病因至今仍不明确9,10。
另一种由环境因素引起的重要的釉质低矿化病理是氟斑牙（DF），其成因是过量摄入氟化物（&#62;0.1 mg/kg/天）13,14。氟化物的主要来源是经过人工添加或天然富含氟化物的饮用水。氟化物也常被用于预防龋齿，但其预防剂量仅比中毒剂量低50%（≤0.05 mg/kg/天）。釉质发育不全（MIH）和氟斑牙（DF）是两种由环境因素暴露引起的常见病理，可能表现出共同的特征，需要加以明确，因为氟化物的低矿化效应可能与其他毒物（如环境内分泌干扰物2或阿莫西林15）产生协同增强作用。
对处于不同分化阶段成釉细胞的牙釉质器官进行显微解剖，将有助于理解能够干扰成釉细胞活性并在牙齿萌出后导致釉质缺陷的分子作用机制。换句话说，表征环境毒物引起的釉质基因表达变化及釉质基质成分改变，可重建机体暴露于毒物的历史记录，从而促进公共卫生领域的环境安全监测。

<table><tbody><tr><td>双酚A</td><td>Sigma Aldrich, Saint Louis MO</td><td>239658</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>HT5012</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Reagent</td><td>Euromedex, France</td><td>TR118</td><td></td></tr><tr><td>RLT缓冲液</td><td>Qiagen, Les Ulis, France</td><td>74126</td><td>RNeasy Protect Mini Kit</td></tr><tr><td>雄激素受体抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)</td><td>sc-816</td><td>兔多克隆抗体</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>EUOMEDEX</td><td>ET330.A</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠 (NaF)</td><td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO</td><td>S-1504</td><td></td></tr><tr><td>常规石蜡</td><td>Leica microsystems, Nanterre cedex,&amp;nbsp;France</td><td>39601006</td><td>文中称为石蜡/石蜡包埋剂</td></tr><tr><td>组织OCT包埋剂</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>411243</td><td></td></tr><tr><td>超细邦氏剪刀 - 直头/8.5 cm</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 - 12.5 cm</td><td>PHYMEP, Paris, France</td><td>10035-12</td><td></td></tr><tr><td>弯头手术刀片</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>10035-20</td><td></td></tr><tr><td>解剖刀 - 细头/直头</td><td>PHYMEP , Paris, France</td><td>10055-12</td><td></td></tr><tr><td>环形刀</td><td>PHYMEP, Paris, France</td><td>10059-15</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片编号&amp;deg;11 Swann-Morton</td><td>VWR, Fontenay-sous-Bois, France</td><td>233-0024</td><td></td></tr><tr><td>双目显微镜物镜</td><td>Leica biosystems, Nanterre cedex,&amp;nbsp;France</td><td>MZFLIII</td><td></td></tr></tbody></table>

环境毒物暴露大鼠下颌门齿釉器官的显微解剖

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

由环境因素和生活方式导致的釉质缺陷因其高发率而成为公共卫生关注的问题。这些缺陷源于负责釉质合成的成釉细胞（ameloblasts）功能异常，这些细胞位于釉质器官中。在釉质形成过程中，成釉细胞经历一系列特定且精确的事件，包括增殖、分化和凋亡。大鼠持续生长的门齿是研究生理和病理条件下成釉细胞活性及分化阶段的合适实验模型。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖暴露于环境毒物的大鼠釉质器官。显微解剖获得的牙源性上皮包含处于分泌期和成熟期的成釉细胞，可用于免疫组织化学等定性实验， 原位 杂交，以及用于RT-qPCR、RNA-seq和Western印迹等定量分析。

许多釉质缺陷，例如氟斑牙12,13，可能是由于过量吸收氟化物引起的环境因素所致，或由于暴露于某些内分泌干扰物（EDCs）而导致类似于MIH的釉质低矿化1,7,22。这些发育性釉质缺陷可在大鼠中通过实验复制（图1）1,2,7,23,24。大鼠的半下颌包含一颗门齿，该门齿与三颗磨牙之间由一个称为...

理解釉质形成及其可能的改变需要研究成釉细胞的活性。本文介绍一种可靠且一致的方法，用于显微解剖包含分泌期和成熟期成釉细胞的釉质器官，该方法可用于后续的定量与定性实验操作。

由环境因素和生活方式导致的釉质缺陷因其高发率而成为公共卫生关注的问题。这些缺陷导致……

本实验的总体目标是对大鼠釉质器官进行显微解剖，并根据釉质合成过程中细胞分化的不同主要阶段分离出牙源性上皮组织。该方法有助于解答釉质病理学领域的关键问题，例如氟斑牙、磨牙切牙高矿化症以及遗传性釉质发育不全。该技术的主要优势在于，无需任何预处理即可对牙源性细胞进行定量实验分析，如免疫组织化学检测，以及后续相关研究。尽管该方法可为内源性和外源性分子干扰成釉作用的分子机制提供深入见解。处死实验大鼠后，使用11号手术刀去除下唇的所有皮肤，以便于暴露下门齿。然后，用同一把手术刀在两个下门齿之间做一切口。轻轻施加压力后，下颌骨将分裂为两半。接下来，用手术刀切断颞下颌关节，同时用精细镊子夹住半侧下颌骨以分离下颌。然后用手术刀切断周围的软组织，并用刮匙去除所有肌肉、肌腱和韧带，直至骨骼完全干净。为分离门齿，需将刀片平行于门齿的主要长轴方向，小心地削去骨骼。从切牙尖端附近的骨嵴开始削切，向切牙的另一端即颈环方向进行。接着，用手术刀在颈环远端做一切口，以去除下颌骨半侧的下颌角，从而在不损伤颈环或成釉细胞分泌期的情况下，便于取出切牙。然后，在第二磨牙下方做第二个切口，并将手术刀插入骨与切牙内侧面之间。当所有基底骨被抬起后，将切牙向外旋转，并使用精细镊子小心取出，以避免损伤釉质器官组织。此时切牙已完全分离。进行解剖时，在60毫米培养皿或培养板中加入200 µL PBS覆盖切牙。首先，如前所述，剪开位于门齿顶端部分的颈环。然后用精细镊子夹住门齿，使唇面朝上，并在组织无色部分的末端用手术刀做一个标记。该标记对应于后续可观察到的下方白色斑点。现在，使用挖掘机或等效工具从标记处刮取细胞表面至顶端，该区域对应无色的分泌期成釉细胞。接着，在橙色部分起始处用手术刀做一标记，该区域对应成熟期成釉细胞，并从手术刀标记处刮取至切牙尖端。现在去除对应过渡期成釉细胞的两毫米组织。在釉质器官解剖过程中切勿切开切牙，以免间充质污染所分离的组织。最后，将组织保存于10%甲醛溶液或裂解液中以供进一步分析。如需提取釉基质蛋白，可将切牙短暂从溶液中取出，直至唇面中段出现白色斑点为止。该区域代表釉质矿化的起始位置，对应于早期成釉细胞的转变。切除该部分组织，并根据需要进行处理。若所移除的组织用于细胞RNA和蛋白质提取，请使用商业试剂盒进行提取。将取出的组织转移至裂解液中，并研磨成均匀的混合物。用于组织学分析、免疫组织化学以及NC2杂交时，将收集的组织置于10%福尔马林中，在室温下固定两小时。随后将组织转移至PBS中，并在4摄氏度下保存。随后可将组织包埋于石蜡或OCT包埋剂中。根据是否暴露于氟化物以及是否联合双酚A（BPA）处理，将雄性白尾大鼠分为四组。所有动物均于第65天按所述方法进行观察和解剖。使用三色马松染色法检测显微解剖获得的釉质组织的质量。显微镜观察显示典型的釉质上皮细胞和成釉细胞的凋亡。通过未见胶原呈绿色染色，证实无间充质污染。分泌期成釉细胞表达釉原蛋白（enameline）。成熟期成釉细胞表达kalikine four，并含有高水平的角蛋白（pheratin），使其能够储存大量铁，从而导致釉质呈现橙色。这些RNA在成釉细胞中的表达水平显著高于间充质细胞。另一方面，I型胶原由间充质细胞表达，而非成釉细胞。随后采用免疫组织化学方法对分泌期或成熟期成釉细胞中的四种特定蛋白质进行评分。例如，雄激素受体（绿色显示）特异性地定位于成熟期成釉细胞。观看本视频后，您应能充分理解如何对啮齿类动物的釉质器官进行显微解剖，以成功分离分泌期和成熟期的成釉细胞。该方法对于阐明体内关键因子在生理及病理状态下釉质疾病中的作用机制非常有用。

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环境毒物暴露大鼠下颌切牙釉质器官的显微解剖

不断生长的小鼠门齿为研究牙源性上皮干细胞（DESCs）再生牙体组织提供了模型。建立一种稳定、可靠地从小鼠门齿中分离并扩增这些细胞的系统 体外...

从小鼠成年门齿中分离与培养牙源性上皮干细胞

本文介绍了一种在小鼠中局部诱导根尖周炎的实验方案。我们展示了如何在小鼠牙齿上钻孔并暴露其牙髓，以引发局部炎症。同时演示了用于研究该炎症性质的分析方法，如显微CT和组织学分析。...

在小鼠中诱导根尖周炎

Trowell型器官培养方法已被用于解析调控牙齿发育的复杂信号网络，最近还被用于研究小鼠不断生长的门齿中干细胞相关的调控机制。荧光报告动物模型和活体成像技术有助于对牙源性干细胞及其特定的微环境生态位进行深入分析。...

使用Trowell型器官培养研究牙源性干细胞的调控

本方案介绍了一种快速、高效且温和的方法，适用于从持续生长的小鼠门齿、小鼠磨牙以及人类牙齿中分离单细胞，以进行单细胞RNA测序分析。...

从小鼠和人类牙齿中快速分离单个细胞

小鼠门齿的干细胞微环境中含有宝贵的标记滞留细胞。我们建立了一种无偏倚检测和定量标记滞留细胞的新方法；本研究采用EdU标记，并在对下颌骨进行PEGASOS组织透明化处理后，结合三维重建技术进行分析。...

利用组织透明化后三维重建方法检测和定量小鼠门齿中的标记滞留细胞

离体活体成像是一种研究活体组织中细胞运动和相互作用动态过程的强大技术。本文介绍了一种利用双光子显微镜对培养的成年小鼠全门齿中的牙上皮细胞进行活体示踪的实验方案。...

使用 离体 活体成像技术研究小鼠牙齿更新过程中的细胞分裂与迁移

显微硬度是一种机械性能，也是评估硬组织病理生理学的有用参数。本文中，我们展示了一种标准化的显微硬度分析方案（包括样品制备、抛光、平整表面及压痕位点选择），用于啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿和牙槽骨的显微硬度检测，具体模型为氟斑牙和结扎诱导的牙周骨吸收。...

啮齿类动物口腔疾病模型中牙齿与牙槽骨的显微硬度测量

本实验方案旨在通过在牙龈表面局部应用不同分子量的荧光标记葡聚糖，对小鼠牙龈上皮屏障的完整性进行定量评估，提供一种标准化的方法。 体内，随后 离体 使用单光子显微成像系统进行成像。...

利用荧光示踪剂评估小鼠牙龈上皮屏障功能

实验动物研究在临床移植技术的发展中起着至关重要的作用。猪原位肝移植模型（OLTx）与人类生理条件高度相似，常用于临床导向的研究。以下方案包含了使用主动门腔静脉-颈静脉分流建立稳定猪 OLTx...

采用主动性门腔分流术的猪肝脏获取与原位移植技术

本文介绍了通过压力/容积分析法在不同心率下测量小鼠左心室功能的方法。...

在小鼠中进行心脏导管插入术以测量压力-容积关系：研究博特维奇效应

学习大鼠下颌切牙釉质器官的显微解剖技术，用于分离不同分化阶段的成釉细胞。该方法无需预处理即可进行免疫组化等定量实验，有助于研究氟斑牙等釉质病理机制。

环境毒物暴露大鼠下颌门齿釉器官的显微解剖

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