老年人刷膜的体外模型对视网膜色素上皮细胞的培养

该实验程序的总体目标是创建一种称为 Bruch 膜培养系统的离体细胞外基质，以观察 Bruch 膜对叠加视网膜色素上皮细胞的影响。这种方法可以帮助回答 AMD 病因学领域 RPE 亚生物学中的关键问题，例如老化的 Bruch 膜的变化是否会导致叠加的 RPE 细胞功能障碍。该技术的主要优点是它允许研究人员从不同年龄的人类供体眼中分离天然 Bruch 膜，并将其用于 RPE 细胞培养物中的蛋白质组学研究。

分离 Bruch 膜并制备对天然 Bruch 膜损伤最小的实际体内培养系统是一项挑战，但我将在本视频中向您展示如何作。首先，将一块 1.5 平方英寸的纱布浸泡在与 CO2 无关的 DMEM 中放入 100 毫米的培养皿中。然后将眼球装入纱布上。

接下来，使用手术刀片在角膜缘后 3 毫米处的巩膜上切开一个切口。然后，使用细刀片剪刀做一个全层切口，并在眼睛周围的任一方向圆周延伸切口。然后，去除并丢弃前段，包括角膜、晶状体和虹膜。

此外，丢弃玻璃体和视网膜。然后，使用涂有特氟龙的刮刀小心地将 RPE Bruch 膜脉络膜复合物从巩膜从外围剥离到视神经。这必须非常小心地进行，以免撕裂膜复合物。

现在，使用精细的手术剪刀在巩膜上做四个放射状切口并剥去巩膜。然后，从视神经上切下 Bruch 膜脉络膜外植体，并将该外植体转移到含有 0.02 摩尔氢氧化铵的 DPBS 中的 60 毫米培养皿中。要去除天然 RPE 细胞，请在室温下孵育该外植体 20 分钟。

孵育后，使用 DPBS 洗涤外植体 3 次，方法是用特氟龙涂层的镊子将视神经部位固定在 Bruch 膜上，同时在组织周围流动溶液。接下来，将外植体、层粘连蛋白面朝上漂浮在无二氧化碳的培养基中。在 Bruch 膜上做四个切口，然后将未层压的疏水性 65 微米厚的 PTFE 膜（孔径为 0.2 微米）转移到外植体上。

用基底层靠在 PTFE 膜上进行设置。去除培养皿中多余的液体，然后将组件转移到玻璃微量分析真空过滤器支架系统中，它应该位于烧结的玻璃支架上。接下来，在小心避免与基底层接触的同时，使用涂有特氟龙的镊子将脉络膜侧的卷曲边缘压平。

现在，在 DPBS 中液化 15 毫升 4% 琼脂糖并将其冷却至 37 摄氏度。然后，慢慢地将琼脂糖倒在外植体的脉络膜侧，同时轻轻吸力以保持其平坦。凝胶开始凝固后，将其与膜一起转移到冰上的 60 毫米培养皿中。

让凝胶凝固 2 到 3 分钟，然后剥下 PTFE 膜。接下来，将外植体浸入 DPBS 中，并将其储存在 4 摄氏度下，直到需要为止。当在衬有液体 4% 琼脂糖的 60 毫米培养皿上培养外植体时，使 Bruch 的膜面朝上。

当使用聚苯乙烯衬里的 96 孔板进行培养时，将凝胶包裹的 Bruch 膜外植体放在平坦的特氟龙片上，层粘连蛋白面朝上。然后，使用环钻，从外植体上切下 6 到 8 个 6 毫米的纽扣，并将组织纽扣转移到装有液体琼脂糖的孔中。首先，像以前一样将眼球设置在浸有 DPBS 的纱布上。

接下来，在虹膜-巩膜接触点（平面部）下方 5 毫米处做一个圆周切口，进入视网膜下间隙。丢弃内部段、玻璃体和视网膜。接下来，使用移液管，用 2 到 3 毫升冷 DPBS 清洗眼罩。

总共清洗眼罩 3 次。然后，要解离 RPE 细胞，用胰蛋白酶处理眼罩长达 10 分钟。然后，将胰蛋白酶消化的 RPE 细胞转移到 50 mL 试管中，为了淬灭反应，加入 25 mL含有 37 °C FBS 的培养基。

现在，将组织和溶液在 200 摄氏度下以 24 克离心 10 分钟。然后，将沉淀重悬于含 15% FBS 的 5 mL DMEM 完全培养基中。现在，对细胞进行计数，并将 15， 000 个活的 RPE 细胞放入 200 微升含有抗生素的无血清最低必需培养基中，放在 96 孔板中 Bruch 膜的每个按钮上。

将细胞培养至少 24 小时以进行贴壁。然后，轻轻更换培养基以加热完整的 DMEM，并继续培养细胞。使用该方案，可以通过在其上生长 RPE 细胞来研究衰老和患病的人 Bruch 膜。

通常，衰老的外植体会减少 RPE 细胞的重新附着。在老年人 Bruch 膜上培养的 RPE 细胞吞噬杆状外段的能力也较差，这是一项关键的 RPE 功能。使用微阵列，发现当老年人的细胞在 Bruch 膜上培养时，与在膜上培养的年轻个体细胞相比，RPE 细胞基因表达不同。

看完这个视频，你应该对如何从人类供体的眼睛中分离 Bruch 膜并制作可以培养 RPE 细胞的外植体有一个很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在大约三个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住不要用解剖工具触摸 Bruch 膜外植体的层粘连蛋白侧，以免损坏表面。

在此程序之后，可以进行其他方法，如 RPE 吞噬作用和 RPE 细胞基因表达研究，以回答其他问题，例如来自不同年龄供体或患有年龄相关性黄斑变性的供体的 Bruch 膜是否会影响叠加的 RPE 细胞功能。开发后，这项技术为年龄相关性黄斑变性领域的研究人员在 Bruch 膜离体模型系统中探索 AMD 的病因机制铺平了道路。