利用二维直接随机光学重建显微镜成像中间丝和微管

本方法的总体目标是从样品制备到图像采集与重建的各个环节，建立最优的实验条件，以实现对固定细胞中微管和中间丝进行二维双色D-STORM成像。该方法有助于表征致密且复杂的细胞骨架网络（如中间丝与微管）之间的物理相互作用。该技术的主要优势在于，能够观察到传统荧光显微镜无法分辨的细胞结构。

本方法的可视化演示至关重要，因为样品制备的控制以及robe-linking数据的获取对于限制人为假象的产生至关重要。按照文本方案培养U373细胞后，首先使用PBS洗涤细胞一次以进行固定。随后，移除PBS，并向每孔加入一毫升预热的提取固定液。

将细胞在室温下孵育60秒。然后移除溶液，并每孔加入1毫升用细胞骨架缓冲液新鲜配制并预热的4%PFA。将12孔板放回37摄氏度的培养箱中孵育10分钟。

然后去除PFA，每孔加入三毫升PBS。用PBS洗涤细胞两次。随后去除PBS，并加入新配制的、用PBS稀释的10毫摩尔的硼氢化钠，以淬灭戊二醛产生的自发荧光。

将细胞在室温下孵育七分钟，并将回收的硼氢化钠转移至指定容器中。使用 PBS 每次五分钟，清洗孔板三次。随后吸除 PBS，并加入含 5% BSA 的 PBS 溶液作为封闭液。

根据文本方案完成样本的免疫染色及缓冲液溶液的配制后，将含有标记细胞的盖玻片安装在磁性样品架上。加入成像缓冲液，完全填充样品腔。盖上盖片，并确保成像缓冲液与盖片之间无气泡存在。

使用无水乙醇清洁样品底部，并检查是否存在泄漏。如有必要，使用润滑脂妥善密封样品 holder。进行成像时，打开显微镜及图像采集软件。

根据文本方案设置采集参数，使用100倍NA 1.46物镜、1.6倍OptiVar镜片和TIRF UHP模式。创建647通道以成像用Alexa Fluor 647标记的波形蛋白丝。选择405 nm和642 nm激光线以及LP 655发射滤光片。

然后，创建一个555通道以成像标记了Alexa Fluor 555的微管。选择561、488和405纳米激光线用于激发荧光染料，并使用BP 570至650发射滤光片。接着，在物镜上滴加镜油，并将样品置于物镜上。

然后，选择“定位”选项卡并打开荧光灯的快门。找到焦平面，通过目镜观察待成像的细胞。接着使用操纵杆将细胞移至视野中央。

单击采集选项卡，返回采集模式。然后选择647通道，将642激光功率设置为0.2%，将405激光功率设置为其最小值。将曝光时间设置为50毫秒，增益设置为50。

然后选择连续采集模式以在屏幕上观察细胞。确保视野中至少有一个荧光微球。使用自动缩放模式显示图像，并调节焦距。

接下来，通过点击“snap”拍摄并保存一张波形蛋白网络的宽场落射荧光图像。为检查全内反射荧光（TIRF）照明情况，点击“TIRF”，按“continuous”键，调整采集参数以获得均匀的照明视野，然后按“snap”拍摄并保存图像。

选中555通道，取消选中647通道，并选择555通道。拍摄微管网络的落射荧光图像并保存。

然后采集TIRF图像并保存。现在，检查647通道，取消选中555通道，并选择647通道。

将增益设为零，曝光时间设为10毫秒。然后按下连续采集。将642纳米激光功率设为100%，以使大部分Alexa 647染料进入暗态。

一旦荧光染料开始闪烁，将曝光时间增加至15毫秒，增益调至300。使用范围指示模式检查单分子信号是否导致相机饱和（以红色显示为标志）。若出现饱和现象，应降低增益直至饱和消失。

在采集开始时，微珠将保持饱和状态。按下停止以终止对细胞的观察。展开在线处理工具，点击在线处理PALM，以在采集过程中可视化STORM图像。

峰值掩模大小设置为九，峰值强度与噪声比设置为六。现在，按下“开始采集”。在采集过程中，如有必要，重新对细胞进行聚焦。

调整曝光时间，并最终开启405纳米激光线，起始功率为0.001%，以保持荧光分子的中等密度，且单个分子之间的最小距离为一微米。确保重建图像下方直方图中的定位精度峰值居中在10纳米或更低。当定位数量超过一百万时，按下停止按钮以结束成像。

使用 CZI 格式保存 STORM 采集的原始数据。然后在通道工具中，勾选 555 通道，取消勾选 647 通道，并选择 555 通道。接着，按下连续采集按钮。

将曝光时间设置为30毫秒，增益设置为零。然后将488和561激光器均设为100%，以将Alexa 555染料泵入暗态。使用HILO照明模式。

当荧光染料耗尽后，按下停止按钮。将增益设为 250，并将 488 激光降低至 50%。使用范围指示器检查单个分子是否使相机饱和。如果出现饱和情况，则降低增益。

现在，按下开始采集。在采集过程中，逐步增加增益直至达到饱和极限。逐步增加405纳米激光功率以激活分子，并使视野中的分子密度达到中等水平。

当405纳米激光功率约为15%时，将488纳米激光功率降低至30%。随后，在逐步降低488纳米激光功率的同时提高405纳米激光功率，以保持分子闪烁尽可能快速且密度适中。488纳米激光线与561纳米激发激光以最大强度联用时，可同时提高荧光分子的开启和关闭速率，而405纳米激光线仅提高其开启速率。当定位数量达到500,000个或以上，或不再有分子闪烁时，停止数据采集。

然后以 CZI 格式保存 STORM 采集的原始数据。为了使用 PAL-Drift 工具进行图像重建，请选择基于模型的校正类型，并设置自动分段的最大尺寸为八。连续多次点击“应用”，直至漂移被校正。

这种基于模型的校正方法采用基于互相关分析的算法来校正漂移。使用 PAL 滤波工具，通过仅选择定位最精确的分子来优化 STORM 图像的外观。例如，将定位精度限制在 30 纳米以内，点扩散函数（PSF）限制在 120 至 180 纳米之间。

使用 PAL-Render 工具，采用 5 或 10 纳米的像素分辨率，并根据文本方案设置参数。选择“渲染自动高动态范围（HR）”，设定值为 95%，并选择“渲染自动 SWF 动态范围”，设定值为 90%。然后选择“最佳质量渲染”。

在处理选项卡的 PALM 菜单中，选择 PALM 转换。按下选择，然后应用。最后，将生成的图像保存为 LSM 格式，而非 CZI 格式。

该图展示了一个典型的D-STORM成像结果，其中波形蛋白丝通过Alexa 647进行免疫标记。与标准宽场显微镜所获得的图像相比，分辨率的提升清晰可见。本图中所示的荧光强度分布曲线表明，超分辨率显微成像能够分辨出波形蛋白束的精细结构。

D-STORM 的分辨率足以用于计数束中存在纤维的数量。图中显示的是波形蛋白和微管网络的双色 D-STORM 成像典型示例，二者分别用 Alexa 647 和 Alexa 555 进行免疫标记。高质量的波形蛋白图像每平方微米应至少有 5,000 个定位点，微管图像每平方微米应至少有 2,500 个定位点。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在三天内完成。在进行此实验时，重要的是要根据待成像的蛋白质调整固定和参数化方法。例如，仅使用戊二醛进行固定对中间丝的成像效果较差，但最适合微管的固定。

务必记住使用新制备的样品和溶液，尤其是MEA，其pH值需要仔细调节。该技术发展之后，为细胞生物学领域的研究人员探索纳米级细胞结构的形态开辟了道路。观看本视频后，您应能充分掌握如何进行样品制备、图像采集，以及中间纤维和微管的二维双色D-STORM图像的重建。

请注意，操作某些溶液（特别是PFA和NABH4）时可能具有极高危险性，因此在进行本实验操作时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套、在通风橱内操作，并使用专用废弃物容器。