从甘蓝型油菜中提取3页蛋白质和核糖配合物的韧皮部汁液

该 3D-PAGE 程序的总体目标是从 Brassica napus ploem 汁液中分离蛋白质和核糖核蛋白复合物，同时鉴定相应的核酸和蛋白质成分。这种方法可以帮助回答生物化学和植物生理学中的关键问题。例如，您可以分析应力下韧皮部复合物的组成。

该技术的主要优点是可以收集纯韧皮部汁液，并且可以同时分析核酸和蛋白质成分。虽然这种方法可以深入了解油菜韧皮部系统内的蛋白质、蛋白质和蛋白质核酸相互作用，但它也可以应用于其他植物的韧皮部分析，如葫芦、羽扇豆和丝兰。当我们试图确定特定韧皮部蛋白的蛋白质和 RNA 相互作用伴侣时，我们首先想到了这种方法。

首先，使用 0.8 毫米皮下注射针刺穿 8 周龄的 B.napus 植物的花序茎数次。刺穿同一株植物和其他植物上的其他几个花序茎，以获得足够的韧皮部汁液。用滤纸擦去每个受伤部位的第一滴。

去除第一滴后，使用移液管收集剩余的液滴。并将它们转移到预冷的锥形 1.5 毫升反应管中。然后使用无冰冷却系统将收集的渗出液储存在零下 20 摄氏度。

继续收集液滴，直到没有观察到进一步的液滴形成，但不要超过一小时。接下来，将韧皮部样品加入分子量为 10， 000 道尔顿的离心浓缩器中，并浓缩至初始体积的约 1/6。然后，将浓缩样品在 4 摄氏度和 20， 000 g 下离心至少 15 分钟，以去除灰尘颗粒。

要执行蓝色非变性 PAGE，请组装凝胶室。并向一半加入深蓝色阴极缓冲液 B，并用阴极缓冲液洗涤孔。将每孔 20 至 30 μg 浓缩蛋白质样品至少一式三份加载到市售 Bis-Tris 辐射凝胶上。

用阴极和阳极缓冲液填充腔室，并在 4 摄氏度和 150 伏电压下运行凝胶，直到样品通过凝胶的 1/3，这需要 20 到 30 分钟。暂停运行，用浅蓝色阴极缓冲液 B 1/10 交换深蓝色阴极缓冲液 B。重新开始电泳并继续，直到蓝色前沿开始从凝胶中洗脱出来，这需要 120 到 180 分钟。

从天然蓝色凝胶上切下一整条凝胶泳道，然后通过半干印迹转印到尼龙膜上，并用铅笔在膜上标记凝胶的上下边界。印迹后，用 DEPC 处理过的水清洗膜，并放在两张滤纸之间晾干。在此之后，以每平方厘米 120， 000 微焦耳的外加能量对印迹膜进行紫外线交联。

现在，将 UV 交联膜与 6 mL 杂交缓冲液在 68 °C 下在杂交炉中预杂交 60 分钟。向膜上再添加 1 毫升含有 4 微升 3-引物生物素化探针的杂交缓冲液。然后，将膜与探针一起孵育过夜，同时将杂交炉从 68 至 37 摄氏度冷却。

第二天，在室温下用含有 2x SSC 和 0.1% SDS 的缓冲液洗涤膜 5 分钟，以去除非特异性结合的探针。使用链霉亲和素 HRP 偶联物和鲁米诺作为辣根过氧化物酶底物，在膜上检测 3-引物生物素化探针，从而产生灵敏的化学发光反应。从蓝色天然凝胶中切除单条带。

将 1.5 mL 锥形反应管中平行泳道中运行的样品条带合并，以进一步浓缩复杂蛋白质。要制备 12%Tris-Tricine 尿素凝胶，请将 10 毫升凝胶溶液 A 倒入两个玻璃板之间，并覆盖异丙醇。聚合后，去除异丙醇，向凝胶中加入 2 至 3 mL 凝胶溶液 B，然后插入 10 孔梳。

为了平衡切除的凝胶块，向反应管中加入 1 毫升 2x SDS 样品缓冲液。在室温下孵育样品 10 分钟后，在加热块中以 95 摄氏度加热约 1 分钟。然后将样品在室温下孵育 15 分钟。

在此之后，将代表相同复合物的几个平衡凝胶片段堆叠到一个凝胶口袋中。组装凝胶室后，使用 150 伏的阳极和阴极电泳缓冲液进行电泳 45 至 60 分钟。完成后，切除整个凝胶泳道。

将切割的凝胶泳道在酸性缓冲液中孵育 20 分钟。然后，在 pH 值为 6.8 的 125 毫摩尔 Tris-HCL 中再平衡 20 分钟。根据 lanely 倒入 15%SDS 分离凝胶溶液。

凝胶凝固后，去除异丙醇，加入 3 毫升 4% 浓缩凝胶溶液，然后插入 IPG 凝胶专用梳子。凝固后，将平衡凝胶泳道转移到 SDS 凝胶上，并在 1x SDS 电泳缓冲液中用 0.5% 琼脂糖覆盖凝胶，并补充有微量溴酚蓝。组装凝胶室后，在 150 伏电压下运行凝胶 60 分钟。

完成后，用胶体 Kumasi 溶液对凝胶进行染色，以进行后续的质谱分析。最后，使用基质辅助激光解吸电离飞行时间光谱法分析可见的蛋白质点。此处描述了从纯韧皮部样品中获得的代表性结果。

未受污染的韧皮部样品显示硫氧还蛋白年龄的可见条带，而未观察到 RuBisCO 和花粉外壳蛋白的信号。在甘蓝型油菜韧皮部汁液的 BN PAGE 后，至少有四个主要的蛋白质复合物条带变得可见。韧皮部汁液浓度过低或过高都不允许复合物的明确分离。

由于尿素和 SDS-PAGE 凝胶中的蛋白质迁移行为不同，因此在 3D PAGE 中观察到高分辨率分离。通常，属于单个复合物的蛋白质在凝胶上显示为对角线。高于该线的蛋白质具有更高的疏水性，而低于该线的蛋白质具有更强的亲水性。

BN Northern 印迹显示特异性 tRNA 仅存在于一种特异性复合物中。质谱分析表明，该复合物主要包含 tRNA 连接酶，证实了 BN Northern 印迹发现的 tRNA 结合活性。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三天内完成。

在尝试此程序时，请务必记住戴上手套和穿实验室外套，以尽量减少妨碍质谱分析的胡萝卜素污染。按照此程序，可以进行其他方法，如酶谱和酶测定，使用收集的韧皮部汁液来回答其他问题，如复合物活性和抑制研究。该技术开发后，为植物科学领域的研究人员探索不同植物物种韧皮部样品中的多亚基复合物铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何从甘蓝型油菜植物中分离韧皮部汁液，以及如何分离和分析蛋白质蛋白质和蛋白质核酸复合物有了很好的了解。不要忘记，使用 SDS、丙烯酰胺和 TMET 可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和穿实验室外套在引擎盖下工作。