Name: 从甘蓝型油菜中提取3页蛋白质和核糖配合物的韧皮部汁液 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 了解从甘蓝型油菜韧皮部汁液中分离蛋白质和核糖核蛋白复合物的3D-PAGE方法。该技术结合蓝色天然PAGE与变性电泳，可同时分析蛋白质与核酸组分，适用于多种植物的韧皮部生化研究。

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感谢 Jennifer Deke 和 Urszula Zarzenska 提供的科学支持。本工作获得了欧洲委员会第七个框架计划内职业整合资助（CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734）、汉堡州研究资助项目（Landesforschungsförderung Hamburg）LFF-GK06“DELIGRAH”以及德国研究基金会（DFG）资助项目（DFG KE 856_6-1）对 JK 的经费支持。

1. 从 B. napus 植物中采集和制备韧皮部汁液 4,8,20
<ol>
	<li>用于韧皮部汁液采样时，使用充分浇水的8周龄植株 B. napus 仅显示初期开花的植株，以防止花粉污染。</li>
	<li>使用皮下注射针头（Ø 0.8 mm）在花序茎上多次穿刺。在其他花序茎及其他植株上重复该操作，以获取足量韧皮部汁液（图2a). 
	注意：进行复杂分析时，建议起始使用至少 600 µL 的韧皮部汁液。4 至 5 株植物可获得 200 至 700 µL 的韧皮部汁液。</li>
	<li>用滤纸擦去损伤部位的首滴液体。这些液滴主要含有来自周围受损组织的高污染物质，应予以弃去。</li>
	<li>使用移液器收集以下液滴，并将收集的渗出液置于预冷的1.5 mL锥形反应管中，采用无冰冷却系统于-20 °C保存。</li>
	<li>继续收集，直至无法观察到液滴形成，但时间不超过1小时。该操作可在两天后重复进行，且所收集的韧皮部汁液无明显损失。 
	注意：收集的韧皮部汁液可立即使用，或于 -80 °C 保存以备后续分析。如需在 -80 °C 保存，应将反应管在液氮中迅速冷冻。</li>
	<li>将韧皮部样品浓缩至约1/6th 使用截留分子量（MWCO）为10,000道尔顿（Da）的离心浓缩装置，将初始体积浓缩至原体积的一部分。在4 °C、20,000 x g条件下离心浓缩后的样品至少15分钟，以去除灰尘颗粒。 
	注意：韧皮部汁液浓度不会导致蛋白质显著流失。</li>
	<li>对于后续的复合分析，请继续执行步骤 3.1。</li>
</ol>
2. 利用逆转录PCR（RT-PCR）控制韧皮部汁液纯度 4,8,20
<ol>
	<li>采用适用于液体材料的标准RNA提取方法，从韧皮部汁液中分离总RNA（例如 TRIzol 或苯酚-氯仿抽提，随后根据制造商方案从水相中用异丙醇沉淀并用乙醇洗涤。 
	注意：苯酚-氯仿具有毒性。操作时应在通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。提取的RNA可在-80 °C乙醇中保存长达六个月。</li>
	<li>用DNase I（1 U/µg）消化45分钟以去除DNA污染，反应条件为37 °C；随后加入EDTA至终浓度5 mM以灭活酶活性，并将样品在75 °C孵育10分钟。</li>
	<li>为获得高纯度RNA，需通过另一步纯化操作对样品进行纯化和浓缩（例如 根据制造商说明书，使用RNA纯化试剂盒进行操作。</li>
	<li>使用150 ng纯化RNA，按照cDNA合成试剂盒的制造商说明书进行逆转录PCR（RT-PCR）以合成cDNA。 
	注意：cDNA 可在 -20 °C 保存，以备后续使用。</li>
	<li>使用5 µL cDNA作为模板，按照制造商说明进行标准PCR反应，以扩增特定区室的转录本，并通过琼脂糖凝胶电泳检测。可通过使用核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基、硫氧还蛋白h和花粉包被蛋白的引物等方法验证韧皮部样品的纯度图1b, 表1).</li>
</ol>
3. 蓝色天然PAGE 4,25,26,31
<ol>
	<li>使用自行制备的天然梯度凝胶，具体方法见其他文献描述27 或商用 Bis-Tris 梯度凝胶。</li>
	<li>每孔上样20至30 µg浓缩蛋白样品，至少设三个重复。</li>
	<li>在4 °C、150 V条件下，使用深蓝色阴极缓冲液B和阳极缓冲液电泳运行凝胶表 2) 直至样品迁移至凝胶长度的1/3处rd 凝胶的约 20 至 30 分钟， 图3a). 
	注意：进行Northern印迹时，单个凝胶泳道已足够；而若需通过三维PAGE和质谱分析蛋白质组成，则建议合并最多十个凝胶泳道中相同位置的条带，以富集丰度较低的蛋白质。</li>
	<li>暂停运行，将深蓝色阴极缓冲液B更换为浅蓝色阴极缓冲液B/10（表2）并继续电泳。当蓝色前沿开始从凝胶中流出时，结束电泳。约 120 至 180 分钟， 图3a). 
	注意：制备好的蓝色天然凝胶可在 4 °C 下保存至少一周。长时间存放可能导致条带弥散，应避免。深蓝色缓冲液 B 可重复使用。</li>
</ol>
4. 可选：使用蓝色天然Northern印迹法检测RNA 4
<ol>
	<li>从蓝色天然凝胶中切下明显的条带或使用整个凝胶泳道，通过半干转印法以3.5 mA/cm²的电流密度转移至尼龙膜上2 60 分钟，并用铅笔在膜上标记上下胶的边界（图4a).</li>
	<li>转印后，用经DEPC处理的水洗涤膜，并夹在两张滤纸之间干燥。</li>
	<li>使用 120,000 µJ/cm² 的紫外线对印迹膜进行交联处理2 （如果使用交联仪，85 秒） 材料表).</li>
	<li>用6 mL杂交缓冲液（商品化或自制）在杂交炉中68 °C条件下预杂交膜60分钟图4a).</li>
	<li>加入1 mL杂交缓冲液，其中含有4 µL的3'-生物素标记探针（100 nM）。</li>
	<li>将膜与探针在烘箱中孵育过夜，同时将烘箱温度从 68 °C 逐渐冷却至 37 °C。</li>
	<li>用含有 2x SSC 和 0.1% SDS 的缓冲液在室温下洗涤膜 5 分钟，以去除非特异性结合的探针。 
	注意：SDS 可引起刺激。操作 SDS 及含 SDS 溶液时，请佩戴手套和实验服。</li>
	<li>在膜上检测3'-生物素标记的探针 例如 使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）偶联物及鲁米诺（luminol）作为辣根过氧化物酶（HRP）底物，产生灵敏的化学发光反应（图4a).</li>
</ol>
5. 第二维：Tris-Tricine-尿素PAGE 4,28
<ol>
	<li>从蓝色天然凝胶中切下单一条带。将平行泳道中样品的条带合并，以进一步浓缩复合蛋白（图5）。 
	注意：切下的条带可暂时保存在单个反应管中，4 °C 下备用。</li>
	<li>制备一块12% Tris-Tricine-尿素凝胶（厚度1 mm，尺寸为6.8 cm × 8.6 cm（宽×长））。配制10 mL 分离胶溶液A（表2），倒入两块玻璃板之间，并用异丙醇覆盖上层。待聚合完成后，吸去异丙醇，加入4 mL 浓缩胶溶液B（表2），插入10孔梳子。 
	注意：未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，TEMED 吸入后有害。操作时务必佩戴个人防护装备，并在通风橱内进行。</li>
	<li>将切下的凝胶条带转移至1.5 mL 反应管中，加入1 mL 2× SDS上样缓冲液，用于凝胶碎片的平衡（图5，表2）。
	<ol>
		<li>室温孵育10分钟，随后在加热块（95 °C）或微波炉中煮沸，再于室温继续孵育15分钟。</li>
		<li>将代表同一复合物的多个已平衡凝胶碎片叠加，装入同一凝胶孔中。</li>
		<li>使用阳极和阴极电泳缓冲液，在150 V条件下电泳45至60分钟，然后切下整条凝胶泳道。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切下的泳道先在酸性缓冲液（100 mM Tris，100 mM 乙酸）中孵育20分钟，再在125 mM Tris-HCl（pH 6.8）中平衡20分钟（图5）。</li>
</ol>
6. 第三维：SDS-PAGE 4,32
<ol>
	<li>根据 Laemmli32 方法配制 15% SDS 分离胶（厚度：1.5 mm，尺寸：6.8 cm × 8.6 cm（宽 × 长））（表 2），并在其上方加入一层薄薄的 4% 浓缩胶。 
	注意：SDS、丙烯酰胺和 TEMED 具有毒性和危害性。请在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。</li>
	<li>将平衡后的凝胶条转移至 SDS 凝胶上，并用含有微量溴酚蓝的 1× SDS 电泳缓冲液中配制的 0.5%（w/w）琼脂糖覆盖凝胶（图 5）。</li>
	<li>在上样前，将含琼脂糖的 SDS 电泳缓冲液在微波炉中煮沸。</li>
	<li>若需运行蛋白质 Marker 以估计各组分的分子量，可在凝胶一端插入一片滤纸，直至琼脂糖完全凝固，或使用通常用于 IPG 胶的专用梳子。</li>
	<li>以 150 V 恒压电泳 60 分钟，随后使用胶体考马斯亮蓝染色、银染或其他适用于后续质谱分析的染色方法对凝胶进行染色。</li>
	<li>采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）或液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等质谱技术分析可见的蛋白质点。 
	注意：我们推荐使用已报道的胶体考马斯亮蓝染色方法33。在我们的实验中，即使丰度较低的蛋白质也能得到充分染色，并可获得数据质量合理的质谱分析结果。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

韧皮部是一个备受关注的结构，因为它是光合同化物的主要运输通道，同时也对植物不同部位之间的长距离信号传递至关重要9,20,34,35。除了小分子外，蛋白质和RNA等大分子也被证实参与韧皮部的维持和信号传导过程4,7,8。由于大多数植物物种的韧皮部样本难以获取，对其成分的分析受到限制。昆虫口针法虽然应用广泛，但实验操作复杂，且获得的韧皮部样品量极微11。一种较为简便的韧皮部取样方法是EDTA促进的渗出法12。EDTA可螯合钙等二价离子，从而防止P蛋白和胼胝质堵塞筛板。该方法操作简便，但容易受到受损细胞污染，且样品被稀释。此外，EDTA对二价离子的去除可能导致原有复合物的解体。然而，该方法适用于包括模式植物A. thaliana在内的多种物种15。韧皮部汁液的自发渗出仅存在于少数植物物种中，且该方法具有侵入性，会造成植物组织的显著损伤10。我们近期已将B. napus确立为研究长距离运输的模式物种4,8,20。在此物种中，可通过微小切口采集韧皮部汁液，从而减少创伤效应和污染来源。
近年来，利用不同的取样技术，已对多种植物韧皮部样品的蛋白质组进行了研究7,8,17,36,37,38,39。在这些蛋白质组研究中，蛋白质是在变性条件下提取并沉淀的，因此无法推断在天然状态下存在的蛋白质:蛋白质以及蛋白质:核酸相互作用。共免疫沉淀（CoIP）和印迹结合实验表明，南瓜韧皮部汁液中可能存在一种主要的核糖核蛋白复合物40，但尚未证实韧皮部系统内天然条件下是否存在任何大分子复合物。
由 Schägger 等人等26提出的蓝色天然 PAGE（BN-PAGE）结合后续的高分辨率凝胶电泳步骤，能够实现对大型蛋白质复合物中各个组分的分离。我们近期通过对天然 B. napus 韧皮部渗出液进行 3D-PAGE 分析，证明了在韧皮部样品中存在多种高分子量的蛋白质:蛋白质及核糖核蛋白（RNP）复合物，并且具有酶活性4。尽管存在其他分离蛋白质复合物以及如 RNP 类复合物的方法，例如尺寸排阻色谱法，但在分辨率方面仍不及 BN-PAGE。此外，为了获得合理的复合物分离质量，尺寸排阻色谱柱的基质必须根据所研究复合物的总体分子量进行调整。因此，分析不同大小的复合物将需要不同类型的色谱柱，这成本较高，且无法达到 BN-PAGE 所具备的高聚焦能力。
分析来自 B. napus 的复合物的关键步骤包括用作起始材料的韧皮部汁液总量。至少需要 600 µL 的韧皮部样品，这些样品可从五株充分浇水的植株中获得。对于 3D-PAGE 和 BN 印迹杂交，必须使用足量的韧皮部样品开始最初的 BN 胶电泳。为此，需将韧皮部样品浓缩，直至每个加样孔可上样 20 至 30 µg 蛋白质，并且同一样品至少需设置三个平行重复。浓度过低或过高均会降低复合物的检测效果（图 3）。韧皮部样品需在冰上收集至离心管中，并应冷冻保存以备后续使用，以避免蛋白质降解和周转。所有已分析的韧皮部蛋白质组中均发现存在蛋白酶抑制剂，但也在 B. napus 的韧皮部中报道存在完全活性的蛋白酶体4。此外，韧皮部样品的体积和成分取决于采样时间点和环境条件10。因此，必须注意在每天相同时间、相似条件下进行采集。胁迫处理（例如 干旱）会减少可采集到的韧皮部汁液量。通过质谱鉴定单个蛋白质时，必须全程佩戴手套以最大限度减少角蛋白污染。角蛋白会在质谱分析过程中产生额外信号，干扰蛋白质的鉴定。以较高电压或在室温下运行 BN-PAGE 可能导致凝胶发热，从而引起脆弱复合物的解离。
本文介绍的方案适用于蛋白质：蛋白质复合物的分析。我们还表明，该方案可平行用于检测复合物中包含的特定RNA。为实现这一目标，我们近期引入了一种BN Northern印迹杂交方案4。RNA容易受到RNase污染的降解。为减少此类降解，应使用经DEPC处理的水。
该方法的主要局限性包括通过BN-PAGE分离的蛋白质复合物的分子量估算，因为其迁移行为取决于复合物的大小、形状，甚至翻译后修饰状态31,41由于核酸对迁移行为的影响，RNP复合物的大小估计更为复杂。同样无法避免的是，相同大小的复合物可能共迁移形成单一的条带，这可能导致对复合物组成的错误推断。因此，有必要利用互补的技术验证所观察到的相互作用， 例如 通过功能检测4, 可能是必要的。此外，仅微弱或瞬时结合于大分子复合物的蛋白质可能在所用的BN缓冲液中丢失。为避免此问题，可对样品进行交联处理，但这可能引入假象或阻碍蛋白质鉴定；或者可优化缓冲液条件。
与传统的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）不同，尿素-PAGE 与 SDS-PAGE 的结合可根据疏水性和分子量进行分离，而非等电点（pI）和分子量28，且不受限于特定 pI 范围的蛋白质分离。与传统二维电泳类似，分离后的蛋白质以单个斑点形式可见，但这些斑点分布于一条对角线上4,28（图5，图6）。疏水性更强的蛋白质出现在该对角线上方的斑点中，而亲水性更强的蛋白质则位于对角线下方28。本方案所使用的聚丙烯酰胺浓度可有效分离分子量在 25 至 80 kDa 之间的蛋白质。若需分离更小或更大的蛋白质，可在第三维中调整聚丙烯酰胺浓度或使用梯度凝胶。通过三维电泳（3D-PAGE）分离的复合物 IV 组分（图3，图6）被切下后进行胰蛋白酶消化，并通过质谱分析，结果鉴定出多种 tRNA 连接酶。其他复合物的组分最近已有报道4。我们的 3D-PAGE 技术实现了分子量相近的不同连接酶的分离，包括天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、赖氨酸和甘氨酸连接酶（表3）。利用甲硫氨酸 tRNA 特异性探针，我们能够检测到复合物 IV 中可能结合的 tRNA，但所用探针无法区分是全长 tRNA 还是 tRNA 片段存在于该复合物中。为验证核酸是否真正结合于复合物内部而非共迁移，可使用蛋白酶消化后的韧皮汁液样品作为合适的迁移对照。
早先有人推测，蛋白质翻译可能在韧皮部筛管内发生，因为在韧皮部样品中已检测到几乎完整的核糖体组分以及延伸因子4,7。我们发现的tRNA及tRNA连接酶似乎支持这一观点。然而，已在南瓜韧皮部样品中发现的tRNA片段被证实是翻译的强效抑制剂42，且功能性核糖体似乎并不存在4，这表明翻译过程可能无法进行。
综上所述，本文所展示的实验方案能够从韧皮部样品中分离天然的蛋白质-蛋白质复合物甚至核糖核蛋白（RNP）复合物，并以高分辨率分离和鉴定其各个组分。该方法的应用有助于在韧皮部样品中发现新的蛋白质和RNP复合物，从而揭示这一高度特化的植物区室中的新功能。

韧皮部的长距离输导组织对高等植物中有机养分的分配至关重要，同时也参与调控许多与生长发育、病原体防御以及对不利环境条件适应相关的重要过程。除了离子、植物激素或代谢物等小分子效应物外，蛋白质和RNA等大分子最近也被认为是潜在的信号分子。
研究表明，韧皮部对蛋白质的装载具有尺寸依赖性，由连接伴胞（CC）和筛管分子（SE）的胞间连丝单位的孔径排阻极限（SEL）所控制，通常范围在10至&#62;67 kDa1,2,3之间。然而，尽管存在这种尺寸限制，在韧皮部系统中仍发现有较大分子量的蛋白质及蛋白质复合物，这挑战了单纯的尺寸排阻理论4，甚至有研究提出蛋白质可能从伴胞非特异性地泄漏至筛管分子5。
多蛋白复合物以及大型核糖核蛋白复合物在生物合成及维持细胞结构完整性中发挥关键作用6。已有证据表明，韧皮部可移动的蛋白质-蛋白质复合物和核糖核蛋白复合物确实存在4,7，但迄今为止，关于其功能的信息仍十分有限。在韧皮部筛管分子中，蛋白质:蛋白质复合物及RNP复合物被认为参与长距离运输和/或信号传导8,9。为了揭示这些转移复合物的功能，需要在不同环境或胁迫条件下研究其组成。为此，必须分离天然状态下的复合物，并以足够分辨率将其组分分离开来。
为了分离韧皮部中的高分子量复合物，首先需要获得足够质量和数量的韧皮液样品。可用于采集韧皮液的技术取决于目标植物物种。目前存在三种主要获取韧皮液的方法10：昆虫口针切断法11、EDTA促进渗出法12和自发渗出法13。
Arabidopsis thaliana（A. thaliana）是全球实验室中主要的模式植物，其韧皮部样品只能通过EDTA辅助渗出法或蚜虫吻针切除法获得14,15。这两种方法均会导致韧皮部汁液高度稀释或样品量极低。此外，EDTA辅助渗出法容易受到污染，可能无法真实反映韧皮部的实际成分16。自发性韧皮部渗出仅限于葫芦科植物、羽扇豆或丝兰等植物种类，这些植物在被切断部分器官后会自发释放韧皮部汁液，便于收集13,17,18,19。我们近期已将油菜（Brassica napus）确立为适用于韧皮部分析的合适模式系统，因其与A. thaliana亲缘关系较近，且通过微小切口即可获得数微升高纯度的韧皮部汁液4,8,20。此外，B. napus的基因组序列已于2014年公布21。
除蚜虫吻针切断法外，所描述的所有韧皮部采集方法均会在取样部位造成周围组织的损伤，而韧皮部汁液的成分可能因损伤而发生变化。因此，无论采用何种取样方法，检查韧皮部样品的质量都至关重要。目前有多种用于采集的韧皮部汁液质量控制的方法，例如通过测定RNase活性22,23、使用针对Rubisco的引物进行RT-PCR8,24，或分析糖类组成8。
可采用多种方法分离和纯化蛋白质复合物，包括尺寸排阻色谱法、蔗糖密度超速离心法，或通过具有不同分子量截断值的膜对样品进行过滤。然而，这些方法的分辨率较低。由 Schägger et al. 首次描述的蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）技术25，在分辨率方面具有显著优势。该技术已成功用于测定来自不同细胞器或细胞裂解液中的大型天然蛋白质复合物的分子量及其相对丰度26,27。
为了进一步阐明蛋白质复合物的复杂组成，有必要在变性条件下分离其各个组分，从而实现复合物组分的完全解离。这可以通过第二维SDS-PAGE28,29实现；若需获得更高分辨率，则可采用第二维等电聚焦（IEF）分离，随后进行第三维SDS-PAGE30，并结合质谱技术对蛋白质进行鉴定。
在本实验方案中，我们描述了从 B. napus 植物中采集纯韧皮部汁液的方法，并利用结合了BN-PAGE、Tris-Tricine-尿素-PAGE和SDS-PAGE的三维电泳技术对这些韧皮部样品中的蛋白质复合物进行分析。分离后的蛋白质复合物组分随后通过质谱技术进行鉴定。此外，我们还引入了蓝色天然Northern印迹法，该方法可用于检测大型核糖核蛋白（RNP）复合物中的RNA4，从而拓展了该技术的应用范围。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 反应管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 10 孔梳，厚度 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（29:1）</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液（37.5:1）</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96% 乙醇</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铝-(14-18)-水合物</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>离心浓缩器 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Vivaspin 500（截留分子量 10 kDa）</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>化学发光核酸检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>层析纸 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 系统</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Plus DNA Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>加热块 TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; GFL 杂交培养箱 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头（0.8 mm）</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG 胶梳，厚度 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>RNA 标记 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Biotin 3'end DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>天然梯度胶 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Novex NativePAGE 4&amp;ndash;16% Bis-Tris 蛋白胶</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>尼龙膜 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>正磷酸</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>电泳仪电源（用于凝胶电泳 EPS）</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>可从 GE Healthcare 购得</td></tr><tr><td>RNA 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>半干转印仪 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Fastblot 43B 半干转印仪</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 合成 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠二水合物</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb 超高灵敏度杂交缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>来自 Fisher Scientific</td></tr><tr><td>垂直电泳装置 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; XCell SureLock Mini-Cell 或 Mini-Protean III 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific 或 BioRad</td><td>EI0001 或 1658004</td><td></td></tr><tr><td>擦拭纸 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; KIMWIPES Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

韧皮部汁液采样 brassica napus 用于蛋白质和核糖核蛋白复合物的三维聚丙烯酰胺凝胶电泳

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

对高等植物韧皮部进行取样通常费时费力，且在很大程度上依赖于植物种类。然而，在不同植物物种中，已可实现变性条件下的蛋白质组研究。尽管天然状态下的蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸复合物在韧皮部样本中可能在维持这一特化区室或长距离信号传导中发挥重要作用，但目前对此类复合物的分析仍极为有限。可利用蓝色天然凝胶电泳（BN-PAGE）分离大分子复合物，其蛋白质组分可通过后续的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进一步分离。然而，分子量相近的蛋白质会共迁移，这可能阻碍质谱鉴定蛋白质。将BN-PAGE与两种不同的变性凝胶电泳步骤——即Tris-Tricine-尿素电泳和SDS-PAGE相结合，可根据蛋白质的亲水性/疏水性实现额外分离，从而提高分辨率并提升质谱鉴定成功率。该方法甚至能够区分仅在翻译后修饰上存在差异的蛋白质。此外，还可应用蓝色天然Northern印迹法鉴定大分子复合物中的RNA组分。我们证明，本方案适用于解析韧皮部样本中天然存在的蛋白质-蛋白质复合物及核糖核蛋白（RNP）复合物中的蛋白质和RNA组分。将蓝色天然PAGE与两种不同的变性PAGE步骤结合，有助于分离多种大型蛋白质复合物，并提高其组分通过质谱鉴定的成功率。此外，该方案具有足够的稳健性，可同时检测单个蛋白质复合物中可能结合的核酸分子。

本文介绍了一种利用三维聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术分析油菜（B. napus）韧皮部渗出液中大型天然蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸复合物蛋白质组成的方法，该技术结合了蓝色天然电泳（BN）和两种变性PAGE，并随后进行质谱鉴定。

韧皮部汁液采样 Brassica napus 用于蛋白质和核糖核蛋白复合物的三维聚丙烯酰胺凝胶电泳

对高等植物韧皮部进行取样通常费力，且在很大程度上依赖于植物种类。然而，在变性条件下进行的蛋白质组学研究……

本3D-PAGE实验方法的总体目标是从油菜（Brassica napus）韧皮部汁液中分离蛋白质和核糖核蛋白复合物，并鉴定其中相应的核酸和蛋白质组分。该方法有助于解答生物化学和植物生理学领域的关键问题。例如，您可以分析在胁迫条件下韧皮部复合物的组成。该技术的主要优势在于能够收集纯净的韧皮部汁液，并可同时分析其中的核酸和蛋白质组分。尽管该方法可用于研究油菜韧皮部系统中蛋白质-蛋白质以及蛋白质-核酸之间的相互作用，但也同样适用于其他植物（如葫芦科植物、羽扇豆和丝兰属植物）的韧皮部分析。我们最初是在尝试鉴定特定韧皮部蛋白的蛋白质和RNA互作伙伴时，提出了该方法的设想。首先，使用0.8毫米的皮下注射针头对一株八周龄的甘蓝型油菜（B.napus）植株的花序茎进行多次穿刺。在同一植株及其他植株上穿刺多个花序茎，以获取足够的韧皮部汁液。用滤纸擦去每个受伤部位渗出的第一滴汁液。去除最初的液滴后，使用移液器收集剩余液滴，并将其转移至预冷的1.5毫升锥形离心管中。然后将收集的渗出液置于不含冰的冷却系统中，于-20摄氏度保存。 继续收集液滴，直至观察不到新的液滴形成，但收集时间不超过一小时。接着，将韧皮部样品加入截分子量为10,000道尔顿的离心浓缩管中，浓缩至初始体积的约1/6。然后，将浓缩后的样品在4°C、20,000 g条件下离心至少15分钟，以去除灰尘颗粒。进行蓝色天然PAGE时，组装凝胶电泳槽，在一侧加入深蓝色阴极缓冲液B，并用阴极缓冲液冲洗加样孔。每孔上样20至30微克浓缩的蛋白质样品，至少设置三个重复，上样至商用Bis-Tris凝胶中。向电泳槽中加入阴极和阳极缓冲液，在4摄氏度、150伏电压下电泳，直至样品迁移至凝胶的1/3处，约需20至30分钟。暂停电泳，将深蓝色阴极缓冲液B更换为浅蓝色阴极缓冲液B 1/10。重新启动电泳，并继续运行至蓝色前沿开始从凝胶中流出，约需120至180分钟。从天然蓝色凝胶中切下整条胶道，然后通过半干转印法将其转移至尼龙膜上，并用铅笔在膜上标记凝胶的上下边界。转印完成后，用经DEPC处理的水洗涤膜，然后将其夹在两张滤纸之间晾干。随后，对转印后的膜进行紫外交联，照射能量为120,000微焦耳/平方厘米。现在，将经紫外线交联的膜在杂交炉中，用6毫升杂交缓冲液于68摄氏度预杂交60分钟。向膜中加入额外的1毫升杂交缓冲液，其中含有4微升3'生物素标记的探针。然后，将膜与探针在杂交炉中孵育过夜，同时将杂交炉温度从68摄氏度逐渐冷却至37摄氏度。第二天，用含有 2x SSC 和 0.1% SDS 的缓冲液在室温下洗涤膜 5 分钟，以去除非特异性结合的探针。使用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin HRP conjugate）和鲁米诺（luminol）作为辣根过氧化物酶底物，对膜上的 3' 端生物素标记探针进行检测，产生高灵敏度的化学发光反应。从蓝色天然凝胶中切下单一的条带。将平行泳道中跑出的样品条带收集至一个1.5毫升锥形反应管中，以进一步浓缩复合蛋白。制备12% Tris-Tricine 尿素胶时，将10毫升胶溶液A注入两块玻璃板之间，再覆盖异丙醇。待聚合完成后，吸除异丙醇，加入2至3毫升胶溶液B，插入10孔梳子。为平衡切除的胶块，向反应管中加入一毫升 2x SDS 上样缓冲液。室温孵育样品 10 分钟后，在 95 摄氏度的加热块中加热约一分钟。然后将样品在室温下再孵育 15 分钟。随后，将代表同一复合物的多个已平衡的胶块堆叠至同一个胶孔中。组装好胶室后，使用阳极和阴极运行缓冲液，在150伏电压下电泳45至60分钟。完成后，切下整个胶条带。将切下的凝胶条带在酸性缓冲液中孵育 20 分钟。然后在 pH 6.8 的 125 毫摩尔 Tris-HCl 中平衡 20 分钟。按照上样孔的顺序倒入 15% SDS 分离胶溶液。待凝胶完全凝固后，去除异丙醇，加入3 mL 4%的浓缩胶溶液，并插入IPG胶专用的梳子。凝固后，将平衡好的胶条转移到SDS凝胶上，并用含有少量溴酚蓝的1× SDS电泳缓冲液配制的0.5%琼脂糖封顶。组装电泳槽后，在150伏电压下电泳60分钟。实验完成后，用胶体考马斯亮蓝溶液染色凝胶，以进行后续的质谱分析。最后，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法分析可见的蛋白质点。此处展示的是从纯韧皮部样品获得的代表性结果。无污染的韧皮部样品会显示出硫氧还蛋白 age 的可见条带，而未观察到 RuBisCO 和花粉包被蛋白的信号。经过油菜韧皮部汁液的 BN-PAGE 电泳后，至少可观察到四个主要的蛋白质复合物条带。韧皮部汁液浓度过低或过高均无法实现这些复合物的清晰分离。由于蛋白质在尿素凝胶和SDS-PAGE凝胶中迁移行为的不同，三维凝胶电泳（3D PAGE）可实现高分辨率分离。通常，属于同一复合物的蛋白质会在凝胶上呈现为一条对角线。位于该对角线上方的蛋白质疏水性更强，而位于对角线下方的蛋白质则更具亲水性。BN Northern 印迹显示，某种特定的 tRNA 仅存在于一个特定的复合物中。质谱分析表明，该复合物主要含有 tRNA 连接酶，这证实了 BN Northern 印迹所发现的 tRNA 结合活性。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三天内完成。在进行该实验操作时，务必记得佩戴手套和实验服，以尽量减少类胡萝卜素的污染，避免干扰质谱分析。完成该操作后，可进一步对收集的韧皮部汁液进行其他方法分析，例如酶谱分析和酶活性测定，以回答更多科学问题，如多亚基复合物的活性与抑制研究。该技术建立后，为植物科学领域的研究人员探索不同植物物种韧皮部样品中的多亚基复合物提供了重要途径。观看本视频后，您应能够充分理解如何从甘蓝型油菜（Brassica napus）植株中分离韧皮部汁液，以及如何分离和分析蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸复合物。请务必注意，SDS、丙烯酰胺和TMET具有极高危险性，在进行本实验操作时，必须采取防护措施，例如在通风橱中操作，并佩戴手套和实验服。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从甘蓝型油菜中提取3页蛋白质和核糖配合物的韧皮部汁液

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