全视野光学相干显微术用于角膜移植片中基质特征的类组织学分析

该方法可提高眼库中角膜供体组织的筛选与选择效率，改善角膜移植的效果。该技术的主要优势在于其具备高分辨率评估能力，并且在整个图像采集过程中，角膜始终浸没在充满保存液的密闭腔室内，从而降低了潜在的污染风险。本实验操作将由本实验室的博士毕业生 Maelle Vilbert 演示。

首先，将浸没在保存液中的角膜置于样品 holder 中，使上皮面朝上。将随样品 holder 提供的洁净石英盖玻片放置在角膜上方。然后，轻轻旋转 holder 的底座将其闭合，直至样品在盖玻片下略微压平并固定，从而提供一个相对均匀的成像表面。

注意避免产生任何气泡。在盖玻片上涂抹一层较厚的眼科或光学凝胶作为浸没介质。打开设备背面的电源开关以启动设备。

设备正面的绿色 LED 灯亮起，表示电源已开启。确保成像载台除可移动托盘外无其他物品。然后在采集软件的提示下点击“确定”以初始化电机。

设置设备时，在指定的必填字段中输入样本编号。可选择性地输入样本描述和研究描述。接下来，单击“获取宏观图像”以创建样本快照，该快照后续可用于横向定位和导航。

确认无误后，点击“是”以确认提示框中的图像。随后，设备将把样本载物台移至物镜下方并自动进行调节。继续操作前，请确保显微镜物镜已充分浸入光学凝胶中。

通过进入“探索”选项卡来准备采集。在获取图像序列之前，通过操纵杆或在屏幕上的手动选择导航至角膜中心。通过旋转操纵杆、调节滑块或在图形用户界面上手动键盘输入，调整成像深度。

然后将平均值调整为40，以获得最佳的角膜成像效果。将角膜表面值或第一幅图像的位置输入深度字段。然后选择“采集”选项卡以获取图像。

选择并设置与设备轴向分辨率相匹配的切片间距。在“切片数量”下输入角膜厚度值。查看参数及采集时间。

当确认无误后，按下“确定”以开始采集。采集过程中，避免触碰放置显微镜的台面。为评估基质层和鲍曼层的厚度，需测量角膜横截面的距离。

例如，按照文本稿件中的描述，在横截面上添加五个等间距的点。根据默认视野，绘制一条连接两个已知距离点的线段。然后转到“分析”选项卡，选择“设置比例尺”。

在相应的字段中输入已知距离和长度单位。设置为 1024 像素或 780 微米，然后点击“确定”。在两个未知距离的点之间画一条线，直接从状态栏读取测得的长度或距离。记录平均值和变异系数。

单击“图像”选项卡，然后在“堆栈”下选择“Z轴重切片”以确定角质形成细胞密度。此操作将按每七张一组对基质的表面成像进行求和，以生成厚度相当的切片。在进一步分析中，应包含前部最前端基质的所有可用表面切片、前部基质的15张图像、中部基质的5张图像以及后部基质的5张图像。

在每张内皮面图像上，选择一个 300 × 300 微米的兴趣区域。为增强细胞核的可视化效果，通过“编辑”选项卡下的“反相”功能反相图像。通过点击“图像”选项卡并进入“亮度-对比度”，调整图像的对比度和亮度。

要手动计数细胞核，请转到插件，在分析选项卡下找到细胞计数器。点击初始化，然后选择一种计数器类型。接着通过在倒置图像上单击深色椭圆形特征来计数细胞核，对于位于图像边界的细胞核，仅考虑图像四个边中的两个边上的细胞核。

经选择的人类供体角膜在器官培养基中保存后出现肿胀，形成了角膜水肿的病理生理学模型，由于穿透深度有限，无法获取贯穿整个角膜厚度的图像。转移至添加葡聚糖的器官培养基后，肿胀减轻，供体角膜恢复至正常厚度。病变角膜可通过形态学改变及典型基质特征加以识别，包括基质厚度不均或鲍曼层的减少。

通过评估角膜上皮细胞密度和基质反射率，全视野光学相干显微技术可进一步辅助进行类似组织学的分析，并实现对正常与病变角膜组织的区分，这是临床光学相干断层扫描系统所无法达到的能力。观看本视频后，您应能够充分理解如何对角膜基质进行定性和定量的类似组织学分析，从而有效区分疾病状态与正常人角膜组织。