通过双分子互补亲和纯化技术（BiCAP）解析多蛋白信号复合物

该方法可帮助我们解答细胞生物学和生物化学中的关键问题，例如蛋白质及蛋白质复合物的动态组装如何调控信号通路和细胞行为。该技术的主要优势在于，我们能够特异性地分离出两种相互作用的蛋白质，同时排除未形成复合物的单体蛋白以及其他竞争性结合分子。尽管我们在此利用该方法研究乳腺癌中受体酪氨酸激酶的二聚化过程，但它也可应用于其他任何生理环境或疾病状态。

当我们意识到GFP纳米抗体能够识别GFP及其他荧光蛋白的三维表位时，便首次提出了该方法的构想。首先，将150纳克入门载体、150纳克目的载体以及8微升TE缓冲液加入一个0.2毫升的离心管中。接着加入2微升重组酶和ZiMex，短暂离心混合。

将反应在室温下孵育一小时，然后加入一微升蛋白酶K溶液，并在37摄氏度孵育10分钟以终止反应。接下来，将感受态细胞在冰上解冻，并将50微升细胞转移至一个14毫升圆底聚丙烯管中。

向细胞中加入一微升反应产物，并轻轻混匀。将细胞在冰上孵育20分钟。然后在42摄氏度水浴中热激细胞45秒，之后将细胞放回冰上。

向细胞中加入一毫升 LB 培养基，然后在 37°C 下振荡培养一小时。接着将转化产物涂布到含有氨苄青霉素的 10 厘米琼脂平板上，并在 37°C 下过夜培养。

开始质粒纯化时，向一个大锥形瓶中加入氨苄青霉素和100毫升LB培养基。然后使用接种环从琼脂平板上挑取单个菌落，将接种环浸入LB培养基中并短暂混匀，接着用铝箔封住锥形瓶口，在37摄氏度下振荡培养过夜。

随后使用标准的质粒DNA大提物纯化试剂盒纯化质粒DNA，然后进行转染。首先，将HEK 293T细胞接种于含10毫升DMEM的10厘米培养皿中。然后，将每种双分子荧光互补载体各2.5微克溶于500微升转染缓冲液中。

加入10 µL转染试剂，涡旋混合10秒。然后短暂离心样品，并在室温下孵育10分钟。接着将DNA转染混合物逐滴加入培养皿中。

然后将样品孵育8至24小时。按照文本方案中的说明配制细胞裂解缓冲液和添加补充剂的细胞裂解缓冲液。随后用预冷的PBS洗涤细胞两次。

吸去 PBS，加入一毫米冰冷的含补充剂的细胞裂解缓冲液。接着将培养皿置于冰上，孵育五分钟。然后用细胞刮刀刮下细胞，并将其转移至预冷的微量离心管中。

在4°C条件下，以18,000 × g离心5分钟，去除细胞碎片，然后将澄清的上清液转移至新的微量离心管中。用1毫升PBS洗涤适量的琼脂糖珠，然后以300 × g离心珠子，并小心移除上清液。接下来，向每个样品中加入20微升琼脂糖珠。

在4°C下孵育两小时，同时进行末端对末端旋转。将珠子在300 × g离心，并用细胞裂解缓冲液洗涤三次。然后将洗涤后的珠子重悬于50 µL稀释样品缓冲液中。

最后，将样品在 95 摄氏度加热两到三分钟。在本研究中，采用 BiCAP 方法观察到，在 HEK293T 细胞共转染约 16 小时后，多种蛋白质类型之间存在正向相互作用。通过共聚焦显微镜观察 RTKERBB2 在质膜上的二聚化，以及泛素与 E3 连接酶 UBR5 的结合。

经过GFB纳米抗体亲和纯化后，仅能在共转染样品中检测到全长Venus对照蛋白以及发生相互作用的V1和V2标记蛋白。在进行该实验操作时，请务必优化双分子荧光互补标签的位置，将其置于目标蛋白的C端或N端，这是观察到阳性蛋白/蛋白相互作用所必需的。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何执行 BiCAP 技术，以及如何将其应用于您感兴趣的蛋白质相互作用研究。在完成该实验流程后，可进一步采用多种下游表征技术，例如 ChIPseek，以回答更多科学问题，比如转录因子的二聚化如何调控其与 DNA 的结合。