Name: 脂肪酸13C Isotopologue 分析提供了对无脊椎动物消费者营养碳转移和脂质代谢的洞察力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 了解同位素体分析技术如何追踪土壤无脊椎动物消费者体内膳食脂肪酸的营养转移过程，揭示脂质代谢机制与食物网生态学动态。该方法为研究隐蔽生态系统中的能量流动提供了重要工具。

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我们衷心感谢德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号：RU 780/11-1）对 R. Menzel 和 L. Ruess 提供的经费支持。R. Nehring 的研究由 RU 780/10-1 项目资助。最后，我们非常感谢 Hazel Ruvimbo Maboreke 博士对本文稿的校对工作。

所述方案不属于动物伦理委员会的管辖范围。然而，当人们将所述方案应用于较高等动物时，需确保该动物操作方案已获得机构动物伦理委员会的批准。
1. 动物培养
注意：所有阐述的实验步骤均基于成熟的实验方案26,27,28。实验室内的生物测定需要持续供应易于培养的生物体。本研究中采用了弹尾纲物种Protaphorura fimata (Gisin, 1952) 和 Hetermurus nitidus (Templeton, 1835)。这两种物种易于维持，可作为以酿酒酵母为食的高效实验室培养种群。
<ol>
	<li>在带有紧密盖子的塑料微宇宙装置（直径 7 cm，高 4.5 cm）中，加入活性炭、熟石膏和蒸馏水的混合物，以提供高度湿润的繁殖基质（图1A).
	<ol>
		<li>制备微宇宙时，混合足量的基质， 例如， 用于一批中的10个微宇宙实验。在石膏容器中将9份熟石膏（225 g）与1份干燥的活性炭（25 g）混合，小心加入约10份蒸馏水（250 mL），于室温下静置5分钟，期间不搅拌。</li>
		<li>用实验勺以中等速度顺时针搅拌，避免产生气泡，直至形成浓稠的糊状物。立即倒入微宇宙系统中，高度约1 cm。</li>
		<li>通过在实验台上轻轻敲击并旋转来抹平石膏。需要注意的是，孔洞（由气泡随机产生）和沟槽（用无菌刮刀主动添加）可能会促使 fertile 跳虫在这些位置产卵。本研究为避免干扰，未制造孔洞和沟槽，以确保条件一致且可重复。然而，出于演示目的 图1B 呈现一些孔洞。</li>
		<li>室温下静置干燥约1 - 2天；孵育于 60 °C 可将该时间缩短至1 - 2 h。</li>
		<li>使用移液管向微宇宙中加入自来水，直至基质略微湿润，以在使用前润湿微宇宙。由于跳虫具有柔软的角质层，易受干燥影响，需定期添加蒸馏水以保持微宇宙湿润。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用简易吸管将跳虫轻松转移至石膏基质上， 即， 一根长约25 cm的硅胶管，末端连接带有小滤网的移液器吸头，以防止动物被吸入管内。或者，也可使用小型毛刷，使动物附着于刷毛上进行转移。</li>
	<li>将30只新孵化的弹尾虫（参见步骤1.2）转移至新的微宇宙系统中，并提供颗粒状干酵母作为食物（约刀尖量）图1B）；每周至少更换两次。每个取样日设置三个独立重复；本研究中为第0-7天和第14天。置于 15 °C 在黑暗中进行。保持恒定温度至关重要，因为动物代谢会改变脂肪酸以满足膜流动性的需求。</li>
	<li>在开始暴露实验前，用酿酒酵母喂养跳虫四周，以获得均一的种群 13C/12脂肪酸中的C信号与模式。使用吸管或刷子去除所有卵图1C），粪便颗粒和蜕皮物应定期移除，因为动物可能摄食这些物质，从而改变其脂质谱型。</li>
</ol>
<img alt="显示微小生物体和材料的培养皿装置；用于行为研究的宏观图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57110/57110fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：弹尾虫的培养。（A）微宇宙系统，内含繁殖基质，该基质为熟石膏、活性炭与蒸馏水的干燥混合物。（B）和（C）Protaphorura fimata 培养物的代表性样本；注意用作食物来源的干燥面包酵母小颗粒，以及繁殖基质中的孔洞（黑色箭头）（B），还有两个卵（白色箭头）（C）。<a href="/files/ftp_upload/57110/57110fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
2. 饮食标记、收获与样品处理
<ol>
	<li>标记
	<ol>
		<li>建立弹尾目培养物四周后，将30个个体分别放入新的微宇宙系统中，并在 15 °C 在黑暗中。</li>
		<li>通过喂食含有完全标记的酵母来引入脉冲标记 13C标记的棕榈酸（13C16:0，99 原子%）通过混合 13用刮刀将C标记的棕榈酸与酿酒酵母按0.5:1的比例混合， 例如，5 g 13C16:0 和 10 g 干酵母。每份微宇宙中加入约刀尖量。</li>
		<li>6 小时后，将标记的食物替换为完全未标记的酿酒酵母。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进一步培养
	<ol>
		<li>实验过程中，每三天更换一次酵母食物，并添加超过跳虫在此期间摄食量的饲料。最重要的是，需定期使用吸管或毛刷清除跳虫的卵、粪粒和蜕皮残留物，以确保动物仅取食所提供的食物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获
	<ol>
		<li>每天破坏性取样微宇宙样品直至第7天。然后在第14天，每个取样时间点收集三个独立的重复样本；不同的取样时间点是可行的。</li>
		<li>准备10 mL带聚四氟乙烯（Teflon）涂层螺旋盖的玻璃管，每份样品一支。预先将这些玻璃管在玻璃器皿清洗机中清洗，随后用去离子水冲洗两次。最后，为去除任何疏水性污染物残留，加入2 mL色谱纯氯仿，剧烈涡旋振荡后弃去溶剂，重复此步骤两次。</li>
		<li>对照样品（第0天）：从预培养物中取3份未暴露的跳虫样品，每份30只，作为第0天样品。</li>
		<li>对于暴露样本（第1天及之后），每天从中间喂食混合物的培养物中分别取30只暴露的跳虫进行采样 13C标记的棕榈酸和酿酒酵母</li>
		<li>使用超微量天平记录跳虫的鲜重。用吸虫器或毛刷将个体转移至合适的称量盘中。为确保跳虫在称量盘中易于操作，称重前应先将个体进行冷休克处理（-80 °C 2小时）。或者，可使用CO2 持续流动10分钟可安全地使动物昏迷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称重后立即将动物从天平盘小心转移至10 mL玻璃试管中。向试管中加入1 mL甲醇（HPLC级），并于-20 °C 直至分析前 
	注意：从这一步开始，由于涉及有机溶剂，应避免使用塑料器皿接触样品；应使用适用于有机溶剂的分液器、移液器以及玻璃容器。</li>
</ol>
3. 动物组织中的脂质提取与甲醇解
<ol>
	<li>每批准备三个玻璃试管（配备聚四氟乙烯涂层螺旋盖），每个试管仅加入 1 mL 甲醇作为空白值。重要的是，本方案中使用的任何溶剂都必须仅通过玻璃移液管或经氯仿/甲醇冲洗过的耐溶剂分配器添加或转移。</li>
	<li>在脂质提取过程开始时，通过蒸发减少用于保存（或作为空白）的甲醇；建议使用配备真空泵和冷阱的紧凑型台式旋转真空浓缩仪（RVC）。将敞口试管放入 RVC 中，在 50 °C 和 200 hPa 真空压力下蒸发 20 分钟至干燥。</li>
	<li>向每个样品（包括空白）中加入 5 mL 单相提取溶剂（氯仿/甲醇/0.05 M 磷酸盐缓冲液 1:2:0.8，pH 7.4），并在室温下振荡过夜（约 200 rpm）以提取弹尾虫脂质。</li>
	<li>将溶剂转移至新试管中，并用额外的 2.5 mL 提取溶剂再振荡提取 3 小时。之后合并两步的提取液；建议使用玻璃巴斯德移液管。加入 0.8 mL 氯仿和 0.8 mL 蒸馏水，混匀后在 20 °C 下以 2,000 g 离心 5 分钟。最后静置 5 分钟，使水相与氯仿相充分分离。</li>
	<li>为进行脂肪酸谱型分析，将弹尾虫的总细胞脂质分为中性脂质、糖脂和磷脂组分。
	<ol>
		<li>为每个样品准备硅酸柱（商用柱，含 0.5 g 硅酸，粒径 100–200 µm，参见 材料表），加入 1 mL 氯仿进行预处理。为加快此过程，可将柱子安装在常用于固相萃取的真空装置上。不要使用尼龙针头；应在试管上方使用不锈钢针头。</li>
		<li>待预处理所用氯仿流经柱体后，将每个样品的下层氯仿相完全转移至各自的柱子中。为简化操作，可事先移除上层水相。使用玻璃巴斯德移液管，但需注意避免柱子干涸。</li>
		<li>依次用 5 mL 氯仿（洗脱中性脂质脂肪酸，NLFAs）、10 mL 丙酮（洗脱糖脂——本项目中不分析）和 5 mL 甲醇（洗脱磷脂脂肪酸，PLFAs）洗脱各脂质组分。将每种组分分别收集于不同的玻璃容器中。</li>
		<li>提取结束后，通过 RVC 蒸发去除氯仿（NLFAs）和甲醇（PLFAs）。将敞口试管转移至 RVC，在 60 °C 和 24 hPa 真空下蒸发约 90 分钟至干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照 Welch (1991)29 的方案开始对脂质（NLFA 和 PLFA 组分）进行皂化处理：加入 1 mL 氢氧化钠-甲醇溶液（含 45 g 氢氧化钠、150 mL 甲醇和 150 mL 蒸馏水），在 100 °C 水浴中孵育 30 分钟。将样品在冰水中冷却 2 分钟后放回实验台，在室温下继续操作。</li>
	<li>向每个样品（包括空白）中加入内标。选择一种在实验生物中不常见的脂肪酸；同时选用饱和脂肪酸以减少断裂损失，并选择中等链长的分子。在多数情况下，奇数碳链的十九烷酸（19:0）效果良好。因此，加入 30 µL 浓度为 0.74 mM 的异辛烷溶液。精确加入量至关重要——务必提前使用微量天平校准移液器的准确性。</li>
	<li>加入 2 mL 盐酸-甲醇溶液（将 325 mL 6.0 N 盐酸与 275 mL 甲醇混合），在 80 °C 水浴中孵育 10 分钟，然后在冰上快速冷却 2 分钟。此步骤对时间和温度敏感，应控制在 80 ± 1 °C 和 10 ± 1 分钟。检查一次可放入水浴中的样品数量，以确保水浴温度维持在 80 °C。 
	注意：此过程生成脂肪酸甲酯（FAMEs），即 为气相色谱中汽化而稳定的脂肪酸分析物。</li>
	<li>最后加入 1.25 mL 正己烷/甲基叔丁基醚（1:1），轻轻振摇 10 分钟，然后在 2,000 g 下离心 5 分钟。弃去下层水相，保留含 FAMEs 的上层有机相；使用玻璃巴斯德移液管。加入 3 mL 氢氧化钠水溶液（将 10.8 g NaOH 溶于 900 mL 蒸馏水中）进行洗涤。
	<ol>
		<li>再次振摇并离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用玻璃巴斯德移液管完全取出上层含脂质的有机相，转移至配备聚四氟乙烯垫片的气相色谱样品瓶中。避免混入哪怕微量的水相，以免影响 GC 测定结果。密封样品瓶，并在 -20 °C 下保存直至分析。</li>
</ol>
4. 通过气相色谱-火焰离子化检测器定量脂肪酸
<ol>
	<li>使用气相色谱法鉴定并定量弹尾虫（动物）脂质中性脂肪酸（NFLA）和磷脂脂肪酸（PLFA）组分中的脂肪酸甲酯（FAMEs）。配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪（GC）是经过验证且成熟可靠的设备30.</li>
	<li>为鉴定脂肪酸甲酯（FAMEs），将样品中色谱峰的保留时间与FAME标准品进行比对。该标准品为包含多种关键FAMEs的定性或定量混合标准品，涵盖多种食品和生物体。</li>
	<li>使用包含所研究生物类群及实验饮食中代表性脂肪酸的FAME标准混合物。在弹尾纲中，这些脂肪酸是真核生物的特征性脂肪酸。 例如，长链多不饱和脂肪酸如花生四烯酸（20:4ω6）。当使用酵母作为食物时，这些脂肪酸可作为真菌标记物，例如亚油酸（18:2ω6）。一个较好的选择是所谓的FAME混合物，包含37种常见于动物、真菌和植物材料中的脂肪酸，以及细菌酸甲酯（BAME）混合物（见 材料清单).</li>
	<li>使用仪器配套软件设置序列，以在气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）上运行样品。具体操作步骤请参考仪器制造商提供的使用手册。该序列以外部标准混合物开始（例如 FAME 和 BAME 混合物)，然后是样品。注意存在保留时间偏移， 即， 每次运行样品时，脂肪酸从GC柱洗脱的时间会出现轻微延迟。每10次运行中应加入一个标准品th 在样品序列中运行，或对棕榈酸（16:0）使用保留时间锁定。</li>
	<li>根据仪器调整气相色谱条件。建议以下程序用于高性能（HP）毛细管柱（25 m × 0.2 mm 内径，膜厚 0.33 µm. 将进样体积设定为 1 µL 采用不分流模式，并以氢气作为载气。使用起始温度为 50 °C （保持1分钟）并以 25 °C 分钟-1 至 175 °C 随后 3 °C 分钟-1 至 230 °C （保持5.7分钟）。</li>
	<li>使用以下公式，根据FID测得的每种FAME响应值及相应脂肪酸的已知量，计算每克生物体鲜重（或干重）所含的脂肪酸纳米摩尔数： 
	<img alt="脂肪酸浓度计算公式；酯交换反应方程式；化学分析方法" src="/files/ftp_upload/57110/57110eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	A脂肪酸甲酯：样品中相应脂肪酸甲酯（FAME）的峰面积 
	MWFM相应FAME的分子量 µg/µmol 
	CIS：内标物的浓度在 µg 
	AIS：内标物的峰面积 
	mCol：相应跳虫样品的鲜重（干重），单位为 g 
	1000：换算系数，用于 µmol 至 nmol 
	cBW：相应空白值平均浓度中的FAME浓度（nmol）</li>
</ol>
5. 通过同位素异构体分析进行13C分析
<ol>
	<li>使用配备电子电离（EI）源的气相色谱系统与质谱选择性检测器联用，用于同位素异构体的测定。
	<ol>
		<li>使用极性毛细管柱（例如， DB 23、CP-Sil 88），因为这还能进一步分离具有相同双键数目的不饱和脂肪酸。气相色谱柱的选择对结果至关重要，因为它决定了脂肪酸中分子离子的良好表征。</li>
		<li>对于 DB 23 柱（60 m x 0.25 mm 内径，膜厚 0.15 µm），将烤箱温度从 130 °C 并增加 6.5 °C/分钟 170 °C。随后进行增量 3 °C/分钟 203 °C 并保持1.9分钟，随后进行增加 40 °C/分钟 230 °C 并保持8.3分钟。将传输线温度设为 280 °C再次根据仪器调整气相色谱方法。</li>
		<li>使用含有已知量脂肪酸甲酯（FAMEs）的定量标准品，针对所有待检测的脂肪酸进行分析 13C 同化。将这些标准品置于每个样品序列运行的开始和结束位置。从这些标准品中获取目标脂肪酸的保留时间。</li>
		<li>从实验中测量样品时，始终先测量未标记的样品，然后测量标记的探针。根据样品浓度选择适当的分流比。 例如 1:12.5. 若仪器支持，每次样品运行后使用氦气进行反吹，以清除色谱柱中残留的分析物。</li>
		<li>对气相色谱-质谱法应用保留时间锁定，以确保选择离子监测采集不受保留时间漂移的影响，并获得可重复的分析物保留时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定 13通过气相色谱/电子电离质谱法（GC/EI-MS）在仪器的选择离子监测（SIM）模式下检测脂肪酸分子离子中的碳掺入。SIM模式运行可相对于全扫描模式提高对特定分析物的检测灵敏度。
	<ol>
		<li>首先进行一次初始扫描，以确定存在的组分，然后对相应离子进行选择离子监测（SIM）。通过选择包含各脂肪酸色谱峰时间的 m/z 扫描窗口（SIM 组），在目标分子质量处采集数据。通常，每种分析物和时间窗口监测两到四个离子。</li>
		<li>为了提高灵敏度，需调整质谱扫描速率和驻留时间（即检测每个质荷比离子的时间）。最佳数据质量通常在尽可能低的扫描速度下获得，SIM模式下的一般原则是在分析物峰上完成8至12次扫描。仪器参数设置的一个参考标准是：每个质荷比的平均驻留时间为9 ms，循环周期为6 s，扫描时间为175 ms/周期。-1.</li>
		<li>检测分子离子（M+) 对应脂肪酸及其所有同位素异构体（M+1，M+2 以及等等。示例请参见“代表性结果”。</li>
		<li>记录每种离子碎片（同位素体）的丰度。注意，分子离子及其同位素体的丰度通常较低，定量结果的质量在很大程度上取决于质谱系统的性能。在开始大批量样品序列（实验）前应运行调谐程序，并在必要时清洗离子源。 
		注意：首先，这些数据给出了总体结果 13每种脂肪酸相对于消耗的前体物质（此处为16:0）的碳同位素富集度。</li>
		<li>利用标记脂肪酸与其未标记对应物的同位素组成比例来确定营养级碳通量。使用步骤6.1中的原子百分比公式（atom%）计算相应脂肪酸中标记碳的百分比（原子百分比，atom%）。比较该百分比 13标记个体（第1天及之后）与未标记个体（第0天）之间弹尾虫脂肪酸中的碳同位素比值变化，作为物质流动的相对指示 13饮食中碳元素向消费者的转移。</li>
		<li>指定位置 13C 掺入脂肪酸链。根据同位素异构体的分布，解析整个标记示踪脂肪酸（此处为 16:0）的膳食去向，以区分脂质代谢过程中的链延长作用。尽管整个标记分子的同化会增加远离母离子（M+), 例如，M+15，M+16，通过使用链延伸 13C标记的C2片段（13C acetyl-CoA）中，接近分子离子的同位素异构体出现频率更高。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 13C 丰度计算
<ol>
	<li>根据同位素异构体的分布，使用以下关系式计算相应脂肪酸中标记碳的总百分比（以原子百分比表示）：原子百分比 = （掺入的13C同位素异构体比例）×（相应同位素异构体的频率） 
	该计算方法依据Kuppardt et al.31 提出的公式：<img alt="原子百分比计算公式，ΣNJ=1(J/N)×(AM+J/AT)，用于定量分析" src="/files/ftp_upload/57110/57110eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	其中N为脂肪酸中的碳原子数，J为13C同位素的数量，AM+J为相应同位素异构体的丰度，AT为所有同位素异构体的总丰度。</li>
	<li>计算时，将通过SIM-MS分析检测到的相应脂肪酸分子离子（M+）及其所有同位素异构体（M+1、M+2等）的峰面积值相加，并设为100%相对丰度。通过三比法则可轻松计算出每个检测到的同位素异构体所占比例。</li>
	<li>从实验值中减去未标记的第0天对照值（天然13C本底），以获得仅反映外源13C标记结果的最终数据。</li>
</ol>

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同位素异构体分析
对脂肪酸（FAs）中13C分布的定量特征进行详细分析，需要前沿技术以确定食物网中的碳分配。本研究采用同位素异构体谱分析法（isotopologue profiling），评估常见脂肪酸生物标志物中用于营养级相互作用研究的13C/12C比值。该方法在利用液相色谱（LC-MS）进行氨基酸分析方面已较为成熟，并已被用于病原性细菌碳代谢的研究17,23。直至最近，Menzel et al.24才进一步发展该技术，将其作为研究小型土壤无脊椎动物体内脂质膳食分配的工具。由于该方法不受13C信号“残留”效应的干扰，因此相较于气相色谱-燃烧-同位素比值质谱法（GC-C-IRMS）32，在评估特定同位素高度富集的有机组织时具有优势。<...

在土壤等隐蔽生境中，营养关系难以明确，且常因动物体型微小而进一步受限。近十年来，化学生态学取得了进展，尤其是在利用脂肪酸作为生物标志物来确定田间条件下土壤动物摄食策略方面的应用1,2,3。该方法基于一个事实：资源中的脂肪酸可作为完整分子被整合到消费者组织中，这一过程称为饮食途径转移4。已有研究报道脂肪酸可在三个营养级间传递，i.e., 从真菌到线虫再到弹尾纲动物5。最近，研究开始关注捕食性动物类群6,7，并已发表关于脂肪酸作为土壤食物网营养标记物的首批综述文章8,9。
通过脂肪酸稳定同位素探针技术（FA-SIP）可获得更详细的营养相互作用信息。该方法的测定 13C/12饮食和消费者中脂肪酸的碳同位素比值可用于确定二元联系并估算相关的碳流动，该方法已应用于陆地、淡水和海洋食物网10,11,12,13基本假设是，经饮食途径摄入的脂肪酸不经过酶促过程；因此，它们的 13C信号， 即， 的 13C/12消费者体内脂肪酸的C同位素比值与其饮食中的比值相似1。然而，一种逐渐的耗竭 13水生系统中已报道存在碳同位素信号沿食物链富集的现象，从而限制了脂肪酸稳定同位素探针技术（FA-SIP）在营养关系研究中的广泛应用14,15,16此外，关于陆地食物网中大多数无脊椎动物的脂质代谢知识仍然有限。
了解消费者体内的脂质代谢途径对于利用营养标记脂肪酸来确定食物网生态学中定量碳流至关重要。鉴于此，13C-同位素异构体分析是一种有前景的方法，原则上可应用于任何生物系统的碳代谢研究17。在引入13C标记的碳底物后，由于消费者体内产生的代谢产物呈现出特定的同位素异构体分布，因此可在代谢网络中追踪13C的分布情况。该过程可通过定量核磁共振波谱法18,19或质谱法20,21进行评估，其中质谱法因具有更高的灵敏度，更适用于生物量较低的生物样品。
尽管同位素异构体分析已成功应用于氨基酸，并为细菌病原体的体内碳代谢提供了深入见解17,22,23，但其在脂肪酸中的应用仍相对滞后。Menzel et al.24最近首次详细分析了稳定同位素标记的前体脂肪酸在土壤无脊椎动物消费者中被摄入、经膳食传递或通过β-氧化降解的命运。本文提供了利用13C标记脂肪酸对常见土壤无脊椎动物弹尾纲（Collembola）进行结合实验的方法学基础，并对其关键后代产物进行同位素异构体分析。这类微小节肢动物是理想的研究模型，因为它们在土壤食物网中具有重要地位，且其作为营养标记的脂肪酸已得到充分研究8,25。
了解消费者体内的脂质代谢途径对于利用营养标记脂肪酸来确定食物网生态中定量碳流至关重要。本实验方案介绍了实验室喂养实验的设计与建立，以及从弹尾纲动物中提取和甲基化主要脂质组分（中性脂质、磷脂）的生化步骤。该方案展示了如何通过质谱分析脂肪酸同位素异构体的组成，并描述了相关的公式与计算方法。本方法可获得以下结果：（i）同位素异构体相对于母离子质量的比值即， 脂肪酸分子离子 M+）相差一个或多个质量单位（M+1，M+2，M+3, 等等。）以及（ii）整体的 13脂肪酸中衍生的C富集 13C标记的前体物质。尽管该方法目前用于弹尾目动物，但原则上可广泛适用于其他任何捕食者-猎物相互作用的研究，前提是这些生物可在受控条件下培养至足够数量，以确保成功标记并进行后续验证。

<table><tbody><tr><td>neoLab-圆形广口瓶</td><td>neoLab</td><td>2-1506</td><td>69 x 40 mm，每包10个</td></tr><tr><td>活性炭</td><td>Carl Roth</td><td>X865.1</td><td>p.a.，粉末，CAS编号 7440-44-0</td></tr><tr><td>熟石膏牙科用</td><td>R&amp;Ouml;HRICH-GIPSE</td><td>---</td><td>http://www.roehrich-gipse.de/dentalgipse.php</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Carl Roth</td><td>7331.1</td><td>HPLC &amp;ge; 99.9%</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carl Roth</td><td>P717.1</td><td>HPLC &amp;ge; 99.9%</td></tr><tr><td>己烷</td><td>Carl Roth</td><td>7339.1</td><td>HPLC &amp;ge; 98%</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tert&lt;/em&gt;-丁基甲基醚（MTBE）</td><td>Carl Roth</td><td>T175.1</td><td>HPLC &amp;ge; 99.5%</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Carl Roth</td><td>7328.2</td><td>HPLC &amp;ge; 99.9%</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth</td><td>6771.1</td><td>p.a. &amp;ge;99%，颗粒状</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>p.a. &amp;ge;99%，无水</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠二水合物</td><td>Carl Roth</td><td>T879.1</td><td>p.a. &amp;ge;99%</td></tr><tr><td>次氯酸（6 N）</td><td>VWR International</td><td>26,115,000</td><td>AVS TITRINORM 体积溶液</td></tr><tr><td>Bond Elut（柱）</td><td>Agilent Tech.</td><td>14102037</td><td>HF Bond Elut-SI，500 mg，3 mL，每包50个</td></tr><tr><td>Pr&amp;auml;paratengl&amp;auml;ser Duran</td><td>Glasger&amp;auml;tebau Ochs</td><td>135215</td><td>&amp;Oslash; 16 x 100 mm，带螺纹盖，配有方便的滚花和集成PTFE/硅胶垫圈</td></tr><tr><td>Supelco 37组分FAME混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47885-U Supelco</td><td>10&amp;nbsp;mg/mL 溶于二氯甲烷，分析标准品</td></tr><tr><td>FlowMesh</td><td>Carl Roth</td><td>2796.1</td><td>聚丙烯网，厚度约0.3 mm，丝间距1 mm</td></tr><tr><td>细菌酸甲酯（BAME）混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47080-U Supelco</td><td>10&amp;nbsp;mg/mL 溶于己酸甲酯，分析标准品</td></tr><tr><td>十九烷酸甲酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74208</td><td>分析标准品 &amp;ge; 98.0%</td></tr><tr><td>1-13C标记棕榈酸（十六烷酸）</td><td>Larodan Fine Chemicals</td><td>78-1600</td><td>GC &amp;ge; 98.0%（&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C：99.0%）</td></tr><tr><td>RVC 2-25 CDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>紧凑型台式中试浓缩仪</td></tr><tr><td>Alpha 2-4 LDplus</td><td>Martin Christ Gefrier-trocknungsanlagen</td><td></td><td>干燥歧管</td></tr><tr><td>MZ 2C NT</td><td>Vacuubrand GMBH</td><td></td><td>真空泵</td></tr><tr><td>Roto-Shake Genie</td><td>Scientific Industries</td><td></td><td>摇动与旋转组合装置</td></tr><tr><td>XP64 微型比较仪</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>超高精度天平</td></tr><tr><td>GC-系统 7890A</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>气相色谱仪</td></tr><tr><td>7000 GC/MS 三重四极杆</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>三重四极杆质谱仪</td></tr><tr><td>7683B系列进样器</td><td>Agilent Tech.</td><td></td><td>样品进样器</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3SR&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>带10 mL试管转子的离心机</td></tr></tbody></table>

脂肪酸13c同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

脂肪酸（FAs）在食物网生态学中是重要的生物标志物，因为它们通常以完整分子形式被同化，并几乎不加修饰或仅轻微修饰地转移到消费者组织中，从而能够揭示不同营养级之间的食物来源路径。然而，脂肪酸营养标记方法的应用仍受限于对土壤动物脂质代谢知识的不足。本研究采用了完全标记的棕榈酸（palmitic acid）13C16:0，99 原子%）作为两种广泛分布的土壤弹尾虫脂肪酸代谢途径中的示踪剂， Protaphorura fimata 和 Heteromurus nitidus为了研究该前体的命运及其代谢修饰，本文介绍了一种通过质谱单离子监测进行的同位素异构体谱型分析方法。此外，还描述了上游的实验室饲喂实验，以及主要脂质组分（中性脂质、磷脂）的提取与甲基化处理，及相关公式与计算方法。同位素异构体谱型分析不仅能够提供整体 13脂肪酸中衍生的C富集 13C标记的前体，还会产生超过母离子质量的同位素异构体模式（即， FA分子离子M+每种标记脂肪酸（FA）的质量数增加一个或多个质量单位（M+1，M+2，M+3, 等等。）。这一知识可用于推断某种完全被摄入的脂肪酸在饮食分配中的比例，相较于 从头合成 生物合成。同位素异构体分析被建议作为一种有效工具，用于评估土壤动物脂肪酸代谢，以解析营养相互作用。

弹尾虫的鲜重和脂质含量 
在本项描述的实验过程中，非长链脂肪酸（NLFAs）和磷脂脂肪酸（PLFAs）的含量随时间推移未发生显著变化，而弹尾虫个体的鲜重略有增加，但差异不显著24。这两个参数均表明弹尾虫个体具有良好的生理健康状态。请注意，在整个实验过程中应定期测定弹尾虫的鲜重和脂质含量，以对应脂肪酸和同位素分析的采样时间点。需注意的是，若在实验期间出现体重下降和/或脂质含量降低，表明测试生物体的健康状况下降，所获得的数据将显著降低其科学意义。
同位素异构体检测 
同位素异构体谱分析项目的特殊意义在于能够对特定脂肪酸中的分子离子及其所有同位素异构体进行 individually 检测与定量。例如，在16:0的情况下，离子的质量范围从270开始， 即， 分子离子 M+ （主要由C骨架构成的 ...

脂肪酸营养标记方法 即， 以完整分子形式同化脂肪酸并将其转移至消费者组织而几乎不发生修饰的过程，因对小型土壤无脊椎动物脂肪酸代谢的认知空白而受到阻碍。同位素异构体分析被作为一种有效工具，用于解析营养相互作用。

脂肪酸13C同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

脂肪酸（FAs）在食物网生态学中是有效的生物标志物，因为它们通常以完整分子形式被同化并转移至消费者……

本同位素异构体分析的总体目标是追踪膳食脂肪酸在无脊椎动物消费者中的营养级传递过程，包括其在体内的加工及脂质代谢过程，例如碳链延长或β-氧化。该方法有助于解答食物网生态学中的关键问题，例如“谁在捕食谁”，这一问题在土壤等隐蔽生态系统中往往难以回答。本技术将由来自Liliane Ruess教授实验室的硕士生Dilara Simsek进行演示。为了制备带有紧密贴合盖子的塑料微宇宙装置，在一个石膏容器中，将九份熟石膏与一份干燥的活性炭混合。加入十份蒸馏水，于室温下静置五分钟，期间不进行搅拌。使用实验勺以中等速度顺时针方向搅拌混合物，避免产生气泡，直至形成浓稠、呈浆状的质地。然后，将混合物倒入微宇宙中，高度约为一厘米。通过轻轻敲击实验台并旋转使石膏表面平整。请注意，由气泡形成的孔洞以及用无菌刮刀添加的沟槽可能会促使肥沃的弹尾虫在其中产卵。然而，本研究避免使用孔洞和沟槽，以确保条件的一致性和可重复性。待微型生态系统干燥后将其润湿，使用装有小块筛网的吸管将30只刚孵化的弹尾虫转移到微型生态系统的石膏基质上。提供约一滴刀尖量的颗粒状干酵母作为食物，并每周至少更换两次。每个采样日设计三个独立的重复组。本研究中采集了第0至7天以及第14天的样品。将微宇宙体系在15摄氏度的黑暗条件下孵育，并保持恒定温度，因为脂肪酸会通过动物代谢被修饰，以满足膜流动性的需求。根据文本方案，在称重后立即小心地将动物从天平托盘转移至10毫升玻璃试管中。每管加入1毫升HPLC级甲醇，于-20摄氏度保存直至分析。每批样品准备三个玻璃试管，并减少用于样品保存的甲醇用量后，向每个样品（包括空白样品）加入5毫升单相提取溶剂，在室温下以200 rpm振荡过夜，以提取弹尾虫脂质。根据文本方案提取样品后，为进行脂肪酸谱分析，需为每个样品预处理硅酸柱：向每根柱中加入 2 mL 氯仿。待氯仿流经柱体后，使用玻璃巴斯德吸管从样品中移除下层的氯仿相，然后将其转移至各自的柱中。使用 5 毫升氯仿将中性脂质（NLFAs）洗脱至各个玻璃容器中。然后，使用 10 毫升丙酮洗脱糖脂，再使用 5 毫升甲醇洗脱磷脂脂肪酸（PLFAs）。提取完成后，将 NLFA 和 PLFA 的敞口试管转移至旋转真空浓缩仪（RVC）中，在 24 hPa 的真空条件下，于 60 °C 下蒸发约 90 分钟，直至样品干燥。分离并洗涤脂肪酸甲酯（FAMEs）后，使用玻璃巴斯德吸管将含有脂质的上层转移至配备聚四氟乙烯垫片的玻璃色谱样品瓶中。密封样品瓶，并在负20摄氏度下保存直至分析。为在GC-FID上鉴定NFLA和PLFA样品中的FAMEs，请根据仪器制造商的说明，使用仪器配套软件设置相应的分析序列。首先运行外部标准混合物，然后运行样品。每次进样后，脂肪酸在气相色谱柱上的洗脱时间会有轻微延迟。可在样品序列中每运行10个样品后插入一次标准品，或对棕榈酸使用保留时间锁定技术。设置程序，并根据文本方案计算脂肪酸的 nmol 数量。若要通过同位素异构体分析法进行碳-13 分析，应使用极性毛细管柱，因为该柱还能进一步分离不饱和脂肪酸，即使其双键数目相同亦可实现分离。气相色谱柱的选择对结果至关重要，因为它决定了脂肪酸中分子离子的良好表征。对于DB-23色谱柱，起始柱温为130摄氏度，以每分钟6.5摄氏度的速率升至170摄氏度。随后以每分钟3摄氏度的速率升至203摄氏度，并保持1.9分钟。然后以每分钟40摄氏度的速率升至230摄氏度，并保持8.3分钟。将传输线温度设置为 280 摄氏度。根据文本方案完成程序设置后，首先运行一次初始扫描以查看存在的成分，从而确定脂肪酸分子离子中碳-13的掺入情况。然后对相应的离子运行选择离子监测（SIM），并通过选择包含相应脂肪酸色谱峰时间的质荷比（m/z）扫描窗口或 SIM 组，采集目标分子质量的数据。通常，每个分析物和时间窗口监测两到四个离子。在质谱方法开发中，我们使用外标脂肪酸进行总离子计数。根据保留时间和碎片离子选择时间片段。检测相应脂肪酸的分子离子 M⁺ 及其所有同位素异构体，如 M+1、M+2 等。根据文本方案指定营养级碳流、碳-13 掺入位置，并计算碳-13 富集度。该图展示了纯 16:0 棕榈酸的 SIM-MS 谱图。该化合物中碳-13的天然丰度可通过分子离子峰M加、M加一和M加二同位素异构体的存在而被检测到。相比之下，此质谱图代表完全标记的棕榈酸。此处仅出现M加16离子峰，反映了合成标记化合物的高纯度。以下 SIM 扫描数据来源于标记后第一个采样日的异毛跳虫（Heteromurus nitidus）PLFA 组分中四种主要脂肪酸。标记示踪分子在棕榈酸中的同化情况可通过 M+16 同位素异构体的丰度显现，因其代表了整个被标记的脂肪酸。此外，还可识别出由 16 碳脂肪酸去饱和为零，或延长后再去饱和的代谢过程。因此，通过使用 C2-13 片段，检测质量数大于 M+16 的同位素异构体（例如 M+17 和 M+18），可证明标记前体物质从第16天到第0天的链延伸现象。本文展示了来自原跳虫（Protaphorura fimata）的五种标记程度最高的 NLFA 和 PLFA 在第0天和第1天时，其 M+1 至 M+3 以及 M+16 至 M+20 离子的相对比例。在进行该实验操作时，需注意消费者体内天然含有一定比例的碳同位素。该数量必须通过不含标记饮食的对照实验来确定。这种天然的特定碳信号将作为背景从标记模板中扣除。请注意，使用溶剂可能具有极高危险性，应采取预防措施。

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科研

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脂肪酸13C Isotopologue 分析提供了对无脊椎动物消费者营养碳转移和脂质代谢的洞察力

本文描述了通过气相色谱-质谱联用技术对线虫Caenorhabditis...

稳定同位素示踪分析在发育期与成年期中间代谢流中的应用 秀丽隐杆线虫

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哺乳动物皮肤及其附属结构含有可溶剂提取的脂质，这些脂质可提供具有物种特征性的化学组成。本文介绍了一种常规方法，利用薄层色谱法分离自皮肤及其附属组织中提取的各类主要脂质，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定其甘油三酯谱型。...

通过制备型薄层色谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析蝙蝠皮肤脂质中的三酰甘油成分

磷脂脂肪酸可提供有关土壤微生物群落结构的信息。本文介绍了从土壤样品中提取磷脂的单相氯仿混合物提取方法、利用固相萃取柱对提取的脂质进行分离纯化的方法，以及通过甲醇解反应生成脂肪酸甲酯，随后采用毛细管气相色谱法对脂肪酸甲酯进行分析。...

土壤中微生物磷脂脂肪酸的提取与分析

斑马鱼正成为研究膳食脂质代谢和代谢性疾病的一个重要模型。本文介绍了富含脂质的幼体饲料制备、膳食荧光脂质类似物的活体成像以及摄食量定量等实验方案。这些技术可广泛应用于多种筛选、成像及基于假设的探究方法。...

幼年斑马鱼高脂喂养方案：喂养、活体成像及摄食量定量分析

本文介绍了一种方法，该方法在提高通量的同时，平衡了操作难度与准确性，可用于从微生物细胞膜中提取脂质，进而对大量样本研究中的总脂质以及指示性脂质的相对丰度进行表征，以确定土壤微生物群落结构。...

一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

本研究采用高分辨率1H和13C核磁共振（NMR）波谱法作为对封装鱼油补充剂进行定性和定量分析的快速且可靠的工具。...

核磁共振波谱法作为快速评估鱼油补充剂脂质谱的可靠工具

本方案用于测定海水和生物样品中的脂质。滤液中的脂质采用氯仿提取，对于固体样品则使用氯仿与甲醇的混合溶液进行提取。脂质类别通过棒状薄层色谱结合火焰离子化检测进行测定，各类脂质含量之和即为总脂质含量。...

海洋样品中总脂质及脂质类别的测定

本文介绍了一种利用重水（deuterium oxide）和气相色谱-质谱联用技术（GCMS）分析总脂肪酸的经济型定量方法 从头合成 棕色脂肪组织中的脂质生成 体内.

定量测定 从头合成 利用重水研究棕色脂肪组织中的脂肪酸合成

本文介绍了一种通过稳定同位素标记，结合保留时间、迁移率和碎片化特征来筛选脂质结构的方法。...

示踪 从头合成 使用稳定同位素标记的液相色谱-传输区离子淌度-飞行时间质谱/质谱分析脂质

了解同位素体分析技术如何追踪土壤无脊椎动物消费者体内膳食脂肪酸的营养转移过程，揭示脂质代谢机制与食物网生态学动态。该方法为研究隐蔽生态系统中的能量流动提供了重要工具。

脂肪酸¹³C同位素异构体分析为研究无脊椎动物消费者营养级碳转移及脂质代谢提供见解

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