新型被动透明化方法用于快速实现全中枢神经系统组织光学透明

psPACT 和 mPACT 方法的总体目标是在无需电泳组织透明化系统的情况下，快速实现整个中枢神经系统（CNS）组织的透明化。该方法有助于回答人类疾病研究模型领域中的关键问题，例如阿尔茨海默病、损伤与退行性病变以及肿瘤发生等。该技术的主要优势在于，小鼠中枢神经系统组织不会受到电泳透明化过程的损伤，并且可通过改良的被动透明化方法实现快速透明。

我们在使用原始的PACT和past方法进行脑组织透明化后，首次提出了本方法的构想。由于psPACT和mPACT方法包含多个样本制备阶段，因此该方法的可视化演示至关重要。首先通过将VA-044粉末加入含有4%PFA和4%丙烯酰胺的溶液中，配制终浓度为0.25%的PACT混合溶液。用PACT溶液灌注组织后，将完整的脑和脊髓完全浸入含有预冷PACT溶液的50毫升离心管中，并在4°C下保存24小时。

24小时后，将组织转移至含有新鲜冷PACT溶液的50毫升离心管中，并将管盖连接至与氮气罐相连的组织凝胶杂交系统，设置温度为37摄氏度。然后开启真空和气体流动，持续10分钟，使样本浸入氮气中。为使水凝胶聚合，将含有样本的离心管置于摇床培养箱中，在150 rpm和37摄氏度条件下孵育3小时，或直至聚合完成。

孵育结束后，使用吸水纸去除组织周围残留的聚合水凝胶。然后将组织转移至含有透明溶液的50毫升离心管中。将样品置于摇床培养箱中，在37摄氏度、150 rpm条件下振荡，直至组织完全透明。

通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明需要约20天。使用经4%多聚甲醛灌注并在4°C条件下用4%多聚甲醛后固定24小时的小鼠中枢神经系统开始psPACT操作。将固定后的组织在0.1摩尔PBS中洗涤1小时。

洗涤后，将组织转移至 A4P0 溶液中，在 37 摄氏度孵育 24 小时。第二天，用 PBS 洗涤组织 5 分钟后，将组织浸入含 0.25% VA-044 的 PBS 溶液中，在 37 摄氏度孵育 6 至 24 小时。将丙烯酰胺与后续的 VA-044 步骤分开，可避免去除围绕组织的未聚合水凝胶单体的需要，这些单体可能在通过 PACT 实现组织透明化后影响最终的组织完整性。

孵育结束后，将组织转移至新鲜的冷VA-044溶液中。然后将样品置于氮气中孵育10分钟。再将组织转移至透明化溶液中。

然后，将样品置于设定为37摄氏度、150 rpm的摇床培养箱中孵育，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统（CNS）达到完全透明平均需要约17天。对于mPACT，需遵循psPACT的实验步骤，直至清除溶液步骤。

然后，将含有0.5%α-巯基甘油（一种防褐变剂）和8% SDS的组织透明化溶液完全浸没组织样本，该溶液溶于0.1摩尔PBS中。将样本置于摇床培养箱中，设置温度为37°C、转速为150 rpm，持续孵育直至组织完全透明。通常情况下，使用mPACT方法仅需两周时间即可使小鼠中枢神经系统达到完全透明。

本研究中，经 mPACT 方案处理的小鼠脑组织样本在 14 天后即实现光学透明，快于经 PACT 和 psPACT 方案处理的样本。经 mPACT 清理的大鼠完整中枢神经系统样本在 20 天内达到最大程度的透明化。而成年大鼠单独脑组织（而非整个中枢神经系统）仅需五天即可通过 mPACT 完成透明化。

一旦掌握，若操作得当，使用小鼠全中枢神经系统可在两周内完成该技术。该技术建立后，为神经科学和解剖学领域的研究人员探索哺乳动物中枢神经系统模型中的病理生理学疾病——如组织损伤、发育畸形、癌症及神经退行性疾病——开辟了道路。