Name: 一种新的用于全中枢神经系统光透明快速生成的无源清除方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 了解psPACT和mPACT无源清除技术，用于快速实现小鼠和大鼠完整中枢神经系统组织透明化。该方法无需电泳系统，可在14至20天内完成组织透明，助力神经退行性疾病和肿瘤研究。

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本研究由延世大学医学科学BK21 PLUS项目资助。此外，本研究还得到了韩国国家研究基金会资助项目（NRF-2017R1D1A1B03030315）的支持。

所有操作均已获得延世大学医学院相应研究伦理委员会的批准。所有实验动物的处死均遵循延世大学医学院实验动物护理委员会的指南。
1. 试剂的准备
注意：多聚甲醛（PFA）、丙烯酰胺和十二烷基硫酸钠（SDS）为有毒刺激物，应在通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE；实验服、手套、护目镜）。
<ol>
	<li>4% 丙烯酰胺（A.A）溶液（A4P0）：将 20 mL 的 40% 丙烯酰胺溶液加入 180 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>0.25% VA-044 溶液：将 0.5 g 的 2,2´-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐（VA-044）粉末加入 200 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）中。VA-044 粉末可在室温下保存，但溶于 PBS 后必须在 4 °C 下保存。为获得最佳效果，仅配制实验所需量的溶液。</li>
	<li>PACT 混合液：将 10 g 丙烯酰胺加入 225 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液中，并用 4% PFA 定容至 200 mL。使用前，在 50 mL 锥形管中向 40 mL 该混合液中加入 100 mg VA-044 粉末。</li>
	<li>PACT 透明化溶液缓冲液：将 40 g 十二烷基硫酸钠（SDS）加入 350 mL 的 0.1 M PBS 中，并用 0.1 M PBS 定容至 500 mL。对于 mPACT 透明化溶液，需在 PACT 透明化溶液缓冲液中加入 0.5% α-巯基甘油。</li>
	<li>本研究使用的实验动物为 2 周龄的 BALB 雄性小鼠和 2 周龄的雄性 SD 大鼠。</li>
</ol>
2. 麻醉与灌注手术
注意：PFA 和丙烯酰胺为有毒刺激物，因此应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。
<ol>
	<li>在无病原体环境中，使用1 mL注射器和26号针头，以30 mg/kg剂量的唑拉西泮（zoletil）对动物进行麻醉。监测动物5–10分钟。</li>
	<li>当动物达到外科麻醉水平时，采用脚趾夹捏反应法评估麻醉深度，确认动物无反应性。 
	注意：以下涉及小鼠和大鼠手术的步骤遵循先前研究中使用的类似方案11。</li>
	<li>在肋骨下方穿过皮肤和腹壁做一道5–6 cm的切口。</li>
	<li>使用弯头钝头剪刀在膈肌上做切口，操作前通过触诊胸腔区域以确定切口位置。</li>
	<li>将切口沿整个肋骨长度方向延伸，以暴露胸膜腔。</li>
	<li>小心移开肺组织。沿肋骨切至锁骨处。使用虹膜剪刀在左心室后端做一小切口。将一支18号钝头或橄榄头灌注针插入升主动脉，并穿过切开的心室。</li>
	<li>用止血钳夹住心脏以固定针头并防止泄漏；或者，可使用改良止血钳夹住针尖周围的主动脉。</li>
	<li>在右心房处做一大切口，注意尽量避免损伤降主动脉。此时大鼠已准备就绪，可进行灌注。</li>
</ol>
3. 大鼠的全身灌注与解剖
注意：PFA 和丙烯酰胺为有毒刺激物，因此应在通风橱中佩戴适当的个人防护装备进行操作。
注意：以下完整灌注步骤与Woo et al.（2016）先前研究中使用的一种方案类似10,11。
<ol>
	<li>将心脏的右心房连接到一支18号针头上，注意避免引入任何气泡。</li>
	<li>使用50 mL注射器，快速而均匀地泵入50 mL含肝素（10单位/mL）的冷0.1 M PBS溶液。</li>
	<li>将18号针头连接至蠕动泵的管路。</li>
	<li>以10 mL/min的循环速度，用200 mL含肝素（10单位/mL）的冷0.1 M PBS溶液进行冲洗。</li>
	<li>以10 mL/min的循环速度，用250 mL冷的4% PFA溶液进行固定。此时大鼠应变得僵硬。</li>
	<li>收集并储存剩余的PFA溶液以待处理。</li>
	<li>对于PACT方法，使用预冷的PACT混合液（含4% PFA、4%丙烯酰胺和0.25% VA-044粉末）通过18号针头灌注组织，然后移除头部和脊柱。从颈部至鼻部做中线切口以暴露颅骨。此额外灌注步骤在psPACT和mPACT方法中无需进行；固定后应立即分离头部和脊柱，并暴露颅骨。</li>
	<li>通过去除残留的颈部和脊柱肌肉，暴露颅底。</li>
	<li>使用咬骨钳和剪刀剥离颅骨，取出脑组织和脊髓。</li>
	<li>将组织置于4% PFA中，4 °C保存；组织可保存长达1周。</li>
</ol>
4. 大鼠和小鼠中枢神经系统的水凝胶单体灌注与聚合
注意：丙烯酰胺、SDS、α-巯基甘油和多聚甲醛均为刺激性物质，因此应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备。
<ol>
	<li>PACT（被动透明化技术）
	<ol>
		<li>从固定后的小鼠和大鼠中分离并取出完整的中枢神经系统（脑和脊髓），放入含有冷的PACT混合液（含4% PFA、4% 丙烯酰胺和0.25% VA-044粉末）的50 mL离心管中，于4 °C保存24小时。确保组织完全浸没在溶液中。</li>
		<li>使用连接氮气罐的组织凝胶杂交系统，在氮气环境中孵育样品10分钟：将系统设置为37 °C。将组织转移至含有新鲜冷（4 °C）PACT混合液的50 mL离心管中，并盖紧管盖，然后开启真空。</li>
		<li>为使水凝胶聚合，将装有样品的离心管置于摇床培养箱中（150 rpm，37 °C）孵育3小时，或直至聚合完成。</li>
		<li>使用吸水纸（见材料表）去除组织周围残留的已聚合水凝胶。</li>
		<li>将组织转移至含有透明化溶液（0.1 M PBS中含8% SDS，pH 8.0）的50 mL离心管中。</li>
		<li>将样品置于设定为37 °C和150 rpm的摇床培养箱中，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明平均需要约20天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>psPACT（分步式被动透明化技术）
	<ol>
		<li>在洁净台中使用骨剪和剪刀从PFA固定的的小鼠和大鼠中分离完整的中枢神经系统（脑和脊髓）。</li>
		<li>将组织转移至含有4% PFA的50 mL离心管中，于4 °C保存24小时。确保组织完全浸没在固定液中。</li>
		<li>用0.1 M PBS清洗固定后的组织1小时，然后转移至A4P0溶液（0.1 M PBS中含4% 丙烯酰胺），于37 °C保存24小时。</li>
		<li>用0.1 M PBS清洗组织5分钟。</li>
		<li>将组织浸入含0.25% VA-044的0.1 M PBS溶液中，于37 °C保存6–24小时，然后转移至新鲜的0.25% VA-044/PBS溶液中。</li>
		<li>使用连接氮气罐的组织凝胶杂交系统（见材料表），在氮气环境中孵育样品10分钟：将组织转移至含有新鲜冷（4 °C）0.25% VA-044/PBS溶液的50 mL离心管中，并盖紧管盖，然后开启真空。</li>
		<li>将组织转移至透明化溶液（0.1 M PBS中含8% SDS，pH 8.0）中。</li>
		<li>将样品置于设定为37 °C和150 rpm的摇床培养箱中孵育，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明平均需要约17天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mPACT（改良型被动透明化技术）
	<ol>
		<li>在洁净台中使用骨剪和剪刀从PFA固定的的小鼠和大鼠中分离完整的中枢神经系统（脑和脊髓）。</li>
		<li>按照psPACT方案中的步骤4.2.2–4.2.8进行操作。</li>
		<li>将组织转移至透明化溶液中。注意，与PACT和psPACT方案不同，mPACT所需的透明化溶液除含有0.1 M PBS中的8% SDS（pH 8.0）外，还需添加0.5% α-硫甘油。α-硫甘油是一种抗褐变剂，有助于更快速且有效地实现组织透明化。确保组织完全浸没在溶液中。</li>
		<li>将样品置于设定为37 °C和150 rpm的摇床培养箱中，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明平均需要约2周时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 透明化中枢神经系统组织的折射率匹配与免疫染色
注意：nRIMS（基于Nycodenz的折射率匹配溶液）由0.8 g/mL Nycodenz粉末溶解于30 mL基础缓冲液（含0.01%叠氮化钠和Tween-20的0.1 M PBS，pH 8.0）中配制而成。建议将溶液置于37 °C摇床培养箱中，以确保粉末充分溶解。
<ol>
	<li>将组织在含有0.1% Triton X-100的0.1 M PBS中孵育2小时，然后在含有2%牛血清白蛋白（BSA）的0.1 M PBS中封闭6小时。</li>
	<li>用PBST（含0.1% Tween-20的0.1 M PBS）洗涤切片三次，每次2小时。加入一抗（本实验中为兔抗PECAM-CD31抗体，用于标记血管）在4℃孵育2天。</li>
	<li>在含有2% BSA的溶液中，加入二抗（本实验中为Cy3荧光标记的 goat anti-rabbit IgG）孵育切片2天。</li>
	<li>用PBST洗涤标记好的组织三次，每次2小时，然后将其置于15 mL nRIMS中保存2至10天。</li>
	<li>成像前，将标记好的组织转移至35 mm或60 mm组织培养皿中少量的nRIMS内，并用硅胶固定于培养皿底部边缘。</li>
	<li>加入1.5–2 mL新鲜的nRIMS。</li>
</ol>
6. 图像处理
<ol>
	<li>使用共聚焦激光扫描显微镜（见材料表）在10倍放大倍数下通过拼图扫描获取透明化组织的图像。对于Cy3标记的组织，使用550-600 nm波长。</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
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<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
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<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
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<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管PACT中采用的被动式、非电泳提取方法显著提高了此前组织透明化技术（如CLARITY2,3,4,7,8）所达到的一致性，但该技术仍存在若干不足，其中最突出的问题是实现最大组织透明度所需的时间较长12。在本研究中，我们提出了改进的PACT方案，可显著缩短组织透明化所需时间，同时仍能保持组织完整性和结构6,10。此外，我们首次展示了组织透明化方案在完整中枢神经系统组织以及更高级啮齿类动物模型——大鼠中的应用10。
具体而言，psPACT 在水凝胶形成...

科学研究与临床探究的一个基本目标是全面理解器官的结构与功能；然而，哺乳动物器官极其复杂的特性常常成为实现这一目标的障碍1。CLARITY（透明脂质交换丙烯酰胺杂化刚性成像兼容组织水凝胶）2,3,4技术通过在完整组织基础上构建丙烯酰胺水凝胶杂合体，可在保持组织结构完整性的前提下，实现包括脑、肝和脾在内的多种器官的光学透明化5。因此，CLARITY不仅实现了对组织的可视化观察，还提供了无需切片即可精细解析复杂细胞网络和组织形态学特征的机会。
为了实现组织透明化，CLARITY 采用电泳方法去除待测样本中的脂质成分。尽管 CLARITY 因可生成物理性质稳定的组织-水凝胶杂交材料而受到关注，但研究表明，其使用的电泳组织透明化（ETC）方法在组织质量方面结果不一，包括出现褐变、表位损伤和蛋白质丢失等问题5,6。为解决这些问题，研究人员已开发出改进方案，例如 PACT（被动透明化技术），该方法以被动的、基于离子型去垢剂的去脂技术取代 ETC 处理7,8,9。然而，尽管 PACT 在结果一致性方面有所提升，但其达到最大程度透明化所需时间更长。此外，目前这些技术均尚未应用于完整的中枢神经系统整体组织，也未在大鼠和豚鼠等较大的啮齿类动物模型中实现应用。
本研究旨在通过提出两种新方法——psPACT（分步处理的PACT）和mPACT（改良PACT），以克服上述局限，促进小鼠和大鼠模型中枢神经系统及内脏器官的快速透明化10。具体而言，psPACT在水凝胶形成过程中分两步进行组织处理，所用试剂为4%丙烯酰胺和0.25% VA-044；mPACT基本步骤相同，但在基于SDS的透明溶液中添加0.5% α-巯基甘油作为关键试剂。这两种技术均利用内源性的全身循环系统和脑脊液循环系统，显著缩短实现光学透明所需的时间。作为原理验证，我们展示了使用共聚焦显微镜分析透明化组织中血管结构的方法10。

<table><tbody><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>透明溶液</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS 溶液</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺溶液</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>聚合反应（A4P0）</td></tr><tr><td>2,2&amp;acute;-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>聚合反应（VA-044）</td></tr><tr><td>硫代甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>透明溶液（mPACT）</td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS 溶液</td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>灌注（PBS）</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS 溶液</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG Cy3 荧光偶联物</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>灌注，聚合</td></tr><tr><td>20X 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>灌注，缓冲液</td></tr><tr><td>10 mL 移液管</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>溶液转移</td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>透明化用管</td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>成像</td></tr><tr><td>共聚焦培养皿</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>成像</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>麻醉&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>灌注</td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>聚合反应（A4P0）</td></tr><tr><td>Whatman 3MM 滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>凝胶去除用吸水纸</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>成像</td></tr><tr><td>ZEN lite 软件</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>成像</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>灌注</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>组织凝胶杂交系统</td></tr></tbody></table>

新型被动透明化方法用于快速实现全中枢神经系统组织光学透明

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

自从CLARITY技术（一种生物电化学组织透明化技术，可实现透明组织内的三维表型定位）问世以来，一系列新型组织透明化方法相继建立，包括CUBIC（透明、无阻碍的脑成像试剂与计算分析）、SWITCH（全系统化学相互作用时间与动力学控制）、MAP（蛋白质组放大分析）和PACT（被动透明化技术），进一步拓展了生物组织显微分析的工具箱。本研究旨在改进并优化原始PACT方法，使其适用于多种完整的啮齿类动物组织，包括完整的中枢神经系统（CNS）、肾脏、脾脏以及整只小鼠胚胎。这些新方法被称为psPACT（过程分离型PACT）和mPACT（改良型PACT），为在完整正常及病变组织中绘制细胞环路和可视化亚细胞结构提供了高效手段。在以下实验方案中，我们将详细逐步说明如何通过psPACT和mPACT在最大程度透明化组织的同时，最小程度破坏其结构完整性。

利用优化的被动透明化技术构建整个中枢神经系统的透明模型
利用多种被动透明化技术，可快速实现小鼠和大鼠完整中枢神经系统组织的光学透明化（图1）。图2A展示了组织透明化随时间变化的示意图。与原始的PACT方法不同，psPACT（分步处理PACT）通过将样本依次用4%丙烯酰胺（A4P0）和0.25% VA-044引发剂溶液处理两个独立步骤，以形成水凝胶杂合物。mPACT（改良PACT）在psPACT基础上进一步优化，通过在8% SDS透明化溶液中添加0.5% α-巯基甘油来提高效果。在第14天经PACT、psPACT和mPACT处理的样本比较结果如图2B所示。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

本文介绍了两种新颖的方法——psPACT和mPACT，可用于实现啮齿类动物完整中枢神经系统组织血管结构的最大光学透明化，并进而进行显微分析。

自从CLARITY技术（一种生物电化学透明化技术，可实现透明组织内的三维表型定位）问世以来，……

psPACT 和 mPACT 方法的总体目标是在无需电泳组织透明化系统的情况下，快速实现整个中枢神经系统（CNS）组织的透明化。该方法有助于回答人类疾病研究模型领域中的关键问题，例如阿尔茨海默病、损伤与退行性病变以及肿瘤发生等。该技术的主要优势在于，小鼠中枢神经系统组织不会受到电泳透明化过程的损伤，并且可通过改良的被动透明化方法实现快速透明。我们在使用原始的PACT和past方法进行脑组织透明化后，首次提出了本方法的构想。由于psPACT和mPACT方法包含多个样本制备阶段，因此该方法的可视化演示至关重要。首先通过将VA-044粉末加入含有4%PFA和4%丙烯酰胺的溶液中，配制终浓度为0.25%的PACT混合溶液。用PACT溶液灌注组织后，将完整的脑和脊髓完全浸入含有预冷PACT溶液的50毫升离心管中，并在4°C下保存24小时。24小时后，将组织转移至含有新鲜冷PACT溶液的50毫升离心管中，并将管盖连接至与氮气罐相连的组织凝胶杂交系统，设置温度为37摄氏度。然后开启真空和气体流动，持续10分钟，使样本浸入氮气中。为使水凝胶聚合，将含有样本的离心管置于摇床培养箱中，在150 rpm和37摄氏度条件下孵育3小时，或直至聚合完成。孵育结束后，使用吸水纸去除组织周围残留的聚合水凝胶。然后将组织转移至含有透明溶液的50毫升离心管中。将样品置于摇床培养箱中，在37摄氏度、150 rpm条件下振荡，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统达到完全透明需要约20天。使用经4%多聚甲醛灌注并在4°C条件下用4%多聚甲醛后固定24小时的小鼠中枢神经系统开始psPACT操作。将固定后的组织在0.1摩尔PBS中洗涤1小时。洗涤后，将组织转移至 A4P0 溶液中，在 37 摄氏度孵育 24 小时。第二天，用 PBS 洗涤组织 5 分钟后，将组织浸入含 0.25% VA-044 的 PBS 溶液中，在 37 摄氏度孵育 6 至 24 小时。将丙烯酰胺与后续的 VA-044 步骤分开，可避免去除围绕组织的未聚合水凝胶单体的需要，这些单体可能在通过 PACT 实现组织透明化后影响最终的组织完整性。孵育结束后，将组织转移至新鲜的冷VA-044溶液中。然后将样品置于氮气中孵育10分钟。再将组织转移至透明化溶液中。然后，将样品置于设定为37摄氏度、150 rpm的摇床培养箱中孵育，直至组织完全透明。通常情况下，小鼠中枢神经系统（CNS）达到完全透明平均需要约17天。对于mPACT，需遵循psPACT的实验步骤，直至清除溶液步骤。然后，将含有0.5%α-巯基甘油（一种防褐变剂）和8% SDS的组织透明化溶液完全浸没组织样本，该溶液溶于0.1摩尔PBS中。将样本置于摇床培养箱中，设置温度为37°C、转速为150 rpm，持续孵育直至组织完全透明。通常情况下，使用mPACT方法仅需两周时间即可

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

一种新的用于全中枢神经系统光透明快速生成的无源清除方法

本文介绍一种快速、简便的方法，用于在半厚脑切片中对荧光标记的细胞进行成像。通过固定、切片并进行光学透明化处理脑组织，我们描述了如何利用标准的落射荧光或共聚焦成像技术，在完整的神经组织中观察单个细胞及神经元网络。...

一种用于半厚脑切片高分辨率荧光成像的快速方法

光学透明化技术正在彻底改变组织成像的方式。在本报告中，我们描述了对原始的“清除脂质-丙烯酰胺杂交的刚性成像兼容组织水凝胶”（CLARITY）方案所进行的改进，这些改进可获得更一致且成本更低的结果。...

小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

ACT-PRESTO（活性透明技术——基于压力的高效稳定大分子递送至器官）能够实现快速、高效且低成本的组织透明化，并通过被动扩散或压力辅助递送方式，促进抗体快速渗透入透明化组织。利用该方法，可对多种组织进行透明化处理，使用多种抗体进行免疫标记，并实现整体体积成像。...

ACT-PRESTO：用于大体积成像的生物组织透明化与免疫标记方法

抗体标记、光学透明化与先进光学显微镜技术的结合，可实现对完整结构或器官的三维分析。本文介绍一种简便的方法，将厚肾组织切片的免疫标记、肉桂酸乙酯光学透明化处理以及共聚焦成像相结合，从而实现对肾脏三维结构的可视化观察与定量分析。...

免疫标记肾组织的光学透明化与成像

神经元树突的形态通常与其功能相关。事实上，许多影响神经元发育的疾病过程均表现为形态学表型。本方案描述了一种简单而强大的方法，用于分析完整的树突分支及其相关的树突棘。...

通过CLARITY组织透明技术对完整神经元树突进行成像与定量分析

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。...

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

肿瘤类球体正越来越多地被用于评估肿瘤细胞与微环境之间的相互作用以及治疗反应。本方案描述了一种利用快速光学透明化技术对三维肿瘤类球体进行半高通量成像的稳健且简便的方法。...

用于肿瘤类球体半高通量分析的快速光学透明化

本方案提供了一种结合（的逐步操作流程，用于对数十个死后人类脑切片进行快速且同步的光学透明化、多轮标记及三维体积重建SWITCH - H2O2 - 抗原 R2,2'-硫代二乙醇的提取TDE])...

大规模人脑成像中用于光片荧光显微镜的光学透明化与标记技术

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

光学透明技术，例如吸收性分子溶液，可暂时减少光散射，以增强生物成像效果，并具有生物相容性和可逆性 体内...

利用吸收性分子实现短暂光学透明化 离体 和 体内 成像

了解psPACT和mPACT无源清除技术，用于快速实现小鼠和大鼠完整中枢神经系统组织透明化。该方法无需电泳系统，可在14至20天内完成组织透明，助力神经退行性疾病和肿瘤研究。

新型被动透明化方法用于快速实现全中枢神经系统组织光学透明

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