Name: 成年大鼠脊髓侧性横断与不对称行为评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学习成年大鼠脊髓侧性横断手术技术，建立模拟Brown-Sequard综合征的动物模型，并通过开放式场地测试、网格行走评估等行为学方法检测不对称运动缺陷，为脊髓损伤的神经功能恢复研究提供可靠的实验基础。

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感谢 Jeffrey Recchia-Rife 先生提供的出色技术协助。本工作部分得到了中国人民解放军济南军区总医院院长基金（2016ZD03 和 2014ZX01）（XJL 和 TBZ）的资助。徐实验室的研究得到了美国退伍军人事务部 NIH 1R01 100531、1R01 NS103481 以及 Merit Review Award I01 BX002356、I01 BX003705、I01 RX002687 的支持。

所有外科手术和动物操作均依照《实验动物护理和使用指南》（美国国家研究委员会）以及印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会指南的规定批准后进行。
1. 一般注意事项
<ol>
	<li>本研究使用成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠（体重200 g，n=12）。在手术前一周，使动物适应所有测试环境，并收集所有行为学测试的基线数据。</li>
	<li>由两名对实验分组不知情的观察者进行行为学评估。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>用70%乙醇清洁手术台。在手术台上放置预热的加热垫。用无菌手术单覆盖手术区域。将无菌纱布、棉签和高压灭菌的手术器械放置在手术单表面。</li>
	<li>开启微珠灭菌器，用于手术间器械的灭菌。 
	注意：本实验所用器械示例见图1。</li>
	<li>通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（87.7 mg/kg）和赛拉嗪（12.3 mg/kg）麻醉大鼠。通过脚趾夹捏刺激无反应来确认达到适当的麻醉深度。在动物眼睛上涂抹兽用眼膏，以防止手术期间角膜干燥。</li>
	<li>通过剃毛去除胸椎部位的毛发（图2A）。使用配备HEPA过滤器的真空装置清除剃除的毛发。</li>
	<li>用碘伏消毒液和乙醇交替擦拭三次，清洁手术区域。</li>
	<li>用带有切口窗的无菌手术单覆盖动物（图2B）。注意：视频中为便于演示，省略了手术单。&#160;</li>
</ol>
3. 脊髓半切术
<ol>
	<li>触摸 13th 肋骨，即大鼠中最下方的一根肋骨，为不与胸骨相连的浮肋。沿第13th 从背部辨认肋骨，确定其与第13胸椎（T13）的连接，然后向上计数以确定第10胸椎（T10）。</li>
	<li>使用手术刀片（#15， 图1在背部第8至第11节段区域的中线处进行3-4 cm的皮肤切口th 椎骨棘突</li>
	<li>在手术显微镜下，使用同一手术刀片，从棘突处开始，沿两侧钝性分离并解剖胸9和胸10椎体的椎旁肌肉，直至关节突。 
	注意：该方法可有效分离组织，同时避免出血。</li>
	<li>使用改良的固定支架稳定脊柱。在侧方椎骨两侧各做一个切口。将不锈钢臂滑入暴露的横突关节面下方，并拧紧螺丝以确保稳定性。</li>
	<li>使用拉钩将肌肉从手术区域牵开（图2B）并暴露第8至11胸椎椎板和棘突（图 2C). 
	注意：T8 与 T9 棘突之间存在较大间隙，可作为识别 T9 的解剖标志图 2C，背侧观）。从侧方观察，T9 椎体的棘突朝向尾侧，T10 椎体的棘突朝向背侧，T11 椎体的棘突朝向头侧；因此，这 3 个棘突形成一个金字塔结构，其中 T10 椎体的棘突位于顶点（图 2D，侧视图）。</li>
	<li>使用咬骨钳对T9椎骨进行背部椎板切除术。剪除T9棘突，并去除椎板位于中线左侧的一小部分。图3A，虚线）以及尽可能向外侧切除椎板的整个右侧部分（图3A，虚线）。进行椎板切除时，将咬骨钳轻轻插入椎板下方，每次剪除一小块骨质，直至完成所需范围的椎板切除。图3B 和 图3C).</li>
	<li>在手术显微镜下，辨认脊髓的背侧中线（图 3C）。将一根针头（30 G）垂直穿过中线插入脊髓，针头斜面朝向右侧（图 4A). 
	注意：针头应穿透整个脊髓，到达椎管的腹侧壁。</li>
	<li>使用一小块无菌明胶海绵止血。</li>
	<li>将虹膜切除/显微手术剪的一侧刀尖插入中线针道，另一侧刀尖沿右侧半侧索外侧表面插入，然后用剪刀对右侧半侧索进行完全切断（图4B). 
	注意：使用锋利的显微剪进行脊髓切割，以尽量减少切割过程中对脊髓造成的压迫性损伤。</li>
	<li>使用同一根针的侧缘作为刀具，切开病灶间隙，以确认右侧半横断完全。通过手术显微镜观察椎管底部，验证右侧半横断的完整性。图4C，横截面视图； 图 4D，侧视图； 图4E，背侧视图）。</li>
	<li>在病变部位上方放置一小块明胶海绵（图4F）。使用骨水泥混合物在海绵体与T8和T10棘突之间构建一座狭窄的桥图4G，H). 
	注意：使用水泥桥的目的有两个：1）将损伤部位形成的瘢痕与周围组织隔离开；2）便于在动物处死后解剖取出脊髓节段。</li>
	<li>用4-0丝线分别缝合肌肉层和皮肤层。</li>
	<li>皮下注射0.9%无菌生理盐水以维持水合状态。每天皮下注射镇痛剂布托啡诺（Buprenorphine，0.05–2.0 mg/kg）1–2次，每次间隔8–12小时，持续2天。在第一周内每日挤压膀胱2–3次，随后几周减少至每日1–2次，直至自主排尿功能恢复。</li>
</ol>
4. 术后动物护理
<ol>
	<li>将动物放回其单独饲养的笼具中。在笼底提供湿润的啮齿类动物饲料或凝胶，以帮助动物进食和补水。在术后恢复期间，在笼具下方放置加热垫。确保加热垫仅覆盖笼底的一半区域，以避免过热。</li>
	<li>皮下注射0.9%无菌生理盐水以维持水合状态。术后2天内，每天皮下注射镇痛剂布托啡诺（Buprenorphine，0.05–2.0 mg/kg S）2次，每次间隔8–12小时。术后第一周每日挤压膀胱2–3次，之后几周每日1–2次，直至自主排尿功能恢复。</li>
</ol>
5. 评估单侧半横断步态（UHS）
注意：单侧半切步态（UHS）测试是直接评估脊髓损伤（SCI）动物在开放场地中使用同侧后肢能力的方法。如1.1节所述，动物在测试前需适应开放场地环境（直径42英寸）15，每天两次，持续7天。测试由两名对动物分组不知情的观察者进行。将在基线期（T9 HX手术前7天）以及损伤后的各个时间点采集UHS评分。评估步骤如下所述。
<ol>
	<li>将动物放入开放场地环境中，观察其4分钟内的运动情况。 
	注意：测试过程中可适当鼓励动物积极活动。</li>
	<li>根据表1提供的评分表，对每项行为类别以“是”记1分、“否”记0分，最后将各项得分相加，得到最终的UHS评分（0–8分）。 
	注意：根据表1，评分标准如下：0分：后肢无可见运动；1–4分：后肢三个关节（髋、膝、踝）出现独立运动；5分：有扫动动作但无法承重；6分：可放置但无法承重；7分：可放置并部分承重；8分：可迈步并承重。</li>
	<li>在基线期（T9 HX前7天）以及损伤后的各个时间点采集UHS评分。 
	注意：将在T9 HX后的多个时间点进行评分评估。</li>
</ol>
6. 偶联
<ol>
	<li>通过录像记录动物在狭窄跑道装置或简单开放场地中行走的过程，分析其步态协调性（CPL）。</li>
	<li>在表1的协调性（CPL）部分，针对每项CPL类别，评分为0分表示“无”，1分表示“不规则/笨拙”，2分表示“正常”。 
	注：CPL测试用于评估肢体交替运动的协调能力，包括同源侧CPL（前-前肢/后-后肢，图5A）、对角线CPL（左前-右后或右前-左后肢，图5B）以及同侧CPL（同一侧的前-后肢，图5C）。在T9节段半横断（HX）损伤后，同侧后肢功能缺陷变得明显，导致同源侧CPL（图5D）、对角线CPL（图5E）和同侧CPL（图5F）的节律发生紊乱。</li>
</ol>
7. 放置电极
注意：后肢接触放置试验用于评估后肢对本体感觉刺激的运动整合反应16。如果动物在后肢被拉至表面以下后能用后肢向上迈步至表面，则认为其本体感觉功能完整。
<ol>
	<li>将动物保持垂直位置，使两侧后肢均可用于进行放置反应测试。</li>
	<li>轻轻向前刷拭后肢背侧表面，使其接近某一表面边缘（例如，动物操作台）。</li>
	<li>观察足部在表面上的放置情况，并评定后肢接触放置评分。0：无放置反应；1：有放置反应。 
	注：后肢背侧表面接受刺激后，若反射功能完整，足部会随之伸展并放置于表面上。评估表亦见表1。</li>
</ol>
8. 网格行走
注意：网格行走实验用于评估自发性运动功能缺陷以及精确迈步、协调性和准确足部放置所涉及的肢体运动。
<ol>
	<li>将一只大鼠放置在抬高的塑料涂层金属丝网格（36 × 38 cm，孔径为 3 cm2）上，使其在平台上自由行走 30 步。</li>
	<li>分别记录每只肢体的总步数和踩空步数。通过视频录像确认计数结果。 
	注意：由两名不知分组情况的观察者评估动物行走时前肢和后肢的足部放置情况。</li>
	<li>根据以下标准为每只后肢分配网格行走评分：0 分：踩空步数大于 15；1 分：踩空步数小于或等于 15；2 分：踩空步数小于或等于 10；3 分：踩空步数小于或等于 5。 
	注意：评分评估依据表 1。评分截断值用于衡量运动功能缺损的严重程度。</li>
</ol>
9. 灌注与组织处理
<ol>
	<li>在与步骤 2.3 相似的适当麻醉后，按照经心脏灌注方案小心灌注动物17。</li>
	<li>解剖并采集脊髓样本，并在 4% 多聚甲醛中后固定过夜。</li>
	<li>随后可将样本转移至 30% 蔗糖溶液中。</li>
	<li>将脊髓切成横截面，并根据标准操作流程，使用轴突标志物 SMI-31 和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）对所选切片进行染色18。</li>
</ol>

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<li>Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+histological+and+locomotor+outcomes+after+spinal+cord+contusion+using+the+NYU+weight-drop+device+versus+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection.</a> Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+gait+impairment+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats+using+an+automated+computer-aided+control+system%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system.</a> Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).</li>
<li>Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+non-motor+symptoms+in+Parkinson%27s+disease%3A+focus+on+pharmacological+interventions+targeting+affective+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiors+in+Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions.</a> Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290(2014).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

本研究中，我们报道了在成年大鼠中制备T9脊髓半切损伤（HX）的逐步操作流程，该模型简单、稳定且可重复，能够模拟人类的布朗-塞卡尔综合征。我们进一步提出了一种联合行为评分系统（CBS-HX），通过单侧后肢迈步（UHS）、步态协调（CPL）、放置接触以及网格行走等指标的组合，灵敏地评估神经功能的不对称性损伤及恢复进程。尽管本研究展示了T9水平的损伤操作，但该方法可简便且无需复杂调整地应用于脊髓的其他区域，包括颈段和腰段。我们希望该模型结合单侧化的行为学评估方法，能为研究此类脊髓损伤（SCI）的发病机制及治疗效果提供有效工具。
由于侧方HX模型仅损伤脊髓同侧的一半，对侧脊髓大部分得以保留，可作为内部对照。许多下行和上行通路呈单侧投射，因此在多数情况下，侧方半切会损伤一侧的轴突束，而对侧的相同通路则保持完整，从而可在同一只动物体内比较这些通路的重组情况及其功能后果。此外，制造更局限的损伤可能有助于靶向特定通路。例如，腹侧和腹外侧损伤可能影响网状脊髓通路和前庭脊髓通路；背侧或背外侧损伤则可能影响皮质脊髓通路和红核脊髓通路。半切或部分损伤模型也可用于研究其他通路的解剖与功能，如脊髓固有通路、去甲肾上腺素能通路或5-羟色胺能通路。因此，半切模型可独特地用于研究感觉传入纤维、下行通路以及脊髓内在环路的代偿作用。该模型也适用于探究HX后运动功能恢复的机制。
外侧HX会导致明显的行为障碍，可通过运动任务（如Treadscan或跑步机）范式进行自动步态分析来评估19。此外，可通过电生理记录测量病灶对侧轴突束的传导性，该评估为确定不同治疗后功能重组的可能性提供了依据。同时，向特定通路的神经元单侧注射解剖示踪剂，可实现对顺行标记的跨越中线纤维及其与逆行标记神经元连接的可视化20,21,22,23,24,25。
尽管典型的脊髓HX手术通常不到20分钟即可完成，但要实现精确且一致的HX仍需一定练习。首先，必须确保不同动物之间的脊髓HX节段保持一致，因此准确识别椎板切除术所对应的椎体节段至关重要。其次，应确保HX操作完全彻底。为完成完整的HX，可使用一支30号针头垂直插入中线，以此引导显微剪进行切割。针头的插入还可避免损伤后方的脊髓血管或脊髓组织。30号针头的第二个作用是可作为刀具沿切口划痕，以确保损伤边界清晰明确。第三，在损伤部位覆盖明胶可减少脑脊液渗漏，而在明胶上方涂抹牙科水泥并使其跨越椎板，可增强损伤部位脊椎的稳定性，促进伤口愈合。为避免对电生理记录信号造成干扰，肌肉、筋膜和皮肤应使用4-0丝线逐层缝合。最后，应尽一切努力减少对对侧脊髓的损伤。应通过组织学验证确认一侧脊髓实现完全的半横断，而另一侧脊髓的半侧结构得以完整保留（如图6E所示）。
为了改善脊髓损伤（SCI）后的运动功能，以往的研究采用了多种策略，包括细胞移植、轴突再生8,18,26,27以及基于活动的康复训练28,29,30。同时，已有多种行为学测试被建立，用于脊髓损伤后的功能评估及最佳治疗方案的筛选。BBB运动功能评分量表最初是为评估脊髓对称性损伤（例如中线挫伤或横断性损伤）所致的双侧后肢功能而设计的14,31。BBB评分中的某些参数，如协调性和足趾离地高度，需通过观察双侧后肢来记录。当一侧后肢功能正常而另一侧因非对称性损伤出现功能障碍时，正常后肢的表现会干扰受损后肢的评分。由于BBB评分无法在单侧损伤后将一侧后肢的功能与另一侧分开评估，因此并不适用于单侧脊髓损伤的评估。然而，若对每侧肢体的关节活动、负重能力等指标进行独立评估，并不将其纳入BBB总分计算，则正常后肢（类似于假手术对照）不会干扰受损后肢的评分结果。此外，正常侧也不会影响动物整体的评分，因为正常后肢在关节活动、负重及迈步方面并无显著功能缺陷。
半切术综合行为评分旨在对侧向半切大鼠模型的行为恢复进行敏感且易于实施的评估。该评分可用于评估恢复早期和晚期阶段的行为表现。早期阶段为损伤后7-10天内。在HX术后前3-5天，同侧后肢活动逐渐增加，应更频繁地进行评估，以记录自发性或治疗介导的后肢运动恢复情况。术后5-7天，大鼠开始出现无承重支撑的扫动式后肢运动。术后7-10天，大鼠通常开始能够站立并迈步。在此阶段，应重点关注其迈步模式。在晚期阶段（14-28天），同侧后肢活动趋于稳定，并接近正常水平。
还应密切关注耦合（CPL）能力。CPL测试（步态耦合）可通过视频系统（如Treadscan/Catwalk）或在开放场测试中进行摄像来完成。若研究人员无法使用步态分析系统，第二种方法提供了更大的灵活性。对于两次视频记录，本测试要求每只脚至少完成两次连续的着地。在分析过程中，包含三个耦合参数：同源耦合、同侧耦合和对角耦合（步骤6.2）。每种耦合均涉及一个参考足和一个给定足。以同源耦合（前左-前右，或后左-后右）为例，其值为给定足首次着地时间除以参考足一个完整步态周期的时间。由于左右足应处于反相位，理想的耦合值应为0.5。同侧耦合（前左-后左，或前右-后右）的情况亦相同。然而，对于对角耦合（前左-后右，或前右-后左），理想耦合值应为0或1，因为两足应处于同相位。在步骤6.4中，我们对每项CPL评分设定为0至2分。具体而言，评分为0表示给定足无法移动完成着地，因此无耦合值；评分为1表示存在任何不规则或笨拙的耦合，即给定足完成了着地，但未达到理想耦合状态；评分为2则表示达到了理想的0.5耦合值。上述三种耦合参数的概念在先前的研究文献中已有详细描述32,33。CPL可与接触放置和网格行走评估相结合。在不同SCI大鼠模型中，该综合行为评分系统的各个组成部分的有效性可能有所不同。对于CPL而言，交替频率和序列完整性方面的缺陷会变得明显可见。单侧HX术后，本体感觉性后肢放置缺陷可被清晰揭示。在本研究中，所有大鼠均表现出同侧后肢放置缺陷，而对侧后肢放置则无明显缺陷。当涉及皮质脊髓束的接触放置开始恢复时，应考虑进行网格行走测试。为排除任何可能的疲劳影响，每次测试时可对行为学测试的顺序进行随机化处理。
总之，我们报道了可重复地建立的逐步操作流程 体内 模拟人类布朗-塞卡尔综合征的T9脊髓半切大鼠模型。脊髓半切的联合行为评分系统可对单侧脊髓损伤后的个体后肢行为结果进行更具区分度的评估，有助于损伤机制和治疗方法的研究。尽管本文仅提供了胸段脊髓半切手术操作及行为学评估的可视化描述，但所述方法也可适用于其他不同损伤节段的不完全性脊髓损伤模型。

不完全性脊髓损伤（SCI）常导致感觉运动功能严重且持久的损害，在临床上是最常见的SCI类型1。人类的布朗-塞卡尔综合征（Brown-Séquard syndrome）由脊髓半侧损伤引起，表现为损伤同侧（即同侧损伤侧）出现瘫痪和本体感觉丧失，而在对侧（即对侧损伤侧）出现痛觉和温度觉丧失2,3,4。脊髓侧半切动物模型被广泛用于模拟人类布朗-塞卡尔综合征，已有多个实验室在不同脊髓节段报道了大鼠5,6,7,8,9、负鼠10和猴7,11,12,13的相应模型。然而，目前尚未有详细可视化的方法描述如何制备标准的脊髓侧半切模型。提供侧半切操作的分步流程将有助于优化该模型，并促进基础与转化研究中实验结果的比较与重复。
单侧脊髓损伤（SCI）会导致不对称且不均衡的行为功能缺陷，而传统的对称性损伤评估方法难以准确测量此类缺陷。因此，建立一种评估单侧SCI神经功能障碍的适当方法，是构建单侧SCI模型的关键环节。尽管单侧脊髓损伤具有重要作用，但目前尚缺乏用于评估此类损伤动物感觉运动功能缺陷的标准化方案。Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）运动功能评分量表是评估成年大鼠SCI后功能最常用的指标14，可对整体运动功能提供半定量描述，但无法独立评估每侧后肢的功能。
在本研究中，我们报告了在第9胸椎水平逐步制备啮齿类动物脊髓半横断的详细步骤th 胸段（T9）椎体水平。我们还介绍了一种用于半切损伤的综合行为评分量表（CBS-HX），该量表包括单侧后肢迈步（UHS）、肢体协调、放置接触以及网格行走评估，用于评价单侧脊髓损伤后的神经功能缺损及恢复情况。我们希望该模型能成为研究单侧脊髓损伤机制及治疗效果的有效模型。

<table><tbody><tr><td>婴儿-米斯特止血钳</td><td>FST</td><td>13013-14</td><td>可选用任意品牌</td></tr><tr><td>带塑料涂层的 elevated 金属丝网架</td><td>任意</td><td></td><td>36&amp;times;38 cm，孔径 3 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>明胶海绵</td><td>Moore Medical</td><td>2928</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>抓握式骨水泥套装（粉末和溶剂）</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>微珠灭菌器</td><td>FST</td><td>NA</td><td>可选用任意品牌</td></tr><tr><td>佩尔森咬骨钳</td><td>FST</td><td>16015-17</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>牵开器</td><td>Jinxie surgical tools</td><td>6810</td><td>可选用任意品牌</td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td>可选用任意品牌</td></tr><tr><td>Simplex-P 骨水泥</td><td>Stryker</td><td></td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>TreadScan 自动步态分析系统</td><td>CleverSys Inc</td><td>NA</td><td>可选用任意品牌</td></tr></tbody></table>

成年大鼠脊髓侧方半切术及不对称行为学评估

Spinal Cord Lateral Hemisection and Asymmetric Behavioral Assessments in Adult Rats

不完全性脊髓损伤（SCI）常导致感觉运动功能障碍，在临床上是最常见的SCI类型。人类布朗-塞卡尔综合征&#160;是一种由脊髓半侧损伤引起的常见不完全性脊髓损伤，可导致瘫痪及感觉丧失&#160;本体感觉&#160;与损伤同侧（或同侧）出现运动功能丧失，对侧（或对侧）出现痛觉和温度觉丧失。建立可靠的布朗-塞卡尔综合征动物模型，必须具备适当的脊髓半切（HX）造模方法及神经功能缺损评估手段。尽管脊髓侧半切模型在基础与转化研究中具有重要作用，但目前尚缺乏标准化的半切手术操作及单侧功能评估方案。本研究旨在逐步描述在大鼠第9th 胸段（T9）脊髓水平。随后，我们描述了一种用于Hx的联合行为评分量表（CBS-HX），该量表可对单侧脊髓损伤（SCI）的非对称性神经功能表现进行简单而敏感的评估。CBS-HX评分范围为0至18分，由4项独立评估组成，包括单侧后肢迈步（UHS）、肢体协调、接触放置和网格行走。在CBS-HX中，同侧与对侧后肢需分别进行评估。我们发现，在T9节段Hx损伤后，同侧后肢表现出行为功能受损，而对侧后肢则显示出显著的功能恢复。CBS-HX能够有效区分同侧与对侧后肢的行为功能差异，并能检测同侧后肢功能随时间恢复的进程。CBS-HX的各项组分可根据需要单独分析，或与其他评估指标联合使用。尽管本文仅提供了胸段Hx手术操作及行为评估的可视化描述，但该方法的原理可推广应用于其他不完全性脊髓损伤及不同损伤节段的情况。

上述手术步骤可在T9节段稳定且可重复地制备侧方半横断损伤（HX）。灌注并去除皮肤后，可通过残留的缝线在T9处清晰识别手术部位（图6A）。进一步解剖可逐层暴露水泥桥（图6B）和明胶海绵（图6C）。随后，脊髓从开放的椎管中暴露出来，可确认右侧脊髓的侧方半横断（图4D）。通过观察暴露的椎体和肋骨，可进一步确认损伤节段（图6D）。在损伤中心处进行横断面免疫荧光染色，结果显示损伤同侧右侧半脊髓完全缺失，而对侧左侧半脊髓得以保留。该切片使用轴突标志物SMI-31和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）进行染色（图6E）。
在神经行为学方面，CBS-HX 系统能够检测 T9 半切术（HX）后随时间推移出现的不对称性功能缺陷。HX 后，同侧后肢丧失了迈步能力，而对侧后肢则保留了行走能力。对于每一项行为学指标，我们进行了 3 次重复试验，并以 3 次试验的平均值进行量化和分析。我们采用术前测量值作为基线，认为这是相较于使用其他大鼠更为准确的对照。四项独立指标（即 UHS、CPL、接触放置和网格行走）可分别进行分析（图 7A-D），也可合并为综合 CBS-HX 评分（图 7E）。双因素方差分析显示，同侧与对侧之间在 UHS（F = 23.199，p &lt; 0.001）、耦合（F = 8.376，p &lt; 0.01）、接触放置（F = 17.672，p &lt; 0.001）、网格行走（F = 19.261，p &lt; 0.001）以及 CBS-HX 综合评分（F = 20.897，p &lt; 0.001）方面均存在显著差异。图 7A 显示了 T9 HX 后 UHS 的结果。损伤后前 3 天内，大鼠丧失迈步能力，同侧后肢评分为 0–2 分。损伤后 7–10 天，同侧开始出现类似迈步的动作，多数为背侧迈步。至 T9 HX 后 28 天，大鼠能够完成跖侧迈步，协调性几乎恢复正常，UHS 评分为 8 分。作为对照，对侧后肢功能受干扰较小，UHS 评分在 T9 HX 后前 5 天内短暂下降，但于损伤后第 10 天恢复至基线水平。在总 CPL（包括同侧、同源及对角耦合）测试中，T9 HX 后协调性的稳定性和适应性均明显降低（图 7B）。损伤后 1–5 天，HX 动物未表现出 CPL。随着时间推移，同侧后肢逐渐出现 CPL，但动作常表现为笨拙、不稳，且在速度、力度和方向上变化异常。同侧后肢的接触放置（图 7C）和网格行走（图 7D）也受到 T9 HX 的影响，尤其在损伤后前 5 天内表现明显，通常在动物开始完成跖侧迈步后逐渐恢复。综合 CBS-HX 系统包含 UHS、CPL、接触放置和网格行走四项测试，最高总分为 18 分（图 7E）。同侧后肢的运动功能在 T9 侧方 HX 后 CBS-HX 评分下降，这与人类布朗-塞卡尔综合征（Brown-Séquard syndrome）中观察到的功能缺陷一致。与对侧后肢相比，同侧后肢的运动功能在 T9 侧方 HX 后第 1 天至第 4 周期间 CBS-HX 评分持续降低（图 7E）。
因此，结合UHS、CPL、接触放置和网格行走的复合CBS-HX系统可用于评估胸段脊髓侧向损伤后大鼠的行为功能，最高可能评分为18分。
<img alt="手术器械示意图；手术刀、止血钳、剪刀、针、镊子、手术拉钩。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 用于制作T9右侧半横断的手术工具。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="大鼠脊柱手术装置；示意图显示手术情境下的 T8-T11 椎骨。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 手术暴露。 A) 剃除覆盖手术区域背部的毛发。B) 使用牵开器将肌肉从手术区域牵开。C) 暴露 T8-11 椎体的椎板，并辨认各个棘突（箭头）。注意 T8 与 T9 棘突之间存在较大间隙，此为识别 T9 的解剖标志。D) 示意图显示棘突的侧视图。T9-11 棘突形成一个金字塔结构，其中 T10 棘突为顶点。同样，T8 与 T9 棘突之间的明显间隙可作为识别 T9 的标志，此处将进行椎板切除术。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="T9 椎板切除过程；示意图（A，B）和手术结果（C）；脊柱外科技术。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 椎板切除及右侧半脊髓暴露。A) 示意图显示了T9椎体内脊髓的横截面。虚线表示每侧椎板切除的范围。B) 示意图显示左侧椎板被切除一小部分，右侧则完全切除整个椎弓。箭头指示脊髓的背侧中线。C) 暴露的脊髓背侧观。注意背侧静脉位于脊髓中央，分隔左右半脊髓。右侧半脊髓已完全暴露。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脊髓T9半切示意图，明胶海绵，骨水泥应用，外科实验" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 侧半切. A-D) 示意图显示从中线插入针头至脊髓的过程 （A）， T9半切术 （B） 明胶海绵和骨水泥覆盖（C），以及T9节段侧方半横断的侧位观 (D). C图中的虚线标出了移除的T9椎板及右侧半脊髓。 E) 右侧脊髓半切术的背侧观。 F) 在半切部位上方放置一小块明胶海绵。 G-H) 在T8和T10棘突及海绵状结构上方构建的Simplex-P骨水泥桥。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经耦合示意图；同源、对角、同侧；正常、半切；神经科学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 耦合（CPL）测试的示意图。 CPL测试用于评估肢体交替运动的协调性，包括A) 同源CPL（前-前/后-后肢）、B) 对角CPL（左前-右后/右前-左后肢）和C) 同侧CPL（同侧前-后肢）。在T9半切（红色方框，D-F）后，同源(D)、对角(E)和同侧(F) CPL中均可见同侧肢体功能缺陷，动物表现出协调性丧失。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下脊髓损伤愈合阶段，GFAP/SMI31免疫染色，500µm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 组织解剖与组织学分析。 灌注后，解剖组织以暴露脊髓。横切面进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞标志物）和SMI31（轴突标志物）的双重免疫荧光染色。A) 缝合线暴露，作为损伤部位的解剖标志（黄色箭头）。B) 暴露牙科水泥（黄色箭头）。C) 暴露明胶海绵（黄色箭头）。D) 确认右侧脊髓半横断（黄色箭头）。E) 损伤中心处脊髓横切面，经GFAP（绿色）和SMI31（红色）免疫染色。结果显示右侧脊髓半侧完全切断，左侧半侧保存良好。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="行为恢复曲线图；单侧半横断，同侧/对侧，评分与天数关系示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57126/57126fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7. 神经行为学评分结果。 图中显示了5项指标的评分结果：A，单侧半横断评分（UHS）；B，协调性（CPL）；C，接触放置；D，网格行走实验；以及E，T9节段脊髓半横断术后同侧与对侧后肢的综合行为评分（CBS）。数据以均值±标准误表示。*：p &lt; 0.05，**：p &lt; 0.01，***：p &lt; 0.001（同侧与对侧后肢间比较，双因素方差分析，Tukey多重比较检验，n = 12只大鼠/组）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57126/57126fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>子评分名称/范围</td>
			<td>描述</td>
			<td colspan="2">评分</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>单侧后肢迈步</td>
			<td rowspan="2">可见轻微的后肢运动</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(UHS)</td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(0-8)</td>
			<td rowspan="2">踝关节运动</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="2">膝关节运动</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="2">髋关节运动</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="2">扫动（无负重）</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="2">放置反应（无负重）</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>放置反应（有负重）</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="2">迈步</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>协调性</td>
			<td rowspan="3">同侧协调</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(0-6)</td>
			<td>不规则/笨拙</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>正常</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="3">同源协调</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>不规则/笨拙</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>正常</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td rowspan="3">对角协调</td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>不规则/笨拙</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>正常</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>接触放置</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>无</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(0-1)</td>
			<td>有</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>网格行走</td>
			<td rowspan="4">漏步</td>
			<td>&gt;15</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(0-3)</td>
			<td>≤15</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>≤10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>≤5</td>
			<td>3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总CBS-HX评分</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(0-18)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1： 半切术综合行为评分（CBS-HX）

本文描述了一种可靠的脊髓侧半横断（HX）手术操作步骤，该手术在第9节段进行th 成年大鼠胸段水平的损伤及用于检测此类单侧损伤后不对称性功能缺损的神经行为学评估。

不完全性脊髓损伤（SCI）常导致感觉运动功能障碍，在临床上是最常见的SCI类型。人类...

本方案提供了一种可靠的脊髓侧方半切动物模型，可模拟人类布朗-塞卡尔综合征，并提供了一种新的联合行为评分量表，用于评估不对称的行为功能缺损。该小鼠半切模型有助于进一步理解人类布朗-塞卡尔综合征中出现的神经功能障碍。与您提到的其他评估方法不同，我们新开发的联合行为评分量表可适用于任何需要评估不对称性、运动能力及实验室内功能缺损的模型。利用这一稳定且符合自然解剖特征的半横断模型，有助于在基础研究与转化研究之间对实验结果进行比较。然而，对于初学者而言，使用该模型获得一致的结果可能存在困难。其中关键步骤是将针头垂直置于中线位置，以此作为诱导损伤的引导。观看本视频后，您应充分了解如何实施手术和行为学实验操作。在实验当天，使用70%乙醇清洁手术台，并将预热的加热垫放置于台面上。用无菌手术单覆盖手术区域后，确认麻醉大鼠对脚趾夹捏无反应。涂抹眼膏以防止动物角膜干燥，并剃除覆盖胸椎区域的毛发。随后，使用碘伏和乙醇交替擦拭三次，清洁暴露的皮肤。当动物准备就绪后，定位第十三根肋骨，并沿肋骨向背侧追踪，确定其与第13胸椎（T-13）的连接处。向上计数以确定第9胸椎（T-9），使用15号手术刀片在第8至第11节椎体棘突上方做一条3至4厘米长的正中皮肤切口。将大鼠移至手术显微镜下，钝性分离两侧椎旁肌，使其从棘突向外侧分离至T-9和T-10椎体的关节突部位。使用改良的固定支架稳定脊柱，在两侧椎骨外侧壁上切开小口，将支架的不锈钢臂插入暴露的横突关节面下方。拧紧螺丝以固定支架，并使用量角器暴露第8至第11胸椎椎板及棘突。使用咬骨钳剪除第9胸椎棘突，切除椎板中线左侧的一小部分以及整个右侧椎板，尽可能向外侧扩展。然后将咬骨钳轻轻插入椎板下方，每次咬除一小块骨质，直至完成所需范围的椎板切除术。接下来，确定脊髓的背侧中线，将一支30号针头垂直刺入中线，进入脊髓，直至椎管腹侧壁，针头斜面朝向右侧。用一小块无菌明胶海绵止血，将一对虹膜显微手术剪的一侧刀尖沿针道中线插入，另一侧刀尖沿右侧半脊髓的外侧面插入，对右侧半脊髓进行完全切断。利用同一针头的侧缘作为刀具，切开损伤间隙，以确认右侧半横断完全。观察椎管底部，以确认右侧半横断的完整性。使用水泥混合物在海绵上方以及第8和第10胸椎棘突之间构建狭窄的桥状结构。随后，用4/0丝线分别缝合肌肉层和皮肤层，并皮下注射0.9%无菌生理盐水以维持水合状态。术后第一周内每日按压膀胱两到三次，随后几周每日一到两次，直至自发排尿恢复。在手术后适当的时间点，将成年大鼠放入开放场实验装置中，观察动物四分钟内的运动情况。根据表格，对每种行为类别分别记为“是”得1分，“否”得0分，各项得分相加，得到最终单侧半横断步态评分为0-8分。对于步态协调性分析，记录实验动物在狭窄跑道装置上行走的过程，并针对每种协调类别分别评分为：0分（无协调）、1分（规律性差或笨拙）、2分（正常）。对于接触放置评估，将动物保持垂直体位，使其双侧后肢均可产生放置反应，然后将其中一侧后肢的足背轻轻向前刷过表面边缘。观察足部是否放置到表面上，并对后肢接触放置反应进行评分：0分（无放置动作），1分（有放置动作）。对于网格行走评估，将大鼠置于一个高架的塑料包被金属丝网网格上，网格尺寸为36厘米×38厘米，孔径为3厘米见方，录像记录大鼠在平台上自由行走30步的过程，以便量化各肢体踩空的次数，从而评估运动功能缺损的严重程度。在损伤中心处的横截面上进行氨基酸荧光染色，显示右侧半脊髓完全缺失，而对侧左侧半脊髓得以保留。个体步态评估指标的评分可单独分析，也可合并为半横断后综合行为评分。损伤后前三天，大鼠失去迈步能力，约在损伤后7至10天，同侧开始重新出现类似迈步的动作，且多数为足背部着地的步态。到T-9节段半横断损伤后28天，大鼠可实现几乎正常协调的足底迈步。相比之下，对侧后肢的功能受单侧半横断损伤的影响较小，其评分在损伤后前五天内下降，到损伤后第10天即恢复至基线水平。在整体步态协调性测试中，半横断损伤后的协调稳定性与适应能力在损伤后前五天均显著降低。同侧后肢的接触放置和网格行走能力也受到影响，通常在动物开始出现足底行走步态时逐渐恢复。要制造一个切口整齐的损伤可能比较困难。将一根针放在中间位置可作为有用的参考，以确保组织被完全分离。

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成年大鼠脊髓侧性横断与不对称行为评估

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