微量肉汤稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法

本方法的总体目标是通过改良临床实验室常用的液体微量稀释敏感性试验，评估潜在抗真菌化合物的活性。该方法用于评价天然或合成化合物的抗真菌活性，是抗真菌药物研发初期阶段的首批检测手段之一。我们提供了利用小体积样本在短时间内完成新型抗真菌药物初步筛选的操作指南，尤其适用于采用自动化设备进行实验的情况。

本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Daniel Zamith-Miranda 演示。首先，按照文本方案中所述方法培养测定所需的真菌菌株。次日，在室温下以 1200 G 离心 5 分钟，通过离心收集细胞。

弃去上清液，向每根试管中加入10 mL PBS，重悬细胞。在室温下以1200 ×g离心5分钟。再重复PBS洗涤和离心操作两次。

第三次洗涤后，将细胞重悬于5毫升双倍浓度的RPMI 1640培养基中。根据细胞悬液的浑浊度，用微量离心管分别制备每种菌株1:100或1:1000的稀释液1毫升。取10微升该稀释液，加入血细胞计数板的计数室中，在显微镜下计数四个角区方格内的细胞总数。

在计算每种细胞悬液的密度后，用双倍浓度的 RPMI 1640 培养基制备细胞悬液原液。白色念珠菌菌株的细胞密度为每毫升 4,000 个细胞，新型隐球菌菌株的细胞密度为每毫升 20,000 个细胞。冻干肽应分装保存，每次使用一份，置于 -20 摄氏度保存，并仅在每次实验前用去离子水溶解。

多肽浓度应为检测中测试的最高终浓度的两倍。同时配制参考抗真菌药物。抗真菌实验重复三次，使用96孔聚苯乙烯微孔板进行。

采用每种肽和对照抗真菌药物的两倍系列稀释法，每孔终体积为 50 微升。该实验方案中最关键的步骤是系列稀释，因此在接下来的几个步骤中务必格外小心，避免任何可能影响整个分析结果的误差。使用移液器，在 A 行第 1 至第 3 列中加入 100 微升抗真菌肽，其浓度为所需最高终浓度的两倍浓度。使用多通道移液器，向 B 至 H 行的其他各孔中加入 50 微升无菌水。从浓度最高的孔中取出 50 微升液体。

转移至下一浓度对应的孔中，并通过反复吹打数次混匀。重复梯度稀释，直至达到最低浓度的孔，从这些孔中弃去50微升。在A、B、C行的第11列和第12列仅加入水，作为空白对照或阴性生长对照。

向第1至第3列以及第11列的每个孔中加入50微升用RPMI 1640培养基配制的双倍浓度调整后的接种物。白色念珠菌的最终浓度为每毫升2,000个细胞。新型隐球菌的最终浓度为每毫升10,000个细胞。

通过混合50微升水和50微升不含抗真菌药物的调整后接种物来制备阴性生长对照。通过混合50微升水和50微升不含细胞的培养基来制备空白对照。将对照加入相应的孔中。

使用倒置光学显微镜观察所有孔，然后将培养板在37摄氏度、200 rpm振荡条件下孵育。孵育结束后，再次观察所有孔，以确认形态学变化并检查是否存在污染迹象。使用数码相机拍摄每块培养板的图像。

在此代表性实验中，评估了三种浓度范围为 100 微摩尔至 0.78 微摩尔的抗菌肽（AMPs）对新型隐球菌（C. neoformans）的抗真菌活性。实验包含生长对照组和空白对照组。任何孔中培养基清澈透明、与空白孔相似者判定为阳性结果；而任何孔中培养基浑浊、类似于阴性生长对照孔者判定为阴性结果。

由于最低抑菌浓度（MIC）被定义为在培养结束后能够完全抑制真菌可见生长的最低抗菌化合物浓度，因此25 µM被视为AMP1的MIC，而12.5 µM为AMP2的MIC。AMP3需要重新评估，因为真菌在所有测试浓度下均出现了生长。

同样地，三种不同的肽对白色念珠菌进行测试，结果显示AMP1的最低抑菌浓度（MIC）为50微摩尔，AMP2的最低抑菌浓度为6微摩尔，AMP3的最低抑菌浓度为25微摩尔。该平板中C行第5至第7列展示了一个较差的结果示例，可能是在稀释步骤中移液操作不当所致，表现为新型隐球菌在重复样本间的生长存在差异。

一旦掌握，该技术若操作得当，大约可在两小时内完成，此外还需加上真菌的生长时间。请务必注意所测试分子的理化特性，必要时选用适当的溶剂作为对照，并始终使用处于相同生长阶段的细胞。

完成此操作后，还可进行其他方法，例如时间杀灭实验、活细胞染料检测以及ST60检测，以回答更多问题，如该化合物具有杀菌作用还是抑菌作用。该技术建立后，为医学微生物学领域的研究人员探索多种天然或合成化合物来源以寻找抗真菌化合物铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何启动真菌培养、制备检测用细胞、进行系列稀释，以及在将真菌菌株与待测化合物共孵育后读取结果。

请注意，操作真菌病原体可能具有极高的危险性。在进行本实验操作时，应做好相应的安全准备，例如穿戴个人防护装备、在生物安全柜内操作，并遵循适当的安全操作规范。