用于原位晶体 x 射线衍射和原位的微流控芯片系列晶体学的动态光散射

该程序的总体目标是制造和作用于在室温下收集蛋白质结晶 X 射线衍射数据的微流体装置。这种技术的主要优点是芯片内部的结晶最大限度地减少了蛋白质晶体的机械干扰。这些 X 射线透明芯片易于生产，可以直接安装在大多数同步辐射光束线的测角仪上，并在收集 X 射线衍射数据时有效利用可用的晶体。

首先，将 X 射线芯片设计的主模具放入衬有铝箔的 10 厘米培养皿中。将约 30 克 PDMS 基料和固化剂以 10 比 1 的比例混合在一起，然后将 PDMS 倒在母版上，使其高度为 4 毫米。在真空干燥器中对 PDMS 进行脱气 5 分钟，然后吹气以去除 PDMS 表面残留的气泡。

将 PDMS 放入 70 摄氏度的烘箱中固化 1 小时。然后，轻轻地从母版上剥离固化的 PDMS 模具。使用手术刀切掉多余的 PDMS。

在制造 X 射线芯片之前，确保工作空间的布置允许在环氧树脂模具铸造过程中轻松访问所有需要的设备和组件。要开始芯片制造，请用乙醇将双组分环氧树脂的前体稀释至最终乙醇质量浓度为 40%（按重量计）。使用涡旋混合器，将环氧树脂和乙醇混合在一起。

真空干燥器中对 PDMS 模具进行脱气 30 分钟，以确保 PDMS 稍后可以吸收环氧树脂中的小气泡。切割一块 70 毫米 x 70 毫米厚的 7.5 微米厚的聚酰亚胺箔，然后将箔包裹在 75 毫米 x 50 毫米的载玻片上。将箔片的边缘用胶带粘在载玻片的背面，形成一个平坦、坚硬的聚酰亚胺表面。

用氧气等离子体处理滑背聚酰亚胺箔 20 秒。然后，将铝箔在 20 摄氏度下在 1% 体积的 APTS 或 GPTS 水溶液中孵育 5 分钟。在硅烷化过程中，用小刮刀将环氧树脂前驱体溶液充分混合在一起。

将脱气的 PDMS 模具从真空干燥器转移到平坦的表面上。用加压空气或氮气干燥硅烷化聚酰亚胺箔。将树脂混合物的快速液滴涂在模具上的每个微观结构上。

将滑背聚酰亚胺箔正面朝下放在环氧树脂上，然后用力按压载玻片。用塑料箔和金属板覆盖组件。在金属板上放置砝码，以对组件施加高达每平方厘米 1.4 牛顿的压力。

15 分钟后，轻轻地将载玻片与环氧树脂图案的聚酰亚胺箔分开，然后擦拭聚酰亚胺箔直至干燥。将塑料箔、金属板和砝码放回顶部。让环氧树脂在室温下固化 1 小时。

然后，取下砝码、金属板和塑料箔。从 PDMS 模具上轻轻剥下带图案的聚酰亚胺箔。等离子体对图案箔处理 20 秒，然后用 APTS 或 GPTS 对图案箔进行硅烷化，如前所述。

在相同条件下，用另一种硅烷溶液使原始聚酰亚胺箔硅烷化。用加压空气干燥两张箔片。然后，将一滴去离子水滴在干净、干燥、平坦的表面上。

在聚酰亚胺箔上切割单个芯片结构，将带图案的聚酰亚胺箔环氧树脂面朝上放在水滴上，然后小心地将箔片抹平，直到完全平整。将第二个聚酰亚胺箔片放在带图案的箔片上，硅烷化面朝下。轻轻地用手将第二片箔从角抹到对角，以排出气泡并将聚酰亚胺片粘合在一起。

要开始制造接入端口，请从固化的 4 毫米 PDMS 板上切下一块足够大的块，以覆盖聚酰亚胺 X 射线芯片中的所有端口，而不覆盖结晶室。对聚酰亚胺芯片和 PDMS 模块进行等离子处理、硅化和干燥。将处理过的块压到端口上的芯片上。

用塑料箔、干净的载玻片和金属板覆盖芯片。施加每平方厘米 1.4 牛顿的压力，持续 1 小时。接下来，使用 0.75 毫米的活检打孔器在芯片设计中标记的入口和出口孔上打孔。

用聚酰亚胺薄膜电绝缘胶带密封芯片的背面。然后，用氟化溶剂将透明含氟聚合物涂层材料的 9% 重量储备溶液稀释至 0.45% 重量。将 27 号、5/8 英寸针头连接到注射器。

将聚四氟乙烯管安装在针头末端。将含氟聚合物溶液装入 1 毫升 Luer lock 注射器中。将管路的另一端连接到 X 射线芯片出口。

将含氟聚合物溶液注入芯片中，直到所有通道都充满，然后使用充满空气的注射器去除过量的含氟聚合物溶液。将装满的薯片平面朝下放在 190 摄氏度的热板上。将芯片加热 5 分钟以蒸发溶剂，从而用含氟聚合物涂布通道。

在结晶程序之前，用 0.2 微米过滤器过滤所选的蛋白质溶液。将溶液在 16、100 倍 g 和 20 摄氏度下离心 15 分钟，并回收上清液用于结晶实验。要开始结晶程序，请将等体积的蛋白质溶液及其沉淀物混合。

将大约 20 微升这种混合物吸入注射器中。使用 27 号、5/8 英寸针头和 PTFE 管将注射器连接到 X 射线芯片的入口。以相同的方式将含氟油注射器连接到出口。

在显微镜下监测芯片的同时，通过入口将结晶溶液填充到平行布局的芯片中。注入足够的氟化油以分离芯片中的结晶室。然后，用回形针或其他窄塞堵住入口和出口。

将芯片储存在适当的结晶条件下。现在可以在显微镜下或通过动态光散射测量来观察晶体的形成。准备好进行数据收集时，使用双面胶带将 X 射线芯片固定到板测角仪的 3D 打印适配器上。

将芯片适配器安装在同步加速器光束线处的板测角仪上。收集和分析衍射数据。明场显微镜用于量化聚酰亚胺箔片结晶室中水分的蒸发速率。

动态光散射可以检测具有等效几何形状的载玻片上 PDMS 芯片中奇马汀晶体的初始成核，从而优化结晶条件。从聚酰亚胺芯片中生长的 83 个奇马汀晶体中收集了 10 个衍射图，每个晶体在每帧中旋转 1 度。将数据集按帧拆分为 5 个子数据集，然后评估归一化衍射功率的强度随时间的变化。

到第四个数据集，衍射功率已降至 50% 以下，子数据集的测量 R 因子值随着时间的推移而增加，表明晶体在数据收集过程中遭受了辐射损伤。这归因于 X 射线曝光过程中产生的自由基降解了同一隔室中的相邻晶体。双锥体奇马甜晶体在 X 射线芯片中具有广泛的取向分布。

在聚酰亚胺芯片中生长时，正交葡萄糖异构酶晶体同样显示出广泛的取向分布。然而，硫氧还蛋白晶体主要在 xy、xz 和 yz 平面上具有取向，这可能是由于它们细长的形状。一般来说，这些芯片非常坚固，并且具有低 X 射线背景。

这使得这种制造方法适用于其他 X 射线成像技术，例如小角 X 射线散射。该程序可以很容易地适应您的实验需求。例如，可以通过调整各个隔室的尺寸或每个芯片的隔室总数来修改芯片设计。

我们特别关注的是设计一种不需要成本密集型设备（如专用工具或微流体泵）的工作流程。看完这个视频并阅读了手稿，你应该对如何在 Chit 中结晶，监测结晶过程，以及使用 Chit 方法记录和分析衍射数据有一个很好的了解。掌握后，该技术可在大约 3 小时内从 PDMS 母站批量制造微流体芯片，而无需专用洁净室。