通过流式细胞术测定分离的块茎原生质体的内复制

本实验的总体目标是评估马铃薯块茎内的内复制水平。该方法有助于回答有关马铃薯块茎形态的关键问题，例如块茎组织发生内复制的发育阶段。该技术的主要优势在于，与常规流式细胞术制备方法相比，可提供更为清晰的结果。

演示该实验步骤的是来自我实验室的研究生 Parker Laimbeer。根据文本方案配制好溶液和缓冲液后，将马铃薯块茎浸入71%乙醇中至少五分钟，进行表面灭菌。

将植物材料从乙醇中取出，并使其自然风干。为每个样品准备并标记无菌的50毫升锥形管，并向每管中分装15毫升过滤除菌的质壁分离诱导液（plasmolysis incubation solution，PIS）。使用灭菌的解剖刀或打孔器，取约一立方厘米所需灭菌的组织样本。

使用灭菌的手术刀将组织粗略切成约三立方毫米大小的组织块，并将组织转移至含有PIS的锥形管中。然后在4°C条件下孵育过夜。

制备马铃薯原生质体时，首先准备适量酶解液（ES），其中包含0.71摩尔的甘露醇、3毫摩尔的氯化钙、1毫摩尔的磷酸二氢钾、1毫摩尔的氯化镁、4% Onozuka R-10纤维素酶、0.8% Macerozyme R-10果胶酶、1%半纤维素酶以及10毫摩尔的MES缓冲液（pH 5.8），并进行过滤。使用血清移液管，从试管中的样品中吸除PIS。

向每个样品中加入 10 毫升 ES 溶液，并将试管颠倒 2 至 3 次。然后在 29°C、180 RPM 条件下过夜孵育样品。第三天，为了收集和洗涤原生质体，从摇床中取出样品，静置约 10 分钟。

使用血清移液管尽可能吸除 ES 溶液，注意避免接触已消化的组织。然后使用微量移液器，并将离心管倾斜持握，再次吸除残留的 ES 溶液，仍需避免接触已消化的组织。尽可能彻底去除原生质体洗涤溶液至关重要，以防止对细胞核造成损伤。

将离心管倾斜一定角度有助于去除溶液，同时保留原生质体。向每个样品中加入 15 毫升 PWS，并轻轻倒置离心管 2 至 3 次。

让原生质体沉降10分钟。然后使用刻度移液管去除PWS，再用微量移液器除去任何残留液体。

将样品保持在冰上时，向每根试管中加入1.5毫升预冷的FCB。轻轻振荡或涡旋每份样品，以分散聚集的组织。充分分散块茎组织至关重要，以便FCB能够完全渗透细胞并释放细胞核。

如果需要从该步骤开始设置对照，请使用剃刀将一小片叶片在1.5毫升预冷的FCB中精细切碎。对照样品应与实验样品具有相同的倍性，最好为相同的基因型。将一个切去管尖并在底部熔接了106微米金属筛网的1.5毫升微量离心管插入一个2毫升微量离心管中。

然后将1毫升FCB组织悬液通过滤膜。向每个样品中加入250微升RNA溶液。随后倒置离心管，在室温下孵育30分钟。

向每个样品中加入125 µL预先配制的碘化丙啶（propidium iodide）或PI溶液。颠倒混匀后将试管置于冰上孵育30分钟。样品应尽快使用，且在两小时内使用完毕，以避免降解。

使用对数刻度创建两个点图，分别为前向散射光与侧向散射光，以及碘化丙啶（PI）与侧向散射光的关系图。同时创建一个以碘化丙啶（PI）为横轴的直方图。由于细胞核的荧光强度可能存在显著差异，因此必须使用对数刻度以确保所有事件均在量程范围内。

加载已知对照样品的管，例如来自样本基因型的体外叶片组织，并调节电压，使所有事件均在量程范围内。记录对照样品中2C峰所在的通道。

实验样品的2C峰应位于相同位置。加载一个实验用块茎样品，并再次确保所有事件均在量程范围内。如果需要调整，请重复对照样品的电压调整，以确定2C峰所在的通道。

使用侧向散射光与碘化丙啶（PI）图手动圈选原生质体细胞核。然后设置PI直方图，仅显示已圈选的原生质体细胞核区域。从每个样本中收集所需数量的事件。

研究人员通常在流式细胞术中使用 10,000 个门控事件。然而，由于需容纳更多样本以及浓度较低的样本，本实验中马铃薯块茎原生质体样本仅使用 2,000 个事件。制备原生质体是获得可重复的马铃薯块茎流式细胞术结果的必要步骤。

此处展示了其总体形态结构。髓部与髓周薄壁组织之间的分界以黑线标示。将薄壁组织与皮层分开的维管环以黑色箭头标示。

分离的原生质体应呈球形且对称，细胞质膜保持完整。注意叶片与块茎原生质体之间的大小差异，以及同一组织内原生质体大小的差异，后者可能表明存在不同水平的内复制。该图展示了在流式细胞术散点图和直方图中可能遇到的结果差异。

完整细胞核的峰之间分离清晰，可用于量化细胞的相对丰度，而整合样品的峰则表现出偏移、变宽且基部重叠。在相应的散点图中，黑色方框标示了用于直方图的核事件门控区域，事件的聚集程度反映在直方图峰的宽度上。本实验对内复制水平（EI）的分析证实了先前结果，即髓部组织的EI高于皮层组织。

令人意外的是，薄壁组织的表达谱与皮层相似，且与髓组织存在显著差异。在进行该操作时，需注意在前两次孵育过程中保持样品的无菌状态，并在原生质体裂解后尽可能将样品置于冰上。在完成该操作后，可进一步采用其他方法（如遗传操作）来回答更多科学问题，例如哪些基因影响块茎的内复制水平。

观看本视频后，您应充分了解如何从马铃薯块茎中提取原生质体，并将其制备用于流式细胞术，以检测其内复制水平。请注意，使用碘化丙啶具有极高危险性，在进行该操作时，务必采取适当个人防护装备（PPE）等安全防护措施。