染色质相关蛋白杂交捕获技术在哺乳动物细胞蛋白质组学中的应用优化

该方法有助于解答基因组调控研究中的关键问题，例如非编码区疾病相关序列变异如何通过改变蛋白质与DNA的结合来影响基因表达与调控，并有助于鉴定出这些相互作用的蛋白质。该技术的主要优势在于，无需对细胞或组织进行任何遗传操作，也不需要使用抗体，且无需预先了解可能在该基因座与DNA相互作用的DNA结合蛋白。本实验操作将由我实验室的技术员Danu Perumalla进行示范。

根据文本方案设计寡核苷酸后，将2至5 × 10⁵个淋巴母细胞样细胞或其他细胞系接种于T25培养瓶中，加入6 mL RPMI 1640培养基，培养基中添加1%青霉素-链霉素、2 mL或更多L-谷氨酰胺以及5%胎牛血清（FBS）。将细胞置于37°C、5%二氧化碳环境中培养。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度。

在细胞密度达到每毫升1×10⁶个细胞之前，于100×g离心5分钟，然后将细胞转移至含有25毫升本视频先前配制的RPMI 1640培养基的T75培养瓶中。培养细胞直至其密度达到每毫升1×10⁶个细胞，随后将细胞转移至含有38毫升相同培养基的T150培养瓶中，继续培养额外两天。接着，于100×g离心5分钟收集细胞，并将细胞重悬于10毫升RPMI 1640培养基中。

然后将悬液加入含有500毫升培养基的1850平方厘米滚瓶中，在与之前相同的条件下培养细胞，但需持续旋转。当达到目标细胞数量后，在100 × g 条件下离心5分钟，将细胞沉淀重悬于36毫升RPMI 1640培养基中。随后将细胞悬液转移至50毫升锥形管中，并取出少量等分试样用于细胞计数和DNA提取。

为交联细胞，加入1毫升37%甲醛，使终浓度达到1%。然后在室温下以10至30转/分钟孵育细胞10分钟。加入2毫升2.5摩尔甘氨酸溶液（终浓度为125毫摩尔）以终止交联反应。随后将细胞旋转孵育5分钟。

离心收集细胞后，使用预冷的1× PBS缓冲液洗涤细胞两次。随后继续进行细胞裂解和剪切操作，或者将细胞沉淀重悬于5毫升细胞裂解缓冲液中，并将悬液逐滴投入液氮中快速冷冻。然后将样品于-80 °C保存。

为进行裂解和剪切，将沉淀重悬于20毫升细胞裂解缓冲液中。在4摄氏度下以400 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于6毫升含蛋白酶抑制剂的细胞核裂解缓冲液中。

为超声处理做准备，将样品均匀分装至六到八个微量离心管中。将样品置于冰上或冷架子上，使用带微探头的超声破碎仪，在65%的振幅下进行五次持续20秒的连续脉冲处理，每次脉冲之间至少间隔40秒以使悬液充分冷却。在4摄氏度条件下以12,000 ×g离心10分钟，随后将上清液转移至新管中，弃去沉淀物。

使用荧光测定法估算总回收率后，迅速冷冻样品。根据文本方案配制杂交缓冲液和洗涤缓冲液后，用 1,200 微升 1X 杂交缓冲液洗涤 600 微升磁珠，共洗涤三次。然后用 1,200 微升 2X 杂交缓冲液重悬磁珠。

在1.5毫升微量离心管中，加入600微升样品、120微升悬浮于2倍杂交缓冲液中的洗涤磁珠，以及480微升2倍杂交缓冲液。将离心管在31摄氏度、30至60 RPM条件下孵育10分钟。随后将离心管置于磁力架上，直至磁珠完全固定，然后将上清液转移至新的离心管中，弃去磁珠。

将捕获寡核苷酸重悬于工作液中，使其浓度为每微升10皮摩尔，然后向每管中加入4微升该溶液。将各管在42摄氏度、30至60转/分钟条件下孵育40分钟。孵育期间，取出所需磁珠，按前述方法洗涤磁珠三次，但此次使用1X杂交缓冲液重悬磁珠。

将洗涤后的磁珠加入离心管中，在室温下以30至60 RPM转速孵育30分钟。将离心管置于磁力架上，待磁珠完全固定后，小心移除上清液。洗涤磁珠后，加入40 µL分子生物学级别的水以洗脱样品，并在94 °C下孵育5分钟。

将试管置于磁架上，静置数分钟直至溶液变澄清，然后将上清液转移至新试管中，并弃去磁珠。将样品保存在负80摄氏度，或根据正文方案进行蛋白质组学分析。为评估捕获效率，使用分子生物学级水将洗脱液的一部分稀释十倍（1:10）。

在从视频中先前取样的等分试样中提取DNA后，使用该DNA样本和分子级水配制标准曲线，进行五次连续的1:10倍比稀释。加入引物和探针配制qPCR预混液，并将适量预混液分配至各反应孔中。向每个孔中加入5微升稀释后的样本、标准曲线样本或分子级水，后者作为无模板对照。

密封反应板，并在100 ×g条件下离心1分钟。然后使用文本方案中所述的参数，在qPCR系统中运行样品。最后，利用标准曲线评估产量，并通过随机捕获序列评估捕获特异性。

此处展示的是使用寡核苷酸滴定进行的杂交捕获实验。寡核苷酸的数量逐步增加，同时保持总体浓度不变。该实验有助于确定达到最佳杂交效率所需的寡核苷酸种类数量。

它还可以揭示特定引物组之间是否存在明显的不利杂交相互作用，以及是否存在特异性差的引物，从而导致高背景信号。在交联的染色质中，大部分片段无法适用于杂交捕获。如果杂交捕获实验成功进行，使用不同捕获引物组对同一批染色质材料进行后续捕获实验，其得率将与使用新鲜染色质时相当。

然而，在第二次捕获实验中，使用原始的寡核苷酸和第一次实验剩余的染色质时，如果第一次实验已捕获了大部分可杂交的材料，则产量将减少约90%。该图展示了不同染色体目标区域的杂交捕获结果，每个区域均作为其他区域的阴性对照。此外，一个随机序列也作为真正的阴性对照。

一旦掌握，该技术可在两天内完成，前提是操作得当。在进行此实验时，重要的是要首先测试捕获寡核苷酸，以确保目标区域适合进行杂交捕获。在完成本实验后，还可采用其他方法，如染色质免疫沉淀，来回答进一步的问题，例如所鉴定出的DNA相互作用蛋白在基因组中的其他结合位点。

观看本视频后，您应能充分理解如何执行 HyCCAPP，以富集感兴趣的基因组区域，从而从头鉴定局部蛋白质相互作用。