Name: 蛋白质组学与染色质相关蛋白杂交捕获对哺乳动物细胞的适应性研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习使用HyCCAPP技术捕获染色质相关蛋白并进行蛋白质组学分析，无需遗传操作或抗体即可鉴定哺乳动物细胞中与DNA相互作用的蛋白质，助力研究基因调控机制。

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本工作获得了 NIH 基金 P50HG004952 和 R01GM109099 对 MO 的资助。

1. 捕获寡核苷酸设计
<ol>
	<li>设计用于目标区域杂交捕获的一组寡核苷酸。
	<ol>
		<li>每个目标区域建议设计4–8条寡核苷酸，但至少应设计一条针对目标区域两端的寡核苷酸。</li>
		<li>如果目标序列较长（&#62;500个碱基对），应尽可能均匀分布寡核苷酸，以确保在整个目标区域范围内实现有效的染色质富集。 
		注意：我们观察到使用4–8条寡核苷酸时捕获效果最佳。尽管使用更多寡核苷酸也可能有效，但当寡核苷酸数量过多时，富集产量下降的情况并不少见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计具有相似熔解温度的寡核苷酸，并确保它们不会形成稳定的发夹结构，也不会产生强烈的相互作用（需考虑杂交反应将在42 ᵒC下进行）。 
	注意：如果选择使用toehold介导的洗脱（4.12.3），则需在寡核苷酸上额外添加一段8个碱基的外源序列，并在洗脱时使用相应的互补“释放”寡核苷酸17。可使用多种商业软件工具来筛选和分析寡核苷酸。25 mer的寡核苷酸已显示出良好效果，但根据基因组大小和序列特征，捕获寡核苷酸的长度可在20–80个碱基之间变化。通常捕获寡核苷酸的熔解温度接近62 ᵒC，但该值会随其长度而变化。在整个捕获混合物中保持一致的熔解温度和/或寡核苷酸长度，有助于避免富集过程中产生不必要的偏差。</li>
	<li>在寡核苷酸的3'端设计带有生物素基团的捕获序列（建议通过间隔序列将生物素与捕获序列分隔开）。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>在含有1%青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和5%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，于37 ᵒC、5% CO2条件下培养人淋巴母细胞样细胞（如本文所示的GM12878）或其他细胞系。
	<ol>
		<li>将初始冻存的细胞（2–5 × 105 个细胞）接种至T-25培养瓶中，加入6 mL按步骤2.1配制的RPMI 1640培养基。</li>
		<li>监测细胞密度和活力。
		<ol>
			<li>取适量代表性细胞样本，用台盼蓝等适当染料染色。</li>
			<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在细胞密度达到1 × 106 个细胞/mL之前，以100 × g离心5分钟，将细胞沉淀重悬后转移至T-75培养瓶中，加入25 mL按步骤2.1配制的RPMI 1640培养基。继续培养细胞至密度接近1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>将细胞转移至T-150培养瓶中，加入38 mL RPMI 1640培养基（2.1），继续培养两天。 
		注：淋巴母细胞样细胞为悬浮生长。常规培养建议将细胞密度维持在0.2–1 × 106 个细胞/mL之间。由于本技术所需材料量较大，本方案特意设计为使细胞密度高于常规使用值。读者可根据所用细胞类型对细胞培养方案进行调整和优化。</li>
		<li>以100 × g离心5分钟收集细胞，将细胞沉淀重悬于10 mL RPMI 1640培养基（2.1）中，将悬液倒入含有500 mL培养基的850 cm2滚瓶中。继续在相同条件下培养，但此时开始以恒定速度旋转（约0.5 rpm）。</li>
		<li>监测细胞生长情况，并根据需要更换培养基（通常每3–4天一次）。使细胞生长至密度尽可能接近2 × 106 个细胞/mL（总计约1 × 109 个细胞）。</li>
		<li>达到目标细胞数量后，以100 × g离心5分钟收集细胞，将细胞沉淀重悬于36 mL RPMI 1640培养基（2.1）中，转移至50 mL锥形管。取少量细胞悬液用于细胞计数和DNA提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入1 mL 37%甲醛，使终浓度为1%，进行交联。 
	注意：甲醛为致癌物，应在通风橱中操作。
	<ol>
		<li>室温（RT）下以约30–60 rpm转速旋转孵育10分钟。</li>
		<li>加入2 mL 2.5 M甘氨酸溶液（终浓度125 mM），终止交联反应。</li>
		<li>室温下继续以约30–60 rpm转速旋转孵育5分钟。以100 × g离心5分钟收集细胞沉淀，用预冷的1× PBS洗涤两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可继续进行下一步操作，或将细胞沉淀重悬于5 mL细胞裂解缓冲液（5 mM Hepes、85 mM KCl、0.5% Igepal、蛋白酶抑制剂（PI））中，逐滴加入液氮中速冻。将样品储存于-80 ᵒC。 
	注：预先配制&#62;25 mL不含Igepal和PI的细胞裂解缓冲液，在使用前再新鲜加入上述试剂。一旦加入Igepal和PI，应避免长期储存。细胞裂解缓冲液可在4 ᵒC保存最多3个月。Igepal为非离子型、非变性去污剂。NP-40可作为Igepal的潜在替代物，但本实验未采用，因为在后续通过质谱分析鉴定DNA结合蛋白时，不推荐使用NP-40。</li>
</ol>
3. 裂解与剪切
<ol>
	<li>准备 &#62;15 mL 核裂解缓冲液（10 mM EDTA，50 mM Tris（pH 8.0），1% SDS，PI）。 
	注意：PI 需新鲜添加，仅加入即将使用的量。PI 添加后应避免长期储存核裂解缓冲液。添加 PI 前，核裂解缓冲液可在室温下保存长达 1 个月。</li>
	<li>将沉淀重悬于 20 mL 细胞裂解缓冲液（含 Igepal 和 PI）中。将沉淀在冰上融化，融化后充分混匀。冰上静置额外 10 分钟。在 4 ᵒC 下以 400 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于 6 mL 含 PI 的核裂解缓冲液中（若细胞无法充分悬浮，可适当增加体积）。</li>
	<li>为超声处理做准备，将样品均分至约 6–8 个微量离心管中（每管 600 至 1,000 µL）。
	<ol>
		<li>将样品置于冰上或冷金属架上，使用带微探头的超声仪进行超声处理。设置超声仪振幅为 65%，持续脉冲 5 次，每次 20 秒，脉冲之间至少冷却 40 秒。 
		注意：若每份样品体积 &#62;10 mL，可改用玻璃冷却池。此时需增加脉冲次数和延长脉冲时间。不同超声仪性能差异较大，具体条件可能需要使用者自行优化。也可采用其他超声替代方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 ᵒC 下以 12,000 × g 离心 10 分钟，将上清液转移至新管中，弃去沉淀。</li>
	<li>采用荧光定量法估算总回收量。</li>
	<li>可继续下一步操作，或将样品速冻后于 -80 ᵒC 保存。</li>
	<li>可选步骤：取部分样品，加入 0.3 M NaCl 并在 67 ᵒC 下孵育过夜以逆转交联。纯化 DNA 后使用 Bioanalyzer 检测片段长度。大部分片段长度应在 500 至 1,000 bp 之间。 
	注意：可在本步骤暂停，将样品于 -80 ᵒC 保存。</li>
</ol>
4. 杂交捕获
<ol>
	<li>配制 500 mL 的 2× 杂交（Hyb）缓冲液（200 mM MES，2 M NaCl，40 mM EDTA，0.02% Tween-20）和 500 mL 洗涤缓冲液（200 mM NaCl，0.2% SDS，50 mM Tris，pH 8）。将 Hyb 缓冲液和洗涤缓冲液分别于 4 ᵒC 和室温下保存，最长可保存 3 个月。使用一半的 2× Hyb 缓冲液配制 1× 杂交缓冲液，并同样在 4 ᵒC 下保存，最长可保存 3 个月。 
	注意：杂交捕获的总体积应为上一步所得样品体积的两倍（根据前述步骤，样品体积约为 6 mL，因此总杂交体积应为 12 mL）。</li>
	<li>预留出占总杂交捕获体积 5% 的磁珠（本例中为 600 µL）。后续步骤中需使用合适的磁力架来处理磁珠。</li>
	<li>使用两倍磁珠体积（1200 µL）的 1× Hyb 缓冲液洗涤磁珠三次。将磁珠重悬于 1200 µL 的 2× Hyb 缓冲液中。将管子置于磁力架上，待溶液澄清后，吸除缓冲液。</li>
	<li>在 1.5 mL 微离心管中进行预清除反应，每管最多加入 700 µL 样品。加入足量磁珠（5%）和 2× Hyb 缓冲液，使最终 Hyb 缓冲液浓度稀释至 1×（共 10 管，每管含 600 µL 样品、120 µL 用 2× Hyb 缓冲液重悬的洗涤后磁珠，以及 480 µL 2× Hyb 缓冲液）。在 31 ᵒC 下以翻转混匀方式孵育 10 分钟（约 30–60 rpm）。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，待磁珠完全固定后，将上清液转移至新管中。弃去磁珠。 
	注意：从本步骤起，建议使用低吸附管。</li>
	<li>将捕获寡核苷酸重悬至工作浓度为 10 pmol/µL，并向每管中加入 4 µL 该溶液。 
	注意：不同区域可互为对照，但建议加入一条序列被打乱的捕获寡核苷酸作为真正的阴性对照。</li>
	<li>在 42 ᵒC 下以翻转混匀方式孵育 40 分钟（约 30–60 rpm）。</li>
	<li>在孵育期间，预留所需磁珠量（每 pmol 捕获寡核苷酸使用 0.3 µL 磁珠）。按步骤 4.3 所述方法洗涤磁珠三次，但将磁珠重悬于 1× Hyb 缓冲液中。</li>
	<li>将洗涤后的磁珠加入样品中，在室温下以翻转混匀方式孵育 30 分钟（约 30–60 rpm）。将管子置于磁力架上，待磁珠固定后，吸除上清液。</li>
	<li>洗涤磁珠
	<ol>
		<li>加入 1.2 mL 洗涤缓冲液，在室温下以翻转混匀方式孵育 5 分钟（约 30–60 rpm）。将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。吸除缓冲液，并重复此步骤一次。</li>
		<li>加入 1.2 mL 洗涤缓冲液，在室温下以翻转混匀方式孵育 1 小时（约 30–60 rpm）。将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。吸除缓冲液，并重复此步骤，第二次孵育时间缩短至 30 分钟。</li>
		<li>加入 200 µL 洗涤缓冲液，在 31 ᵒC 下以翻转混匀方式孵育 15 分钟（约 30–60 rpm）。将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。吸除缓冲液。</li>
		<li>加入 200 µL PBS，在室温下以翻转混匀方式孵育 5 分钟（约 30–60 rpm）。将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。吸除缓冲液，并重复此步骤一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>简单洗脱
	<ol>
		<li>向磁珠中加入 40 µL 分子生物学级水，在 94 ᵒC 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。</li>
		<li>将上清液转移至新管中。弃去磁珠。</li>
		<li>进行蛋白质组学分析，或将样品在 -80 ᵒC 下保存。 
		注意：此类洗脱适用于后续 qPCR 分析及部分蛋白质组学检测，但在其他情况下，下述两种替代方法可获得&#34;更洁净&#34;的洗脱液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNase 洗脱
	<ol>
		<li>向每管中加入 40 µL 1× DNase 缓冲液和 2 U DNase。</li>
		<li>在 37 ᵒC 下孵育 15 分钟。</li>
		<li>将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。</li>
		<li>将洗脱后的样品从磁珠中移出，并转移至新的低吸附管中。</li>
		<li>在 94 ᵒC 下孵育 7 分钟以灭活酶活性，随后进行蛋白质组学分析。 
		注意：若发现 DNase 对蛋白质组学分析产生干扰，可使用更低浓度的 DNase。若采用此洗脱方法，则无法通过 qPCR 计算捕获富集效率，因为 DNase 处理会完全降解样品中的 DNA。</li>
		<li>进行蛋白质组学分析，或将样品在 -80 ᵒC 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>趾端介导洗脱17 
	注意：该方法不适用于较长的寡核苷酸（&#62;40 个碱基）。该方法要求捕获寡核苷酸包含额外的 8 个不与基因组序列重叠的碱基，并使用互补的释放寡核苷酸，以将目标物从捕获寡核苷酸上置换下来。
	<ol>
		<li>将 2 纳摩尔的释放寡核苷酸稀释于 40 µL SSC 缓冲液中。</li>
		<li>在室温下孵育 20 分钟。</li>
		<li>将管子置于磁力架上，静置数分钟至溶液澄清。</li>
		<li>将溶液从磁珠中移出。</li>
		<li>进行蛋白质组学分析，或将样品在 -80 ᵒC 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用针对目标捕获区域的引物通过qPCR评估捕获效率
<ol>
	<li>使用适当的软件或在线工具为靶区域设计引物和探针。 
	注意：在本实验中，靶向的是 DUSP3 和 DUSP5 的启动子区域。所用引物和探针如下：DUSP3：引物1 - GTG TTT AGG TTC CCT GAT CC，引物2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG，FAM标记探针 - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG；DUSP5：引物1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC，引物2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG，FAM标记探针 - TGC ATT TAG AGC AGC CAG ATG AGG TT。</li>
	<li>取一份洗脱液（不超过10 µL），用分子生物学级 H2O 按1:10稀释。</li>
	<li>提取步骤2.1.7中取样的一份样品中的DNA，并使用该DNA样品在分子生物学级 H2O 中进行五次连续1:10稀释，以制备标准曲线。</li>
	<li>配制qPCR预混液（有多种商业产品可选），加入引物和探针，并向每个孔中加入适当体积（若进行20 µL反应，则加15 µL）。</li>
	<li>向每个孔中加入5 µL的以下任一种：a) 稀释后的样品，b) 标准曲线样品，或 c) 分子生物学级 H2O（作为空白模板对照）。</li>
	<li>密封反应板，并在100 × g下离心1分钟。</li>
	<li>在qPCR系统中运行以下程序：95 ᵒC 预变性5分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 ᵒC 变性20秒、59 ᵒC 退火20秒和72 ᵒC 延伸25秒。</li>
	<li>利用标准曲线评估扩增效率，并通过随机序列捕获对照评估捕获特异性。</li>
</ol>

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAse+footprinting%3A+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Sequence-Specific+Capture+of+Chromatin+and+Mass+Spectrometric+Discovery+of+Associated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins.</a> Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).</li>
<li>Guillen-Ahlers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyCCAPP+as+a+tool+to+characterize+promoter+DNA-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genomics. 107 (6), (2016).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Chromatin-Associated+Proteins+via+Sequence-Specific+Capture+and+Mass+Spectrometric+Protein+Identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+for+the+analysis+of+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins.</a> Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).</li>
<li>Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+budding+yeast+chromatin-associated+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the budding yeast chromatin-associated interactome.</a> Mol Syst Biol. 6, 448(2010).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proteomic+Investigation+of+Chromatin+Functional+Domains+Reveals+Novel+Synergisms+among+Distinct+Heterochromatin+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).</li>
<li>Wang, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+captured+by+ChIP-mass+spectrometry+are+linked+to+dosage+compensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).</li>
<li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAP-MS%3A+A+Method+for+Identification+of+Proteins+and+Histone+Posttranslational+Modifications+at+a+Single+Genomic+Locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23942116">Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Capture+of+Chromatin+Interactions+by+Biotinylated+dCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9.</a> Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).</li>
<li>Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/content/early/2017/07/04/159517.abstract">CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein-DNA+Interactions+in+Human+Alphoid+Chromatin+via+Hybridization+Capture+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+programmable+release+of+captured+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed programmable release of captured DNA.</a> Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatin+Protoc.+Third+Ed%22%5BJournal%5D)">Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).</li>
<li>Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Proteomics+Approach+for+the+Discovery+of+Chromatin-associated+Protein+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).</li>
</ol>

不存在需要披露的利益冲突。

本文所述的HyCCAPP方法具有多种独特特性，使其成为一种强大的研究手段，可用于揭示那些原本难以察觉的DNA相互作用。该方法的特性使其具有灵活性，可适用于不同生物体及基因组的不同区域。然而，该方法也存在一些需要考虑的局限性。
HyCCAPP 是一种无需对细胞进行任何修饰的方法，因此有可能应用于原代细胞、细胞培养系统甚至组织样本。然而正因如此，该方法需要对样本进行交联处理，这会降低蛋白质组学分析的灵敏度，因此需要较大的样本投入量。目前出现了一些新兴方法，依赖于 CRISPR 技术及对周围蛋白质的生物素化标记，可在无需交联反应的条件下发挥作用12,13,14,18。如果质粒插入不是限制因素，这些方法可能非常有效，但仅适用于细胞培养系统。另一些方法则非常适合根据染色质状态或特定转录因子的存在来鉴定普遍的蛋白质相互作用关系，但并不适用于...

在过去的十年中，测序技术取得了显著进步，使得能够在大量样本中以惊人的分辨率研究多种多样的基因组。DNA元件百科全书（ENCODE）联盟是由美国国立卫生研究院下属的国家人类基因组研究所牵头的一项大规模、多机构合作项目，该联盟揭示了单个转录因子及其他调控蛋白如何结合并与其基因组相互作用。初期工作通过染色质免疫沉淀（ChIP）技术，对超过100种已知DNA结合蛋白的特异性DNA-蛋白相互作用进行了表征1。其他方法如DNase足迹分析2和甲醛辅助调控元件分离技术（FAIRE）3也被用于定位与蛋白质相互作用的基因组特定区域，但这些实验方法存在明显局限性，即无法鉴定出相互作用的蛋白质。尽管近年来已开展了大量研究工作，但至今尚未出现一种能够高效实现染色质中蛋白质-DNA相互作用全面表征，以及染色质相关蛋白质的鉴定与定量的技术。
为了满足这一需求，我们开发了一种新方法，称为染色质相关蛋白杂交捕获蛋白质组学技术（Hybridization Capture of Chromatin-Associated Proteins for Proteomics, HyCCAPP）。该方法最初在酵母中建立4,5,6，利用序列特异性的杂交捕获技术分离目标交联染色质区域（及其结合的蛋白质）。在分离出蛋白质-DNA复合物后，可采用质谱等方法对结合在目标DNA序列上的蛋白质组分进行表征。因此，HyCCAPP可被视为一种无偏倚的方法，用于发现新的DNA-蛋白质相互作用，因为它不依赖抗体，且对可能存在的结合蛋白完全未知。尽管已有其他方法可用于鉴定新的DNA相互作用蛋白7，但大多数方法依赖于类似ChIP的技术8,9,10、质粒插入11,12,13,14，或高拷贝数区域15。相比之下，HyCCAPP适用于多拷贝和单拷贝区域，且无需事先了解该区域内的蛋白质信息。此外，尽管上述某些方法具有重要优势，例如无需进行DNA-蛋白质交联反应，但HyCCAPP的独特之处在于，它可在未经修饰的细胞中应用于单拷贝区域，且无需对潜在结合蛋白有任何先验知识，也无需特异性抗体。
目前，HyCCAPP 主要被用于酵母中各种基因组区域的分析4,5,6，并最近被用于分析人基因组中着丝粒α-卫星DNA重复区域的蛋白质-DNA相互作用16。作为我们持续研究工作的一部分，我们对最初为酵母染色质开发的杂交捕获方法进行了改进，使其适用于人类细胞的分析，并在此提出一种经过优化的实验方案，可高效特异性捕获人基因组中的单拷贝目标区域，其效率与我们在酵母中的早期研究相当。这一新优化的方案使得该技术能够被广泛应用于全人基因组范围内蛋白质-DNA相互作用的研究，可结合质谱或其他分析方法进行后续检测。
需要强调的是，HyCCAPP 方法旨在分析特定的目标区域，目前尚不适用于全基因组范围的分析。当研究的基因组区域缺乏有关相互作用蛋白的信息，或需要对特定基因组位点的相互作用蛋白进行更全面深入的分析时，该技术尤为有用。HyCCAPP 的目的是发现DNA结合蛋白，但无法精确定位各个蛋白质在基因组DNA上的具体结合位点。在当前的实现方式中，该方法不能提供关于单个蛋白质的DNA结合序列或基序的信息。因此，HyCCAPP 能很好地与现有技术（如FAIRE）互补，并可能有助于识别通过初步FAIRE分析所鉴定出的基因组区域中的新型结合蛋白。

<table><tbody><tr><td>PrimerQuest 工具</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td>分析捕获寡核苷酸</td></tr><tr><td>PairFold</td><td>UBC</td><td></td><td>分析相互作用</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Countess 自动细胞计数仪</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>850 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 滚瓶&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>680058</td><td></td></tr><tr><td>滚瓶系统</td><td>Wheaton</td><td>22-288-525</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Branson 数字超声破碎仪 SFX 150</td><td>Emerson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000 试剂盒</td><td>Agilent</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>MES 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-15 磁力架</td><td>Thermo Fisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠</td><td>Thermo Fisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>低吸附管</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>SciGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>管式振荡器与旋转仪</td><td>Thermo Fisher</td><td>415110Q</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（RNase-free）</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>SSC 缓冲液 20&amp;times; 浓缩液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr></tbody></table>

染色质相关蛋白杂交捕获技术在哺乳动物细胞蛋白质组学中的应用优化

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

染色质相关蛋白的杂交捕获用于蛋白质组学分析（HyCCAPP）技术最初是为了揭示酵母中的新型DNA-蛋白质相互作用而开发的。该技术能够在无需预先了解可能结合于目标区域的蛋白质的情况下，对特定目标区域进行分析。理论上，这使得HyCCAPP可用于分析任何感兴趣的基因组区域，并且具有足够的灵活性以适用于不同的细胞系统。该方法并不旨在研究已知转录因子的结合位点，此类任务更适合采用染色质免疫沉淀（ChIP）或类似ChIP的方法。HyCCAPP的优势在于其能够探索那些对结合蛋白了解有限或完全未知的DNA区域。它也可以作为一种便捷的方法，避免使用抗体进行基于蛋白质的染色质富集时所引入的偏倚（此类偏倚存在于类似ChIP的方法中）。HyCCAPP有望成为发现真正新型DNA-蛋白质相互作用的有力工具。迄今为止，该技术主要应用于酵母细胞或哺乳动物细胞中的高拷贝重复序列。为了使其成为我们所设想的强大工具，HyCCAPP方法需要进一步优化，以高效捕获哺乳动物细胞中的单拷贝位点。本文中，我们介绍了将最初的酵母HyCCAPP捕获方案改造用于人源细胞系的方法，并证明通过这一改进后的方案可高效分离单拷贝的染色质区域。

由于 HyCCAPP 实验需要大量的染色质输入量才能成功，因此需将细胞培养至相对较高的汇合度。使用台盼蓝染色确认细胞死亡率处于较低水平（&lt;10%）。在单拷贝实验中，杂交捕获前的染色质含量需达到飞摩尔（femtomolar）级别，这通常需要至少 109 个细胞作为起始材料。在进行大规模实验之前，建议先在较小规模批次中测试捕获寡核苷酸的性能。图 1 展示了使用梯度浓度寡核苷酸进行的杂交捕获实验。实验中逐步增加捕获寡核苷酸的数量，同时保持总浓度不变。该实验明确揭示了三个关键方面：第一，有助于确定针对特定区域达到最佳（及最大）杂交效率所需的寡核苷酸数量；第二，可揭示特定寡核苷酸组合之间是否存在明显的不利相互作用；第三，可检测是否存在特异性较差、导致较高背景信号的寡核苷酸（本例中通过针对基因组其他区域设计引物的 qPCR 分析进行评估）。
由于染色质样品具有交联特性，捕获杂交...

该方法通过特异性序列捕获交联的染色质，进而进行蛋白质组学分析，从而在特定靶位点鉴定新的DNA相互作用蛋白。该方法无需预先了解潜在的结合蛋白，也无需对细胞进行修饰。该技术最初为酵母开发，现已适用于哺乳动物细胞。

染色质相关蛋白杂交捕获蛋白质组学（HyCCAPP）技术最初被开发用于发现新的DNA-蛋白……

该方法有助于解答基因组调控研究中的关键问题，例如非编码区疾病相关序列变异如何通过改变蛋白质与DNA的结合来影响基因表达与调控，并有助于鉴定出这些相互作用的蛋白质。该技术的主要优势在于，无需对细胞或组织进行任何遗传操作，也不需要使用抗体，且无需预先了解可能在该基因座与DNA相互作用的DNA结合蛋白。本实验操作将由我实验室的技术员Danu Perumalla进行示范。根据文本方案设计寡核苷酸后，将2至5 × 10⁵个淋巴母细胞样细胞或其他细胞系接种于T25培养瓶中，加入6 mL RPMI 1640培养基，培养基中添加1%青霉素-链霉素、2 mL或更多L-谷氨酰胺以及5%胎牛血清（FBS）。将细胞置于37°C、5%二氧化碳环境中培养。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞密度。在细胞密度达到每毫升1×10⁶个细胞之前，于100×g离心5分钟，然后将细胞转移至含有25毫升本视频先前配制的RPMI 1640培养基的T75培养瓶中。培养细胞直至其密度达到每毫升1×10⁶个细胞，随后将细胞转移至含有38毫升相同培养基的T150培养瓶中，继续培养额外两天。接着，于100×g离心5分钟收集细胞，并将细胞重悬于10毫升RPMI 1640培养基中。然后将悬液加入含有500毫升培养基的1850平方厘米滚瓶中，在与之前相同的条件下培养细胞，但需持续旋转。当达到目标细胞数量后，在100 × g 条件下离心5分钟，将细胞沉淀重悬于36毫升RPMI 1640培养基中。随后将细胞悬液转移至50毫升锥形管中，并取出少量等分试样用于细胞计数和DNA提取。为交联细胞，加入1毫升37%甲醛，使终浓度达到1%。然后在室温下以10至30转/分钟孵育细胞10分钟。加入2毫升2.5摩尔甘氨酸溶液（终浓度为125毫摩尔）以终止交联反应。随后将细胞旋转孵育5分钟。离心收集细胞后，使用预冷的1× PBS缓冲液洗涤细胞两次。随后继续进行细胞裂解和剪切操作，或者将细胞沉淀重悬于5毫升细胞裂解缓冲液中，并将悬液逐滴投入液氮中快速冷冻。然后将样品于-80 °C保存。为进行裂解和剪切，将沉淀重悬于20毫升细胞裂解缓冲液中。在4摄氏度下以400 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于6毫升含蛋白酶抑制剂的细胞核裂解缓冲液中。为超声处理做准备，将样品均匀分装至六到八个微量离心管中。将样品置于冰上或冷架子上，使用带微探头的超声破碎仪，在65%的振幅下进行五次持续20秒的连续脉冲处理，每次脉冲之间至少间隔40秒以使悬液充分冷却。在4摄氏度条件下以12,000 ×g离心10分钟，随后将上清液转移至新管中，弃去沉淀物。使用荧光测定法估算总回收率后，迅速冷冻样品。根据文本方案配制杂交缓冲液和洗涤缓冲液后，用 1,200 微升 1X 杂交缓冲液洗涤 600 微升磁珠，共洗涤三次。然后用 1,200 微升 2X 杂交缓冲液重悬磁珠。在1.5毫升微量离心管中，加入600微升样品、120微升悬浮于2倍杂交缓冲液中的洗涤磁珠，以及480微升2倍杂交缓冲液。将离心管在31摄氏度、30至60 RPM条件下孵育10分钟。随后将离心管置于磁力架上，直至磁珠完全固定，然后将上清液转移至新的离心管中，弃去磁珠。将捕获寡核苷酸重悬于工作液中，使其浓度为每微升10皮摩尔，然后向每管中加入4微升该溶液。将各管在42摄氏度、30至60转/分钟条件下孵育40分钟。孵育期间，取出所需磁珠，按前述方法洗涤磁珠三次，但此次使用1X杂交缓冲液重悬磁珠。将洗涤后的磁珠加入离心管中，在室温下以30至60 RPM转速孵育30分钟。将离心管置于磁力架上，待磁珠完全固定后，小心移除上清液。洗涤磁珠后，加入40 µL分子生物学级别的水以洗脱样品，并在94 °C下孵育5分钟。将试管置于磁架上，静置数分钟直至溶液变澄清，然后将上清液转移至新试管中，并弃去磁珠。将样品保存在负80摄氏度，或根据正文方案进行蛋白质组学分析。为评估捕获效率，使用分子生物学级水将洗脱液的一部分稀释十倍（1:10）。在从视频中先前取样的等分试样中提取DNA后，使用该DNA样本和分子级水配制标准曲线，进行五次连续的1:10倍比稀释。加入引物和探针配制qPCR预混液，并将适量预混液分配至各反应孔中。向每个孔中加入5微升稀释后的样本、标准曲线样本或分子级水，后者作为无模板对照。密封反应板，并在100 ×g条件下离心1分钟。然后使用文本方案中所述的参数，在qPCR系统中运行样品。最后，利用标准曲线评估产量，并通过随机捕获序列评估捕获特异性。此处展示的是使用寡核苷酸滴定进行的杂交捕获实验。寡核苷酸的数量逐步增加，同时保持总体浓度不变。该实验有助于确定达到最佳杂交效率所需的寡核苷酸种类数量。它还可以揭示特定引物组之间是否存在明显的不利杂交相互作用，以及是否存在特异性差的引物，从而导致高背景信号。在交联的染色质中，大部分片段无法适用于杂交捕获。如果杂交捕获实验成功进行，使用不同捕获引物组对同一批染色质材料进行后续捕获实验，其得率将与使用新鲜染色质时相当。然而，在第二次捕获实验中，使用原始的寡核苷酸和第一次实验剩余的染色质时，如果第一次实验已捕获了大部分可杂交的材料，则产量将减少约90%。该图展示了不同染色体目标区域的杂交捕获结果，每个区域均作为其他区域的阴性对照。此外，一个随机序列也作为真正的阴性对照。一旦掌握，该技术可在两天内完成，前提是操作得当。在进行此实验时，重要的是要首先测试捕获寡核苷酸，以确保目标区域适合进行杂交捕获。在完成本实验后，还可采用其他方法，如染色质免疫沉淀，来回答进一步的问题，例如所鉴定出的DNA相互作用蛋白在基因组中的其他结合位点。 观看本视频后，您应能充分理解如何执行 HyCCAPP，以富集感兴趣的基因组区域，从而从头鉴定局部蛋白质相互作用。

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

蛋白质组学与染色质相关蛋白杂交捕获对哺乳动物细胞的适应性研究

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

质谱技术的进步使得对多种组织中蛋白质表达和修饰的高通量分析成为可能。结合亚细胞组分分离技术和疾病模型，定量质谱分析与生物信息学方法能够揭示生物系统中的新特性。本文所述方法用于分析心脏疾病背景下与染色质相关的蛋白质，且可轻松适用于其他人类疾病的体内模型。...

疾病中染色质蛋白质组的定量分析

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ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

使用SILAC-免疫共沉淀定量蛋白质组学鉴定哺乳动物细胞中的蛋白质相互作用伙伴

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染色质结合蛋白的连续盐提取是一种用于确定大型蛋白质复合物结合特性的有效工具。该方法可用于评估蛋白质复合物中各个亚基或结构域在整体上与大量染色质结合亲和力中的作用。...

用于分析染色质修饰复合物整体染色质结合特性的连续盐抽提法

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。...

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从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

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用于单细胞组蛋白翻译后修饰多重分析（sc-hPTM2）的自动化样本制备

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染色质相关蛋白杂交捕获技术在哺乳动物细胞蛋白质组学中的应用优化

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