蛋白质组学与染色质相关蛋白杂交捕获对哺乳动物细胞的适应性研究

这种方法可以帮助回答我们理解基因组调控中的关键问题，例如非编码区的疾病相关序列变异如何通过改变蛋白质结合来影响基因表达和调控，并且可以帮助识别这些蛋白质。这种技术的主要优点是它不需要对细胞或组织进行任何类型的遗传作，也不需要抗体，也不需要事先了解可能与该位点的 DNA 相互作用的 DNA 结合蛋白。演示此程序的是我实验室的技术人员 Danu Perumalla。

根据文本方案设计寡核苷酸后，将 2 至 5 乘以 10 至第 5 个淋巴母细胞样细胞或其他细胞系，放入含有 6 毫升 RPMI 1640 培养基的 T25 培养瓶中，补充有 1% Pen Strep、2 mil 或更多 L-谷氨酰胺和 5% FBS。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数仪测量细胞密度。

在细胞达到 1 乘以 10 至每毫升 6 个细胞之前，以 100 倍 G 的速度离心 5 分钟，然后将它们转移到装有 25 毫升 RPMI 1640 培养基的 T75 培养瓶中，该培养基是本视频前面准备的。培养细胞直至达到 1 乘以 10 至每毫升 6 个细胞的细胞密度，然后将细胞转移到 38 毫升相同培养基中的 T150 培养瓶中，再培养两天。接下来，将细胞以 100 倍 G 离心 5 分钟，然后重悬于 10 mL RPMI 1640 培养基中。

然后将悬浮液倒入含有 500 毫升培养基的 1850 平方厘米的滚瓶中，并在与以前相同的条件下孵育细胞，但不断旋转。达到所需的细胞计数后，以 100 倍 G 离心培养物 5 分钟，然后将细胞重悬于 36 mL RPMI 1640 培养基中。然后将细胞悬液转移到 50 mL 锥形管中，取出小等分试样用于细胞计数和 DNA 提取。

要交联细胞，加入 1 毫升 37% 甲醛，达到 1% 的最终浓度，然后在室温下以 10 至 30 RPM 的转速孵育细胞 10 分钟。加入 2 毫升 2.5 摩尔甘氨酸溶液，使终浓度为 125 毫摩尔，从而淬灭交联反应。然后旋转孵育细胞 5 分钟。

通过离心沉淀细胞后，使用冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次。继续裂解和剪切细胞，或将沉淀重悬于 5 mL 细胞裂解缓冲液中，并在液氮中逐滴快速冷冻悬浮液。然后将样品储存在零下 80 摄氏度。

为了进行裂解和剪切，将沉淀重悬于 20 mL 细胞裂解缓冲液中。将细胞在 400 倍 G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 6 mL 含蛋白酶抑制剂的细胞核裂解缓冲液中。

在准备超声处理时，将样品均匀分成 6 到 8 个 Microfuge 管。将样品放在冰上或冷架上，并使用带有微尖的超声仪以 65% 的振幅对样品进行超声处理，并持续 5 次 20 秒的脉冲，让悬浮液在两次脉冲之间冷却至少 40 秒。将细胞在 12， 000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，然后将上清液转移到新试管中，丢弃沉淀。

使用荧光法估计总回收率后，快速冷冻样品。根据文本方案制备杂交缓冲液和洗涤缓冲液后，使用 1， 200 μL 1X 杂交缓冲液洗涤 600 μL 磁珠 3 次。然后使用 1， 200 μL 的 2X 杂交缓冲液重悬磁珠。

在 1.5 mL 微量离心管中，加入 600 μL 样品、120 μL 悬浮在 2X 杂交缓冲液中的洗涤微珠和 480 μL 2X 杂交缓冲液。将试管在 31 摄氏度和 30 至 60 RPM 下孵育 10 分钟。然后将试管放在磁铁上，直到磁珠固定，并在丢弃磁珠之前将样品转移到新试管中。

将捕获寡核苷酸重悬至每微升 10 皮摩尔的工作溶液中，并向每个试管中加入 4 微升该溶液。将试管在 42 摄氏度下以 30 至 60 RPM 的速度孵育 40 分钟。在孵育过程中，将所需的磁珠放在一边，像以前一样洗涤磁珠 3 次，但这次使用 1X 杂交缓冲液重悬它们。

将洗涤过的微珠加入试管中，并在室温下以 30 至 60 RPM 的转速孵育样品 30 分钟。将试管放在磁力架上，并在珠子固定后去除上清液。洗涤磁珠后，加入 40 μL 分子级水洗脱样品，并在 94 摄氏度下孵育试管 5 分钟。

将试管放在磁力架上，等待几分钟，直到溶液澄清，然后将上清液转移到新试管中，并丢弃磁珠。将样品储存在零下 80 摄氏度，或根据文本方案进行蛋白质组学分析。为了评估捕获产量，使用分子级水稀释等分试样的洗脱液，1 到 10。

从视频前面采集的等分试样中提取 DNA 后，使用 DNA 样品和分子级水制备标准曲线，连续 5 次稀释 1 至 10 次。制备 qPCR 预混液，添加引物和探针，并在反应的每个孔中分配适量。向每个孔中加入 5 微升稀释样品、标准曲线或分子级水，以用作无模板对照。

密封板并以 100 倍 G 旋转 1 分钟。然后使用文本方案中的参数在 qPCR 系统中运行样品。最后，使用标准曲线评估产量，并使用加扰捕获来评估捕获特异性。

此处显示的是利用寡核苷酸滴定法进行的杂交捕获。寡核苷酸的数量逐渐增加，而总浓度保持不变。该实验有助于确定需要多少种不同的寡核苷酸才能达到最佳杂交效率。

它还揭示了一组特定寡核苷酸之间任何明显的有害杂交相互作用，以及是否存在特异性较差的寡核苷酸，从而导致高背景。交联染色质中的大部分片段不适合杂交捕获。如果杂交捕获成功运行，则使用一组不同的捕获寡核苷酸对相同染色质材料进行后续捕获实验，将获得与使用新鲜染色质时相当的产量。

然而，在使用第一个实验中原始寡核苷酸和剩余染色质的第二个捕获实验中，如果在第一个实验中捕获了大部分适合杂交的材料，则产量将降低约 90%。该图显示了不同染色体靶区域的杂交捕获，每个区域用作另一个区域的阴性对照。加扰序列也用作真阴性对照。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两天内完成。在尝试此过程时，请务必记住首先测试捕获的寡核苷酸，以确保所需区域适合杂交捕获。按照此程序，可以执行其他方法，如染色质免疫沉淀，以回答其他问题，例如已鉴定的 DNA 相互作用蛋白在基因组中的其他位置结合。

观看本视频后，您应该对如何执行 HyCCAPP 以富集感兴趣的基因组区域有很好的了解，以便从头鉴定局部蛋白质相互作用。