确定用花青染料染色的DNA是否可被限制性酶消化

本实验的总体目标是利用对甲基化敏感和非敏感的限制性内切酶消化荧光标记的 DNA 分子，并测定实验中的消化率。该方法有助于回答化学或生物学领域（如基因组学）中的关键问题。该方法的优势在于，科研人员可在完成其他实验后，使用酶消化预先染色的 DNA，以判断 DNA 是否保持完整长度。

演示该实验步骤的是我实验室的本科生 Drew Thompson。制备 0.7% 琼脂糖凝胶时，称取 1.4 克高熔点琼脂糖放入锥形瓶中。然后加入 200 毫升 1× TAE 缓冲液，并在瓶口倒扣一个烧杯。

将溶液放在加热板上加热，直至烧瓶底部开始产生气泡并上浮至液面。将溶液从加热板上取下，冷却至烧瓶可用手直接触摸。然后将凝胶倒入带有梳子的 24.5 厘米 × 21.8 厘米凝胶模具中，以形成加样孔。

使用移液枪枪头戳破靠近梳子或凝胶表面的气泡，并让凝胶至少凝固15分钟。为用六种不同浓度的染料对λ DNA进行染色，首先使用1× TE缓冲液配制300微升浓度为100纳克/微升的λ DNA溶液。将该溶液储存在4摄氏度条件下。

在准备每个预期酶切条带的以下染料浓度样品时，对75至100纳克未甲基化的λDNA进行染色。将样品在4摄氏度下孵育过夜。次日，为确定限制性内切酶是否能够消化染色的DNA，加入20单位的限制性内切酶、3微升最适切割效率的相应缓冲液，以及蒸馏、灭菌、过滤的水，总体积为30微升。

将反应体系置于酶活性最适温度的水浴中，孵育2至4小时。随后加入2微升0.5摩尔EDTA（pH 8.0）终止反应。取下预先制备好的凝胶模具的边条，将凝胶放入凝胶电泳槽中。

将2.5升1×TAE缓冲液倒入电泳槽中。然后小心地从凝胶中取出梳子，使加样孔暴露可用。将限制性内切酶反应液点样到塑料膜上，对于每份反应溶液，每5至6微升DNA溶液加入1微升6×上样染料。

然后用移液器将反应液加入孔中。取1微升1 kb DNA ladder、9微升1×TE缓冲液和2微升6×上样染料混合均匀，然后将该混合液加入位于其他样品孔两侧的孔中。

用深蓝色或黑色纸张或布料盖住电泳槽，然后将电泳槽连接至电源。将电源设置为 30 伏，过夜运行。电泳过程中关闭灯光，以防止标记的 DNA 发生光解。

第二天早晨，将托盘中的凝胶转移至含有45微升溴化乙锭和1升1x TAE缓冲液的容器中。将容器置于室温下避光保存，或用铝箔包裹以避免光照。让凝胶在室温下染色至少45分钟。

为了成像凝胶，将凝胶置于蓝光透射仪上，该仪器发射的光强峰值在400至500纳米之间。使用连接到成像系统的相机拍摄图像。根据文本方案确定实验的酶切效率。

酶的效率通过将预期条带总数除以可见条带数来确定。此外，为了确定条带的大致大小，需要设置对照，以了解与染色的DNA相比，天然DNA分子的预期位置。第三和第四泳道中条带的迁移率降低，导致条带向加样孔方向移动。

在这些泳道中，染料的用量对迁移率没有明显影响，因此条带与对照组一致。第五和第六泳道显示的条带多于对照组，表明存在部分消化，提示染料影响了识别位点的切割。在本实验中，所有染料浓度下均观察到了预期的条带，因此染料并未干扰DNA的消化。

为了观察YOYO-1染料浓度增加时迁移率的变化情况，在每条带旁边插入了彩色星号。例如，在不同YOYO-1浓度下，3.5千碱基的条带旁均标有红色星号。第五和第六泳道中出现的意外条带，其旁边则没有星号。

进行该实验操作时，务必记住用深色纸张覆盖凝胶，并在暗室中完成电泳。同时，确保使用避光的离心管进行反应。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用限制性内切酶消化荧光标记的DNA分子，并确定反应的消化速率。

请注意，溴化乙锭的操作可能具有极高危险性，因此在进行实验时应采取佩戴手套和护目镜等防护措施。此外，使用透射紫外灯时也务必佩戴合适的护目镜。