Name: 用限制性酶来测定染有菁染料的 DNA (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学习使用限制性酶消化荧光标记的DNA分子，评估DNA完整性并测定消化效率。该方法结合琼脂糖凝胶电泳与荧光显微镜技术，为基因组学和分子生物学研究提供可靠的DNA分析手段。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）（项目编号：5605100122001）、内布拉斯加大学卡尼尔分校（UNK）暑期学生研究项目（SSRP）以及内布拉斯加大学卡尼尔分校本科生研究奖学金（URF）资助。

1. 染料、缓冲液和琼脂糖凝胶的制备
<ol>
	<li>准备用于DNA染色或消化已染色DNA的以下溶液。
	<ol>
		<li>使用10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）在量筒或容量瓶中配制1x TE（Tris-HCl与EDTA）缓冲液。室温（18 - 25 °C）保存。</li>
		<li>分别分装每种染料：TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3、BOBO-3（见表1）。将4 µL的1 mM染料用移液器加入避光的棕色或黑色1.5 mL离心管中，再加入36 µL的1x TE缓冲液，用移液器混匀；此浓度可得100 µM染料溶液（总体积40 µL）。对每种染料均完成此步骤。4 °C保存。 
		注意：避免染料暴露于光线下，以防发生光漂白或降解。</li>
		<li>配制缓冲液1：含10 mM Bis-Tris-Propane-HCl、10 mM MgCl2和100 µg/mL牛血清白蛋白（BSA）。配制缓冲液2：含50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2和100 µg/mL BSA。配制缓冲液3：含50 mM醋酸钾、20 mM醋酸-Tris、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA。每种酶需使用其中一种特定缓冲液才能发挥功能。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于凝胶电泳的以下溶液。
	<ol>
		<li>通过将0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青蓝和15% Ficoll溶于dH2O中，配制6x上样染料。室温保存。</li>
		<li>配制0.7%琼脂糖凝胶：在锥形瓶中称取0.07 g高熔点（HGT）琼脂糖，加入100 mL 1x TAE缓冲液，并在瓶口倒置一个烧杯。
		<ol>
			<li>将溶液置于加热板上加热，直至瓶底开始产生气泡并上浮至液面。</li>
			<li>将溶液从加热板上取下，冷却至用手可直接触摸瓶壁为止，然后将凝胶倒入带有梳子的24.5 cm × 21.8 cm凝胶模具中，以形成加样孔。</li>
			<li>用移液器枪头刺破靠近梳子或凝胶表面的气泡，并使凝胶静置至少15分钟以完全凝固。凝胶可用保鲜膜包裹后于4 °C冰箱中保存1周，以防脱水或污染。有关凝胶电泳操作的更多信息，请参见Lee et al.33。 
			注意：使用具有30个独立加样孔的梳子。每个加样孔宽度应为4.5 mm，深度为2 mm。加样孔的高度取决于倒入模具中的凝胶体积。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用40 mM Tris-HCl、20 mM乙酸和1 mM EDTA配制1x TAE（Tris-醋酸-EDTA）缓冲液。室温（18 - 25 °C）保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 染色DNA的制备
<ol>
	<li>使用不同等分试样的染料对λ DNA（300-800 ng）进行染色。每种染料（表1）将测试六种不同浓度，每种限制性内切酶共进行48个反应。以下步骤描述了一个反应的设置过程（图1）。
	<ol>
		<li>用1× TE缓冲液将λ DNA稀释至100 ng/µL，于4 °C保存。配制总体积为300 µL的溶液。</li>
		<li>对未甲基化的λ DNA进行染色。根据酶切后预期出现的每条条带，估计每条带需要75–100 ng DNA。加入适量染料，使染料终浓度分别为1.9 µM、3.8 µM、19.4 µM、32.2 µM、48.3 µM和63.5 µM / 100 ng DNA。</li>
		<li>在4 °C下孵育过夜（15 h–18 h）。</li>
		<li>保留一个反应不加染料作为对照25。 
		注意：消化反应应使用未甲基化的DNA。甲基化敏感的限制性内切酶无法切割DNA中的甲基化区域，可能导致消化不完全的假象。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 限制性内切酶反应体系的制备
<ol>
	<li>用限制性内切酶消化染色的DNA，以确定该酶是否能够消化预染色的DNA（图1）。
	<ol>
		<li>次日，向样品中加入20 U限制性内切酶、3 µL相应的缓冲液（表2）以及去离子、高压灭菌并过滤的水，总体积为30 µL。对于每种酶切反应，应选择制造商官网推荐的、具有最高切割效率的缓冲液。</li>
		<li>将反应体系置于水浴中，在Maschmann et al. 所用6种酶各自最适酶活性温度下孵育2–4小时（表2）25。</li>
		<li>加入2 µL 0.5 M EDTA（pH 8.0）以终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从琼脂糖凝胶中电洗脱染色的DNA
<ol>
	<li>取下24.5 cm × 21.8 cm凝胶模具的侧板（步骤1.2.2），将凝胶放入凝胶电泳槽中。向槽中加入2.5 L的1×TAE缓冲液。小心移除凝胶中的加样梳，使加样孔暴露可用33。</li>
	<li>将限制性内切酶反应液滴加到塑料膜上，并将每个反应液与6×上样染料混合。对于每份反应溶液，每5–6 µL DNA溶液加入1 µL的6×上样染料（终浓度为1×）。然后将反应液（含上样染料，&#60;18 µL）上样至加样孔中。</li>
	<li>取1 µL 1 kb DNA ladder、9 µL 1×TE缓冲液和2 µL 6×上样染料混合。将该混合液上样至其他样品两侧的加样孔中。</li>
	<li>用深蓝色或黑色纸张或布料覆盖电泳槽。将电泳槽连接至电源，将电源设定为30 V，过夜运行（15–20 h）。电泳过程中关闭光源，以防止标记的DNA发生光解。</li>
	<li>次日早晨关闭电源。用托盘取出凝胶，转移至含有45 µL溴化乙锭和1 L 1×TAE缓冲液的容器中。将容器置于室温避光处保存，或用铝箔包裹以避免光照。室温下染色至少45分钟。 
	注意：使用溴化乙锭时需佩戴手套并佩戴护目镜。清洗含有溴化乙锭溶液的容器或丢弃凝胶时，请参照所在地区的废弃物处理指南处理使用过的溴化乙锭；此外，也可使用其他染料替代溴化乙锭。</li>
</ol>
5. 琼脂糖凝胶成像
<ol>
	<li>将凝胶置于蓝光透射仪上，该仪器在400-500 nm范围内发出最强光。使用连接到成像系统的相机拍摄图像。 
	警告：开启光源前，务必使用透射仪的防护盖并佩戴护目镜。 
	注意：此步骤也可使用任何紫外光源或标准凝胶扫描仪完成。</li>
	<li>通过将文件拖拽至ImageJ状态栏，在ImageJ中查看图像，图像将自动弹出。</li>
	<li>通过将凝胶上的条带与预期的in silico凝胶图谱进行比较，确定实验的消化率。计算消化率的方法是将实验中观察到的条带数量除以预期的DNA条带数量24,25。如果实验中消化后的DNA条带图谱与预期图谱一致，则消化率为1。如果图谱中的片段多于预期，则消化率大于1。如果图谱中的片段少于预期，则消化率小于1。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了消化荧光标记的 DNA (图 1)，需要进行一系列步骤。首先，DNA 需用荧光染料染色过夜。DNA 也可与氰化物二聚体孵育较短时间；然而，Carlsson et al. 发现，由于染色不完全，每种大小的 DNA 会出现双条带现象20。为解决此问题，可将 DNA 过夜染色，以避免双条带的产生。这是本实验方案中的关键步骤。如果染料孵育时间不足，染料与 DNA 的结合可能未达到平衡，从而导致双条带模式。若出现此情况，应延长 DNA 与染料混合物的平衡时间。
接下来，将限制性内切酶加入DNA-染料混合物中，在每种酶特定的温度下消化2 - 4小时。对于甲基化敏感的酶，DNA必须处于非甲基化状态。如果DNA被甲基化，则甲基化区域会抑制限制性内切酶对DNA的切割。此外，反应必须在适合该酶的缓冲液和温度条件下进行孵育。每种酶都附有推荐的缓冲液列表以及其在不同缓冲液中的活性数据。应尽可能选择酶活性为100%的缓冲液。关于温度，务必确保孵育...

TOTO 系列（TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3 和 BOBO-3；表1）广泛应用于需要对 DNA 进行可视化的多种实验中1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。由于其量子产率高、灵敏度高以及对 DNA 分子具有强亲和力，花青素二聚体染料家族被广泛应用18,19,20。花青素二聚体染料对双链 DNA 具有高度选择性，当其插入 DNA 后，荧光强度可增强 100 至 1000 倍21。吡啶𬭩类染料（YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3 和 TOTO-3）的发射波长比相应的喹啉𬭩类染料（BOBO-1、POPO-1、BOBO-3 和 POPO-3）更短（表1）22。此外，花青素二聚体插入 DNA 后的量子产率较高（0.2–0.6）22。然而，在利用酶来测定已用荧光染料染色的 DNA 分子的甲基化谱型2或拉伸状态23时，需要一种方法来确定哪些酶能够消化染色后的 DNA。任何能够插入 DNA 的染料，或任何能够对 DNA 底物产生可辨识模式的酶，均可用于该方法。
Meng et al. 首次通过凝胶电泳，使用多种不同的染料测定预染DNA的消化速率24。Maschmann et al. 进一步深入研究了TOTO系列染料。两者均测定了染色DNA的消化速率，以判断用特定染料染色的DNA是否可被限制性内切酶消化25。其他方法则利用光镊26或核磁共振（NMR）27研究染料插入DNA后的结合效应。这些方法均需要专用设备；而本方法则可利用大多数分子生物学实验室常见的设备，判断染料是否干扰限制性内切酶消化反应。
此外，在其他测量特定分子长度的方法中，光学作图技术通过将未染色的DNA分子在表面拉伸并进行消化，以确定片段的伸展程度和大小。已有研究表明，染料的嵌入会导致荧光染色的DNA分子轮廓长度增加，且根据所用染料的不同，其轮廓长度也有所差异21。该方法已被应用于多种基因组的研究1,3,4,6,13,28,29,30,31。然而，若分子预先染色，则根据染料和酶的种类不同，酶可能无法切割已被特定染料染色的DNA。因此，本方法旨在确定经特定染料染色的DNA是否仍可被酶消化。此外，根据染料的种类及其浓度，DNA条带在凝胶中的迁移速率会比天然DNA更慢，这是由于染料插入碱基对之间时导致DNA骨架部分解旋，从而影响其迁移能力32。
然而，这些染料有时会部分或完全抑制某些限制性内切酶的作用7,24。这可能是由于荧光染料与DNA结合后引起DNA结构改变，从而阻碍了酶对其特异性序列的识别。了解这些染料对限制性内切酶的影响，有助于需要分析DNA甲基化谱或染色DNA片段的实验。
在本方法中，DNA 用感兴趣的荧光染料染色后，经限制性内切酶消化。随后将 DNA 在凝胶中进行电泳，成像并测定限制性内切酶的消化率。限制性内切酶的选择依据其在凝胶上的切割模式。条带过多会导致 DNA 条带重叠，而条带过少则无法完整反映 DNA 分子的情况。因此，需找到一个合适的平衡点，以确定消化后 DNA 分子的图谱；该平衡点取决于所用的 DNA 和酶。该方法的优点在于其简便性，仅需使用限制性消化和凝胶电泳所需的常规设备。

<table><tbody><tr><td>未甲基化λ DNA</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>刺激性物质</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td>有毒</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>S25358</td><td>腐蚀性和刺激性</td></tr><tr><td>缓冲液1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>缓冲液2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>缓冲液3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>高凝胶温度琼脂糖凝胶</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>危险品</td></tr><tr><td>蓝光透射仪</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>需佩戴合适护目镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>溴化乙锭</td><td>Fisher</td><td>15585011</td><td>致癌物；其他替代品包括Nancy 520、Gel Red等</td></tr><tr><td>Cannon EOS Rebel T3I 相机</td><td>Cannon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Model H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Basic 电源供应器</td><td>Biorad</td><td>1645050&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

确定用花青染料染色的dna是否可被限制性酶消化

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

荧光显微镜下DNA的可视化依赖多种染料，例如氰基染料。这些染料因其对DNA具有高亲和力和高灵敏度而被广泛使用。为了在实验结束后判断DNA分子是否保持全长，需要采用一种方法，通过限制性内切酶消化DNA来确认染色后的分子是否完整。然而，染色后的DNA可能会抑制酶活性，因此需要一种方法来确定哪些限制性内切酶可用于荧光染料标记的DNA。本方法中，DNA与氰基染料在夜间孵育，以使染料与DNA充分平衡。随后，将染色的DNA用限制性内切酶进行消化，上样至凝胶并进行电泳。通过将实验所得的DNA消化条带与in silico（计算机模拟）预测的消化图谱进行比较，以评估限制性内切酶的活性。如果观察到的条带数量与预期一致，则表明反应完全；条带数量多于预期提示部分消化，少于预期则表明消化不完全。该方法的优势在于操作简便，并且仅需科研人员常规用于限制性内切酶分析和凝胶电泳的设备。该方法的局限性在于大多数科研人员可获得的酶为商业化酶；但理论上，任何限制性内切酶均可用于此方法。

为了确定插入性染料是否会影响限制性内切酶对DNA的消化，必须遵循正确的操作步骤顺序（图1）。在DNA经染色并用特定酶消化后，可拍摄凝胶图像以确定片段的数量及其大小（图2）。为了评估酶的消化效率，需将预期可见条带的总数除以实际观察到的可见条带数。若预期条带数与实际观察到的条带数一致，则酶效率等于1。若凝胶上的条带数多于预期，则该比值大于1，表明发生了部分消化。若条带数少于预期，则该比值小于1，表明消化不完全。在图2a中，第3和第4泳道显示条带的迁移率降低，导致条带向加样孔方向偏移。而在第1和第2泳道中，染料用量对迁移率无明显影响，因此条带与对照组一致。在图2a中，第5和第6泳道的条带多于对照组，表明发生了部分消化，说明染料影响了该酶在其识别位点对DNA的切割。在图2b中，所有染料...

对DNA分子进行荧光显微镜染色可使科研人员在实验过程中观察到它们。在本方法中，DNA分子首先用荧光染料进行预染色，然后用对甲基化和非甲基化敏感的限制性内切酶进行消化。

确定用花青染料染色的DNA是否可被限制性酶消化

荧光显微镜下DNA的可视化采用多种染料，例如氰基染料。这些染料因其对DNA的高亲和力而被广泛使用。

本实验的总体目标是利用对甲基化敏感和非敏感的限制性内切酶消化荧光标记的 DNA 分子，并测定实验中的消化率。该方法有助于回答化学或生物学领域（如基因组学）中的关键问题。该方法的优势在于，科研人员可在完成其他实验后，使用酶消化预先染色的 DNA，以判断 DNA 是否保持完整长度。演示该实验步骤的是我实验室的本科生 Drew Thompson。制备 0.7% 琼脂糖凝胶时，称取 1.4 克高熔点琼脂糖放入锥形瓶中。然后加入 200 毫升 1× TAE 缓冲液，并在瓶口倒扣一个烧杯。将溶液放在加热板上加热，直至烧瓶底部开始产生气泡并上浮至液面。将溶液从加热板上取下，冷却至烧瓶可用手直接触摸。然后将凝胶倒入带有梳子的 24.5 厘米 × 21.8 厘米凝胶模具中，以形成加样孔。使用移液枪枪头戳破靠近梳子或凝胶表面的气泡，并让凝胶至少凝固15分钟。为用六种不同浓度的染料对λ DNA进行染色，首先使用1× TE缓冲液配制300微升浓度为100纳克/微升的λ DNA溶液。将该溶液储存在4摄氏度条件下。在准备每个预期酶切条带的以下染料浓度样品时，对75至100纳克未甲基化的λDNA进行染色。将样品在4摄氏度下孵育过夜。次日，为确定限制性内切酶是否能够消化染色的DNA，加入20单位的限制性内切酶、3微升最适切割效率的相应缓冲液，以及蒸馏、灭菌、过滤的水，总体积为30微升。将反应体系置于酶活性最适温度的水浴中，孵育2至4小时。随后加入2微升0.5摩尔EDTA（pH 8.0）终止反应。取下预先制备好的凝胶模具的边条，将凝胶放入凝胶电泳槽中。将2.5升1×TAE缓冲液倒入电泳槽中。然后小心地从凝胶中取出梳子，使加样孔暴露可用。将限制性内切酶反应液点样到塑料膜上，对于每份反应溶液，每5至6微升DNA溶液加入1微升6×上样染料。然后用移液器将反应液加入孔中。取1微升1 kb DNA ladder、9微升1×TE缓冲液和2微升6×上样染料混合均匀，然后将该混合液加入位于其他样品孔两侧的孔中。用深蓝色或黑色纸张或布料盖住电泳槽，然后将电泳槽连接至电源。将电源设置为 30 伏，过夜运行。电泳过程中关闭灯光，以防止标记的 DNA 发生光解。第二天早晨，将托盘中的凝胶转移至含有45微升溴化乙锭和1升1x TAE缓冲液的容器中。将容器置于室温下避光保存，或用铝箔包裹以避免光照。让凝胶在室温下染色至少45分钟。为了成像凝胶，将凝胶置于蓝光透射仪上，该仪器发射的光强峰值在400至500纳米之间。使用连接到成像系统的相机拍摄图像。根据文本方案确定实验的酶切效率。酶的效率通过将预期条带总数除以可见条带数来确定。此外，为了确定条带的大致大小，需要设置对照，以了解与染色的DNA相比，天然DNA分子的预期位置。第三和第四泳道中条带的迁移率降低，导致条带向加样孔方向移动。在这些泳道中，染料的用量对迁移率没有明显影响，因此条带与对照组一致。第五和第六泳道显示的条带多于对照组，表明存在部分消化，提示染料影响了识别位点的切割。在本实验中，所有染料浓度下均观察到了预期的条带，因此染料并未干扰DNA的消化。为了观察YOYO-1染料浓度增加时迁移率的变化情况，在每条带旁边插入了彩色星号。例如，在不同YOYO-1浓度下，3.5千碱基的条带旁均标有红色星号。第五和第六泳道中出现的意外条带，其旁边则没有星号。进行该实验操作时，务必记住用深色纸张覆盖凝胶，并在暗室中完成电泳。同时，确保使用避光的离心管进行反应。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用限制性内切酶消化荧光标记的DNA分子，并确定反应的消化速率。请注意，溴化乙锭的操作可能具有极高危险性，因此在进行实验时应采取佩戴手套和护目镜等防护措施。此外，使用透射紫外灯时也务必佩戴合适的护目镜。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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