Name: 使用斑马鱼作为体内模型系统分析 DNA 复制定时 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解如何使用斑马鱼胚胎建立全基因组DNA复制定时图谱，以研究细胞周期与染色质生物学。该方法可揭示胚胎发育过程中染色质变化对DNA复制起始的影响机制。

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本工作由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所通过资助编号5P20GM103636-02（包括流式细胞术核心支持）和1R01GM121703提供支持，同时获得俄克拉何马州成人干细胞研究中心奖项的资助。

所有动物均严格按照俄克拉荷马医学研究基金会机构动物护理和使用委员会批准的方案进行操作。
1. 准备成年斑马鱼用于繁殖
<ol>
	<li>使用单一品系的大量成年雄性和雌性斑马鱼进行繁殖。即使是同一品系的斑马鱼，其遗传组成也存在微小差异，因此应使用大样本量以确保结果能够代表群体的遗传变异性，而非局限于群体中的少数个体。</li>
	<li>在收集胚胎的前一晚，将数十条成年斑马鱼放入繁殖用鱼缸中，雄性和雌性数量应大致相等。根据实验需求，采用以下其中一种繁殖策略。
	<ol>
		<li>繁殖策略1：将少量雄性和雌性斑马鱼分别放入独立的繁殖鱼缸中，并用隔板将雄鱼和雌鱼分开。若采用此方法，需设置多个不同的繁殖鱼缸，并将各个鱼缸中的胚胎混合收集，以确保生物学变异性能够代表整个群体。</li>
		<li>繁殖策略2：将数十条雄性和雌性斑马鱼共同放入一个较大的繁殖鱼缸中。只要获得的胚胎数量足够多，就可以合理地认为它们来源于多个亲本个体，因而具有群体的遗传代表性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 定时交配——收集、分选和饲养斑马鱼胚胎用于实验
<ol>
	<li>在早晨光照周期开始后立即进行定时交配。丢弃夜间产生的任何胚胎。</li>
	<li>让鱼在浅水（3–5 cm）中繁殖10分钟，并设置假底以便胚胎穿过逃逸。</li>
	<li>10分钟后，通过滤网收集胚胎，并用洗瓶将胚胎冲洗至一个10 cm培养皿中。将同一时间点收集的所有胚胎合并，标记收集时间，并立即放入28.5 °C的培养箱中。</li>
	<li>单对交配的成鱼一天内可获得数百枚胚胎。让成鱼以10分钟为周期反复交配，直至每次获得的胚胎数量少于20枚为止。</li>
	<li>收集后约1–1.5小时，对胚胎进行筛选，剔除死亡和未受精的胚胎。筛选时，将胚胎从培养箱中取出，在解剖显微镜下观察。
	<ol>
		<li>统计胚胎数量，并以每10 cm培养皿100枚胚胎的密度放置。</li>
		<li>加入新鲜E3培养基（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl2，0.33 mM MgSO4），然后将胚胎放回28.5 °C培养箱中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脱膜、去卵黄并固定斑马鱼胚胎
注意：本实验方案部分适用于受精后48小时（hpf）之前的胚胎。对于发育较晚阶段（受精后48 hpf以上）的胚胎，无需去除绒毛膜，因为此时绒毛膜通常会自然脱落。对于受精后5天（dpf）以上的幼鱼，无需去卵黄或去除绒毛膜。
<ol>
	<li>当胚胎发育至目标阶段时，根据形态学特征在光学显微镜下确认其发育阶段是否合适 &#34;斑马鱼胚胎发育阶段&#34;17.</li>
	<li>将最多1500个已分期的胚胎转移至15 mL锥形管中，用E3缓冲液洗涤数次。
	<ol>
		<li>每100个胚胎加入1 mL E3和20 µL蛋白酶溶液（30 mg/mL），轻轻摇动。单个离心管中最多可使用15 mL E3对1500个胚胎进行去壳处理。</li>
		<li>将试管平放，使胚胎均匀铺开成一层，以确保最大的表面积与体积比。每2-3分钟轻轻振荡试管一次，直至所有胚胎的绒毛膜完全脱落。总脱膜时间取决于Pronase的活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，用10 mL E3溶液轻柔冲洗胚胎3次。将胚胎置于冰上，完成本实验步骤的后续操作。</li>
	<li>去除E3并用新配制的冰冻去卵黄缓冲液（0.5×Ginzburg鱼林格溶液，无钙：55 mM NaCl，1.8 mM KCl，1.25 mM NaHCO₃）洗涤胚胎3).
	<ol>
		<li>加入最多 500 个胚胎的 1 mL 冰冷脱卵黄缓冲液。</li>
		<li>使用 P1000 移液器轻柔地将胚胎上下吹打 5–10 次，以破坏卵黄囊。</li>
		<li>将1 mL转移至1.5 mL离心管中，在4 °C、500 × g条件下离心5 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移去上清液，用1 mL预冷的1×PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.0）洗涤沉淀，以去除林格氏液。在4 °C、500 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>小心吸除上清液，将细胞重悬于 1 mL 1×PBS 中。将离心管置于冰上。</li>
	<li>向一个15 mL的锥形管中加入3 mL预冷的乙醇（EtOH）。将装有EtOH的管子在低速下轻轻涡旋震荡。
	<ol>
		<li>使用 P1000 移液器，将斑马鱼胚胎细胞悬液缓慢滴加（每秒 1 滴）至乙醇中，同时轻轻涡旋。</li>
		<li>加入胚胎细胞悬液共1 mL，使最终固定液浓度为75% EtOH。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入1 mL细胞悬液后，轻轻摇动离心管混匀，并置于-20 °C环境中至少1小时。建议将离心管平放，以确保最大的表面积与体积比，减少胚胎和细胞聚集粘连。胚胎细胞可在-20 °C条件下保存2至3周。</li>
</ol>
4. 染色DNA并使用流式细胞术分选胚胎
注意：本实验方案的此部分适用于受精后1天的胚胎。
<ol>
	<li>从 -20 °C 取出乙醇固定的胚胎细胞，在 4 °C 下以 1500 × g 离心 5 分钟。
	<ol>
		<li>将离心管置于冰上，小心吸除上清液。使用 P1000 移液器，用 1 mL 新鲜配制的冷 PBS-BSA（1× PBS，1% 牛血清白蛋白）轻柔重悬细胞。</li>
		<li>在 4 °C 下以 1500 × g 离心 5 分钟，然后将管子放回冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，并用碘化丙啶（PI）染色液（50 µg/mL PI，100 µg/mL RNase A，PBS，pH 7.0）重悬细胞，每 1000 个胚胎使用 200 µL。
	<ol>
		<li>将细胞在冰上孵育于 PI 染色液中 30 分钟，每 5 分钟轻轻混匀一次。</li>
		<li>将一个 40 µm 尼龙细胞滤网置于冰上的 50 mL 锥形管上。轻柔地用移液器吹打细胞，使其混合并通过滤网。 
		注意：如果在本方案第 3 节中收集了同一时间点的多个管胚胎样本，应在本步骤合并这些胚胎，以便一起进行分选。</li>
		<li>使用注射器活塞内侧的平头端，轻柔地破坏滤网上残留的任何细胞团块。</li>
		<li>每 1000 个胚胎用 500 µL 冷 PBS-BSA 冲洗细胞，使其通过滤膜。</li>
		<li>将一个 40 µm 滤网置于冰上的 15 mL 锥形管上，将来自 50 mL 锥形管的细胞悬液再次过滤至 15 mL 管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的细胞分选仪器，将激光激发波长设为 561 nm，发射检测波长设为 610/20，以检测碘化丙啶。
	<ol>
		<li>短暂涡旋混匀 15 mL 管中的染色细胞，然后将其置于仪器中，保持 4 °C。</li>
		<li>以较慢的流速运行细胞，理想流速为 1.0 mL/min，以获得清晰的细胞周期图谱，并避免将 G1 或 G2/M 期细胞与 S 期细胞群体混合。</li>
		<li>首先，在 FSC-A × SSC-A（前向散射面积 vs. 侧向散射面积）图上设门，以去除碎片（图 1A）。 
		注意：胚胎来源的细胞大小可能因发育阶段和细胞类型而异。根据细胞大小，可能需要在中性密度（ND）滤光片的 1.0 和 1.5 之间切换。设门范围应较大，以尽可能收集多数细胞并去除碎片。</li>
		<li>其次，在 SSC-A（侧向散射面积）与 PI-A（碘化丙啶面积）图上设门，以去除碎片和细胞双联体（图 1B）。</li>
		<li>第三，在 SSC-A 与 SSC-W（宽度）图上设门，以去除任何残留的细胞双联体（图 1C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在直方图上显示设门后的细胞群体，y 轴为细胞数量（计数），x 轴为碘化丙啶面积（PI-A）。对于 24 hpf 胚胎，应得到如 图 1D 所示的典型细胞周期图谱。
	<ol>
		<li>为分选 S 期细胞群体，将门设在 G1 峰右侧至 G2 峰左侧之间，仅包含极少量的 G1 和 G2 群体。对于 24 hpf 胚胎，这通常约占设门后群体的 10–15%（见 图 1D）。</li>
		<li>为分选 G1 期细胞群体，将门设在 G1 峰左侧，不超过峰顶。尽可能将 G1 门的宽度设得最窄（见 图 1D）。</li>
		<li>对 G1 和 S 期细胞群体进行反向设门，以确认初始设门的准确性（图 1E）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 G1 和 S 期细胞群体分选至含有 3 mL PBS-BSA 的 15 mL 锥形管中。目标是每组分（G1 和 S 期）获得 500,000 至 100 万或更多的分选细胞。</li>
	<li>分选完成后，在 1500 × g 和 4 °C 下离心 10 分钟。 
	注意：细胞沉淀量较小，难以观察，因此应避免扰动沉淀。建议优先使用水平转子而非固定角转子。</li>
	<li>小心吸除上清液，并用 1 mL 1× PBS 重悬沉淀。将细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 6,000 × g 和 4 °C 下离心 5 分钟。</li>
	<li>小心吸除管中所有液体，并在 -20 °C 下冷冻干燥沉淀。将沉淀在 -20 °C 下保存 2–3 周。</li>
</ol>
5. DNA 提取、RNase 处理及 DNA 纯化
<ol>
	<li>从 -20 °C 取出细胞沉淀，置于冰上。
	<ol>
		<li>向沉淀中加入 400 µL SDS 缓冲液（50 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA，1 M NaCl，0.5% SDS），重悬细胞。</li>
		<li>加入蛋白酶 K 至终浓度为 0.2 mg/mL，短暂涡旋混匀。</li>
		<li>将样品在 56 °C 孵育 2 小时，每 15 分钟涡旋一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育 2 小时后，加入 400 µL 苯酚-氯仿（苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1，用 10 mM Tris (pH 8.0)、1 mM EDTA 饱和）进行苯酚-氯仿抽提。
	<ol>
		<li>涡旋 20 秒，然后在 16,000 × g 离心 5 分钟以分离相层。</li>
		<li>小心吸取上层水相（400 µL），转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过加入 40 µL 3M 醋酸钠（pH 5.2）、2 µL 糖原和 1 mL 乙醇进行乙醇沉淀。
	<ol>
		<li>涡旋充分混匀，于 -20 °C 过夜沉淀 DNA。也可在 -80 °C 或干冰中沉淀 1&#160;小时。</li>
		<li>在 4 °C、16,000 × g 离心 30 分钟以沉淀 DNA。</li>
		<li>弃去上清液，用 1 mL 70% 乙醇洗涤沉淀，在 4 °C、16,000 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀在室温下空气干燥 2–3 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将沉淀溶解于 96 µL 灭菌水中，加入 4 µL RNase A（2 mg/mL）。
	<ol>
		<li>充分涡旋混匀，在 37 °C 孵育 1&#160;小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 100 µL 苯酚-氯仿，按照步骤 5.2.1–5.2.2 的操作进行苯酚-氯仿抽提。</li>
	<li>加入 10 µL 3M 醋酸钠、1 µL 糖原和 250 µL 乙醇，按照步骤 5.3.1–5.3.5 的操作进行乙醇沉淀。</li>
	<li>将沉淀重悬于 60 µL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，10 mM EDTA (pH 8.0)）中，使用基于定量荧光的方法测定 DNA 浓度。将 DNA 储存于 -20 °C。 
	注意：使用基于荧光的 DNA 结合染料或其他比紫外分光光度法更可靠的方法定量 DNA 至关重要。</li>
</ol>
6. DNA文库制备与下一代测序
注意：每次测序运行都需要为每个生物来源提供一个G1拷贝数参考样本即 野生型、突变体、转基因、细胞系等。在同一测序运行中，将来自相同生物来源的所有S期样本与同一个G1期参考样本进行比较。每种样本至少进行两次生物学重复，以确保样本间的一致性。
<ol>
	<li>将1 µg DNA稀释至终体积50 µL，并转移至用于超声处理的专用管中。</li>
	<li>根据制造商的说明书和操作流程，使用聚焦式超声波仪对基因组DNA进行剪切，目标片段大小为250-300 bp。</li>
	<li>根据制造商的说明书和操作流程，使用自动电泳仪检测剪切后基因组DNA的质量和片段大小。确保剪切后的基因组DNA在~250-300 bp处出现明显主峰。</li>
	<li>根据制造商的操作流程，使用带有用于Illumina平台测序的多重寡核苷酸接头的DNA文库构建试剂盒制备测序文库。</li>
	<li>根据制造商的操作流程，使用自动电泳仪检测文库构建的质量。确保在~400-450 bp处出现明显主峰，引物二聚体（80-85 bp）和接头二聚体（~120 bp）的峰信号尽可能少。</li>
	<li>根据制造商的操作流程，使用下一代DNA测序专用的DNA文库定量试剂盒对文库进行定量。</li>
	<li>将15 µL文库稀释至5 nM浓度，并根据需要混合多重文库，以达到每个样本预期的唯一比对读段数。 
	注意：每个样本的唯一比对读段数将决定分辨率。评估斑马鱼基因组的复制时序时，可使用低至500万条比对读段，建议起始使用1000万至2000万条读段。</li>
	<li>根据制造商的操作说明，在下一代测序平台上对样本进行双端100 bp的全基因组DNA测序。</li>
</ol>
7. 测序数据分析
注意：本节中的说明仅作为分析的指导原则。可使用其他方法进行序列比对、过滤、处理等操作。本实验方案的这一部分将介绍本研究中首选的分析方法。如果采用其他方法，请根据具体目的调整相应的参数和函数。以下命令在已安装适当软件包的 Ubuntu 或 Mac 终端中输入执行。
<ol>
	<li>从 UCSC 基因组浏览器获取斑马鱼基因组的最新版本（撰写本方案时为 danRer10），使用以下命令： 
	wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
	<ol>
		<li>使用以下命令解压 fa.gz 文件： 
		gunzip danRer10.fa.gz</li>
		<li>使用 BWA-mem 将测序数据比对到基因组，使用以下命令： 
		bwa mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq &#62; output.sam</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 samtools 将 .sam 文件转换为 .bam 文件，使用以下命令： 
	samtools view -bS input.sam &#62; output.bam
	<ol>
		<li>使用 samtools 对比对后的测序文件进行排序，使用以下命令： 
		samtools sort output.bam &#62; output_sorted.bam</li>
		<li>使用 samtools 对 .bam 文件建立索引，使用以下命令： 
		samtools index output.bam</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Picard 标记 PCR 重复序列，使用以下命令： 
	java -Xmx2g -jar picard.jar MarkDuplicates \ 
	INPUT=input.bam 
	OUTPUT=output.bam 
	REMOVE_DUPLICATES=false 
	METRICS_FILE=output_metrics.txt</li>
	<li>使用以下命令为每条染色体生成包含 reads 的文本（.txt）文件： 
	for i in {1..25}; do CHROM=&#34;chr&#34;$i; echo $CHROM; samtools view input.bam $CHROM | cut -f 2,4,5,7,8,9 &#62; readsChr${i}.txt; done 
	注：生成的 .txt 文件中各列分别为 Flag、Location、mapQ、pair chr、pair location 和片段大小。</li>
	<li>使用 textscan 函数将 .txt 文件读入 Matlab（或任何其他类似软件）。
	<ol>
		<li>通过设置 mapQ 阈值为 30，过滤掉低比对质量的 reads。</li>
		<li>去除非主要比对、PCR 重复或成对 reads 比对到不同染色体的 reads。</li>
		<li>过滤掉其配对 reads 距离超过 2000 bp 的 reads。</li>
		<li>评估最终 reads 的统计信息，以确定 reads 数量、覆盖度、插入片段大小和质量（图 2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在每条染色体长度范围内以 100 bp 为间隔统计 reads 数量，确定每个样本在 100 bp 固定窗口中的 reads 覆盖度。
	<ol>
		<li>计算所有窗口的中位数 reads 数量。</li>
		<li>通过去除偏离中位数超过 5 个标准差的窗口，过滤高覆盖度区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 G1 参考样本中，使用滑动窗口沿每条染色体寻找包含 200 个 reads 的片段，以定义分析区域。
	<ol>
		<li>通过统计 S 期样本中在对应 G1 参考样本所定义的 200-reads 窗口内的 S 期 reads 数量，确定每个 S 期样本的测序深度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用软件中的 csaps 函数对原始数据进行平滑处理，插值因子（p）设为 10-16。</li>
	<li>将平滑后的数据标准化为 z-score，均值为 0，标准差为 1。</li>
</ol>

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<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

斑马鱼为研究DNA复制时序提供了一种新颖而独特的体内模型系统。按照本实验方案中详述的方法进行定时交配，可在一天内收集数千枚胚胎用于实验。这些胚胎以精确的时间节点和明确的发育阶段同步发育。由于斑马鱼胚胎在体外发育且具有良好的光学透明性，因此可通过体视显微镜根据形态学特征对斑马鱼进行简便而准确的分期。本方案详细描述了利用斑马鱼胚胎研究脊椎动物整个发育过程中DNA复制时序的方法。
实验方案中可能出现问题的环节包括斑马鱼胚胎发育的同步性、制备过程中的细胞损失、FACS 分选以及文库构建。斑马鱼的发育时间受温度影响，因此实验应使用适应明/暗周期且饲养在 28.5 °C 条件下的斑马鱼。为确保发育同步，需进行精确计时的交配，并在极短的时间窗口内（10 分钟或更短）收集胚胎。维持胚胎在 28.5 °C 环境中至关重要，并应尽量减少其暴露于室温下的时间。斑马鱼的发育时间还高度依赖于单位区域内的胚胎密度。饲养密度不得超过每 10 cm 培养皿 100 个胚胎，否则将导致发育异常。移除死亡和未受精胚胎的最佳时机是胚胎发育至 4–16 细胞阶段，此时可轻松识别是否受精（可参考&#34;...

细胞要成功分裂，必须首先准确而忠实地复制其全部基因组。基因组的复制以一种可重复的模式进行，称为DNA复制时序程序1。DNA复制时序与染色质结构、表观遗传标记以及基因表达密切相关2,3。在发育过程中，复制时序会发生动态变化，并与转录程序以及染色质标记和结构的改变显著相关4,5。此外，复制时序与突变频率相关，在多种癌症中均观察到复制时序的改变6,7,8。尽管已有上述发现，复制时序建立与调控的机制及其决定因素在很大程度上仍不清楚，其在发育和疾病中的作用也尚未明确。此外，直到最近，脊椎动物发育过程中全基因组范围内的复制时序变化仅在细胞培养模型中得到研究。
斑马鱼， 斑马鱼，非常适合用于研究复制时序 体内 在发育过程中，单个交配对可产生数百个胚胎，这些胚胎发育迅速，且在许多方面与哺乳动物的发育相似9,10此外，在斑马鱼发育过程中，细胞周期、染色质结构和转录程序会发生变化，这些变化与DNA复制时序存在关联。11斑马鱼也是一种优秀的遗传学模型，因其特别适用于转基因、诱变和靶向突变等遗传操作，且通过遗传筛选已鉴定出许多脊椎动物发育所必需的基因12因此，斑马鱼可用于鉴定参与复制时间建立与维持的基因，并观察复制时间失调对脊椎动物发育的影响。转基因品系还可用于评估在不同发育阶段或疾病状态下分离的特定细胞类型中的复制时间。重要的是，目前已建立多种人类疾病斑马鱼模型，可用于研究复制时间在疾病发生与进展中的作用。9,13,14.
最近，首个斑马鱼复制时间谱型得以绘制，确立了其作为研究复制时间的模式系统 体内15为此，从斑马鱼胚胎发育的多个阶段以及成年斑马鱼中分离的特定细胞类型中收集细胞。随后根据DNA含量，通过FACS（荧光激活细胞分选）对细胞进行分选，以分离出G1期和S期细胞群体。以G1期样本作为拷贝数对照，测定S期群体中的拷贝数变异，并据此推断相对复制时间16随后可在不同发育阶段的样本和细胞类型之间直接比较复制时间的变化，并利用该方法确定所发生的复制时间改变 体内 在脊椎动物发育过程中。该方法相较于其他基因组学方法具有多项优势，主要在于无需使用胸腺嘧啶类似物标记或进行DNA免疫沉淀4,6.
本文详细介绍了在斑马鱼中以高分辨率分析全基因组DNA复制时序的实验方案。这些方案已被用于确定斑马鱼基因组中复制时序与基因组及表观遗传特征之间的关联，并可用于分析这些关联在发育过程中发生的变化。这些方案还可轻松适用于研究斑马鱼突变品系及疾病模型中复制时序的改变。此外，通过首先从斑马鱼中分离特定细胞类型，这些方法可进一步拓展用于研究特定细胞类型中的复制时序。斑马鱼可作为研究脊椎动物发育和人类疾病机制的优良模型，其胚胎透明、体外发育以及遗传操作便利等特点使其成为探究DNA复制调控的理想系统。 
斑马鱼、DNA复制时序、全基因组分析、高分辨率测序、表观遗传学、发育生物学、突变体模型、疾病模型、细胞分选 体内 研究复制时序的模型系统，并最终揭示这一重要表观遗传特征的生物学功能。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>费舍尔科技</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>费舍尔科技</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>默克密理博</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>费舍尔科技</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>西格玛</td><td>10165921001</td><td>蛋白酶溶液</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>西格玛</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（EtOH）</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>西格玛</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>英杰公司</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>费舍尔科技</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>西格玛</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>圣克鲁兹</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿</td><td>西格玛</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>安必昂</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>英杰公司</td><td>Q33130</td><td>基于荧光的DNA定量试剂</td></tr><tr><td>Covaris AFA 微管</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>用于超声处理的专用管</td></tr><tr><td>Covaris E220 超声仪</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>聚焦式超声破碎仪</td></tr><tr><td>安捷伦 4200 Tapestation</td><td>安捷伦</td><td>G2991AA</td><td>自动化电泳仪</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>安捷伦</td><td>5067-5582</td><td>自动化电泳仪配套试剂</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA文库构建试剂盒（适用于Illumina）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>货号#E7370L</td><td>DNA文库构建试剂盒</td></tr><tr><td>NEBNext 多重引物试剂盒（适用于Illumina，Index Primers Set 1）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>货号#E7335S</td><td>DNA文库构建用多重寡核苷酸</td></tr><tr><td>NEBNext 多重引物试剂盒（适用于Illumina，Index Primers Set 2）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>货号#E7500S</td><td>DNA文库构建用额外多重寡核苷酸</td></tr><tr><td>NEBNext 文库定量试剂盒（适用于Illumina）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E7630L</td><td>文库构建定量试剂盒</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A63882</td><td>磁珠</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td>新一代DNA测序平台</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon 尼龙细胞筛</td><td>费舍尔科技</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR 一次性培养皿 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>适用于Nichiryo Model 8100的6.0 mL注射器</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 管，1.7 mL，透明色</td><td>丹维尔科学</td><td>C2170 (1001002)</td><td>无DNA酶/RNA酶</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 涡旋振荡器</td><td>科学仪器公司</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>低密度聚乙烯，广口</td></tr><tr><td>筛网</td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6.9 cm，细网</td></tr><tr><td>繁殖槽</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>独立式繁殖槽</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A</td><td>大型繁殖槽</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD 生物科学</td><td>N/A</td><td>细胞分选仪</td></tr><tr><td>Wild M5a 体视显微镜</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>解剖显微镜</td></tr><tr><td>Qubit 3 荧光计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33216</td><td>基于定量荧光法测定DNA浓度的方法</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>版本 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 统计工具箱</td><td>Mathworks</td><td>版本 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab 曲线拟合工具箱</td><td>Mathworks</td><td>版本 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

使用斑马鱼进行dna复制时间分析 在体 内 模型系统

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA复制时序是一种重要的细胞特征，与染色质结构、转录活动以及DNA突变率具有显著关联。在发育过程和癌症中均会发生复制时序的改变，但复制时序在发育和疾病中的具体作用尚不明确。斑马鱼 recently 被确立为研究复制时序的 in vivo 模型系统。本文详细描述了利用斑马鱼确定DNA复制时序的实验方案。通过对胚胎和成年斑马鱼的细胞进行分选后，可通过分析下一代测序数据中的DNA拷贝数变化，构建高分辨率的全基因组DNA复制时序图谱。斑马鱼模型系统可用于评估在体内整个发育过程中发生的复制时序变化，也可用于分析特定细胞类型、疾病模型或突变品系中的时序改变。这些方法将有助于研究发育过程中复制时序建立与维持的机制及其决定因素，揭示复制时序在突变和肿瘤发生中的作用，并探究干扰复制时序对发育和疾病的影响。

利用已发表的复制时序数据，提供代表性的复制时序谱图及质量控制指标15。数据处理的初始步骤包括将测序数据比对到基因组、计算读段长度和基因组覆盖度统计量，并过滤低质量、未配对以及PCR重复的读段。典型斑马鱼测序样本的读段统计结果如图2所示。过滤后，在不同大小的窗口中确定读段计数，并对数据进行平滑和归一化处理。典型斑马鱼染色体在生物学重复样本中的平滑/归一化复制时序谱图如图3A所示。生物学重复与实验重复的谱图在视觉上应极为相似（见图3A），并且在整个染色体长度范围内表现出高度相关性（图3B）。全基因组范围内的时序值也应表现出高度相关性（图3C）。应使用自相关分析（一种评估模式连续性的方法）来评价数据集中结构特征的程度（<strong c...

斑马鱼最近被用作一种 体内 研究发育过程中DNA复制时序的模式系统。本文详细介绍了利用斑马鱼胚胎进行复制时序分析的实验方案。该方案可轻松适用于突变体、特定细胞类型、疾病模型及其他物种中的复制时序研究。

使用斑马鱼进行DNA复制时间分析 在体 内 模型系统

DNA复制时序是一种重要的细胞特征，与染色质结构、转录以及DNA损伤修复等过程具有显著关联。

本实验的总体目标是从不同发育阶段的斑马鱼胚胎中生成全基因组DNA复制时间图谱。该方法有助于回答细胞周期和染色质生物学领域中的关键问题，例如胚胎发育过程中发生的染色质变化如何影响DNA复制叉的起始。该技术的主要优势在于，它能够绘制出在胚胎发育特定阶段体内发生的DNA复制动态变化图谱。尽管该方法可揭示斑马鱼发育过程中DNA复制的变化，也可应用于其他系统或模式生物，例如尾索动物、青蛙和果蝇。通常，初学者可能在该方法的操作上遇到困难，因为从斑马鱼胚胎制备单细胞悬液需要一定的练习。在收集胚胎的前一晚，将数十条用于繁殖的成鱼以大致相等的雌雄比例放入繁殖缸中。根据实验需求，采用以下繁殖策略之一。第一种繁殖策略：将数条雄性和雌性斑马鱼分别放入独立的繁殖缸中，并使用隔板将雄鱼与雌鱼隔开。若采用此方法，需设置多个不同的繁殖缸，并将每缸的胚胎混合收集，以确保生物学变异性能够代表整个种群。对于第二种繁殖策略，将数十条雄性和雌性斑马鱼放入一个大型繁殖缸中进行交配。只要胚胎数量足够多，即可采用此策略。可以合理地认为这些胚胎来源于多种不同的亲鱼，因此在遗传上具有种群代表性。为了进行定时交配，应在早晨光照周期开始后立即进行。让鱼在浅水中交配10分钟，底部放置假底，以便胚胎能够穿过。10分钟后，通过将水和胚胎倒入滤网中，并用洗瓶冲洗至一个10厘米的培养皿中来收集胚胎。将同一时间点收集的所有胚胎合并，标记收集时间，并立即置于28.5摄氏度的培养箱中。为确保收集到同步发育的胚胎，必须每隔10分钟收集一批胚胎，这一点在胚胎发育的最早阶段尤为重要。单对交配的成虫一天内可获得数百个胚胎。让成虫以10分钟为周期进行交配，直至每次获得的胚胎数量少于20个为止。收集胚胎后约1至1.5小时，将胚胎从培养箱中取出，在体视显微镜下观察，筛选并去除死亡和未受精的卵。计数胚胎，并以每10厘米培养皿100个胚胎的密度进行放置。加入新鲜的E3培养基，将胚胎放回28.5°C的培养箱中。当胚胎发育至目标阶段时，根据《斑马鱼胚胎发育各阶段》在光学显微镜下通过形态学特征确认发育阶段。如果胚胎处于48小时或更早的发育阶段，将最多1500个处于相同发育阶段的胚胎转移至一个15毫升的锥形管中，并使用E3培养基洗涤数次。每100个胚胎加入1毫升E3培养基和20微升Pronase溶液，轻轻摇动。单个管中最多可使用15毫升E3培养基对1500个胚胎进行去绒毛膜处理。将管子侧放，使胚胎均匀铺成一层，以确保最大的表面积与体积比。每两到三分钟轻轻振荡试管一次，直至所有胚胎的绒毛膜完全脱落。总脱膜时间将根据蛋白酶的活性而有所不同。移除上清液后，用 10 毫升 E3 培养基轻轻冲洗胚胎三次。将胚胎置于冰上并除去残留的 E3 后，每 500 个胚胎使用 1 毫升 freshly prepared、冰冻的去卵黄缓冲液洗涤样品。接着，用 P1000 轻柔地将胚胎上下吹打 5 至 10 次，以破坏卵黄囊。然后，将 1 毫升样品转移至 1.5 毫升微量离心管中，在 4 °C、500 × g 条件下离心 5 分钟。样品的吹打力度应足够充分，以形成单细胞悬液，但不可过度导致细胞裂解。此步骤需要一定练习。移除上清液后，用一毫升预冷的1×PBS洗涤沉淀，以去除林格氏液。然后，再次离心样品。小心吸除上清液，并将细胞重悬于 1 毫升 1× PBS 中。接着，将离心管置于冰上。向一个15毫升的锥形管中加入3毫升预冷的乙醇，并在低速下轻轻涡旋振荡该乙醇管。使用P1000移液器，将斑马鱼胚胎细胞悬液缓慢滴加到乙醇中，同时持续涡旋振荡。总共加入1毫升胚胎细胞悬液，最终得到75% EtOH的固定溶液。加入一毫升细胞悬液后，轻轻摇动试管混匀，并将试管平放在零下20摄氏度环境中至少一小时，或在冷冻条件下保存两到三周。为对胚胎DNA进行染色，在从零下20摄氏度取出经乙醇固定的胚胎细胞后，以1500 × g离心力在4摄氏度下离心5分钟。将试管置于冰上，小心移除上清液。然后，使用 P1000 移液器将细胞轻轻重悬于 1 毫升新配制的预冷 PBS-BSA 中。在 4 摄氏度、1500 × g 条件下离心 5 分钟，随后将样品置于冰上。接着吸除上清液，每 1,000 个胚胎加入 200 微升碘化丙啶染色液，并将细胞重悬。将细胞置于冰上，在PI溶液中孵育30分钟，每5分钟轻轻混匀一次。在冰上将一个40微米的尼龙细胞筛网置于50毫升锥形管上。然后轻轻吹打细胞，混匀并使细胞溶液通过筛网过滤。使用注射器推杆平坦的内端，轻轻打散滤网上残留的任何细胞团块。每 1,000 个胚胎使用 500 µL 冷的 PBS-BSA 将细胞冲洗过筛。将一个 40 µm 滤网置于冰上盛装的 15 mL 离心管口，将来自 50 mL 离心管的细胞悬液再次过滤至该 15 mL 离心管中。最后，使用适当的细胞分选仪器，将激光激发波长设为 561 纳米，发射光检测设为 610 ± 20 以检测碘化丙啶。分选细胞后，按照文本方案进行进一步分析。为确定读段比对质量，必须首先使用 mapQ 值的统计信息将测序数据比对至基因组。此外，计算得到的读段长度统计结果以直方图形式展示，呈现所有测序读段的插入片段大小分布。本实验的中位插入片段长度为 170 bp。该柱状图展示了总比对读段、带有低质量标记的读段、成对读段比对到不同染色体的读段、成对读段间距超过距离阈值的读段以及 PCR 重复序列的读段统计信息。此处列出了斑马鱼样本典型测序运行中总比对读段数、未比对读段数和未配对读段数、覆盖度以及读段分辨率的代表性数值。经过滤后，在不同大小的窗口中确定读段数，并对数据进行平滑化和标准化处理。此处展示了生物学重复样本中代表性斑马鱼染色体典型的平滑化和标准化的复制时序谱图。生物学重复与实验重复的曲线图谱应高度相似，并在染色体全长范围内表现出高相关性。图谱还应在全基因组范围内表现出复制时间值的高相关性。颜色图谱表示皮尔逊相关系数。在进行该操作时，最重要的是确保收集到处于同步发育阶段的胚胎。完成该操作后，还可采用其他方法，如吗啉寡核苷酸注射或CRISPR-Cas9诱变技术，以回答更多科学问题，例如：DNA复制与其他发育过程之间协调作用的机制是什么？观看本视频后，您应能够充分掌握如何从同步发育的斑马鱼胚胎中收集细胞周期特定阶段的细胞。这些样本的收集对于生成全基因组DNA复制时间图谱至关重要。

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遗传学

使用斑马鱼作为体内模型系统分析 DNA 复制定时

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利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

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活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

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高通量DNA提取与基于鳍剪法的3日龄斑马鱼幼鱼基因分型

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完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

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一种通过活细胞FRET显微镜和免疫荧光高效评估斑马鱼努南综合征早期模型中ERK活性调控的实验方案

了解如何使用斑马鱼胚胎建立全基因组DNA复制定时图谱，以研究细胞周期与染色质生物学。该方法可揭示胚胎发育过程中染色质变化对DNA复制起始的影响机制。

使用斑马鱼进行DNA复制时间分析在体内模型系统

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