应用乳腺癌档案材料的多路 RNA 表达方法的优化
August 1st, 2018
核酸在档案组织中的降解, 肿瘤的异质性, 以及缺乏新鲜冰冻组织标本, 会对全球病理实验室的癌症诊断服务产生负面影响。这篇手稿描述了一组生物标志物的优化使用多重磁珠法分类乳腺癌。
该方法已成功优化，可将乳腺癌患者分为已知和未知的治疗组。该检测的高灵敏度可识别可以使用激光显微切割进一步研究的异质性样品。基于 RNA 的多重检测的主要优点是使用苏木精和伊红染色的福尔马林固定石蜡包埋的存档材料的结果的可重复性，可实现高分辨率输出和生物标志物验证。
按照文本协议中的说明准备组织。要开始解剖，请设置载玻片限位并校准显微镜的载物台移动。现在使用 4X 物镜扫描染色的膜载玻片。
在载玻片上选择并圈出用于显微切割的目标区域。跟踪总面积。至少需要 42 平方毫米才能进行充分的下游 RNA 分析。
然后以定义的参数开始激光切割。接下来，使用瓶盖提升机制检索解剖切片，并将切片放在连接到机械附件的标记管的扩散器帽上。如果解剖切片未恢复到盖子上，请重复对目标区域的解剖。
显微解剖的准确性是一个关键步骤，应始终确保菌盖上的显微解剖区域与标记的扫描图像一致。收集所需数量的组织切片，每个切片放在单独的试管中，然后继续裂解组织样品。裂解时，在每个样品中涂抹 2.4 μL 匀浆溶液，然后以最大速度涡旋样品 10 秒。
接下来，将样品以 2， 500 g 的浓度离心 5 秒钟。然后根据需要将样品转移到 1.5 毫升试管中，并置于 65 摄氏度的摇动加热块中。以 600 rpm 的速度摇晃它们 12 到 18 小时。
然后在室温下以 21， 000 g 离心裂解物 5 分钟。小心地将透明上清液收集到新标记的试管中。避免转移任何组织碎片。
上清液可在零下 80 摄氏度下储存。为基于杂交的测定准备所有试剂后，用 25 μL 组织匀浆加载多达 90 个磁分离 96 孔板。将 25 微升对照样品加载到三个指定孔中，并将 25 微升均质溶液作为空白加载到三个孔中。
然后使用透明塑料压力密封磁分离板，并将板放入 54 摄氏度的培养箱中摇动 18 至 22 小时。第二天，将磁珠安装并锁定在手持式磁性洗板机上，然后取下压力密封并等待 1 分钟，让磁珠沉淀。现在执行一次洗涤。
将板放在水槽上沥干，用纸巾轻轻吸干，然后用 100 μL 1X 洗涤缓冲液加载所有孔并等待 15 秒。重复此过程 3 次以完成洗涤步骤。去除最后一次洗涤液后，用 50 μL 前置放大器试剂重新装入孔中，然后用铝板密封剂密封板，并在室温下以 800 rpm 的速度摇动板 1 分钟。
然后继续在 50 摄氏度下摇动板子一小时。完成后，执行另一个洗涤步骤。接下来，用 50 μL 的扩增试剂重新装入孔中，用铝板密封板，并在室温下重复振荡孵育 1 分钟，然后在 50 摄氏度下孵育 1 小时，然后进行另一个洗涤步骤。
现在以最大速度涡旋标记探针 10 秒，然后向每个孔中加入 50 μL 标记探针。然后重新密封板并像以前一样重复振荡孵育，然后进行另一个洗涤步骤。接下来用 50 微升新鲜混合的链霉亲和素藻红蛋白加载孔，然后在室温下以 600 rpm 进行振荡孵育，然后使用链霉亲和素洗涤缓冲液进行洗涤步骤。
完成洗涤步骤后，向每个孔中加载 100 微升链霉亲和素洗涤缓冲液，并用铝板密封密封板，然后在室温下以 800 rpm 的速度摇动板 3 分钟。在最后的孵育步骤中，启动磁珠分析仪并确保仪器已校准并已执行验证方案。在软件中，通过从 Batches 选项卡中选择 Create Batch using an existing protocol（使用现有方案创建批次）来添加新的分析。
接下来，在板布局中，将孔指定为未知或空白，并在样品面板中为每个孔提供标签。现在从反应板上取下铝密封件，弹出板装载器托盘，然后将板加载到分析仪中。接下来，单击 Retract（撤回），然后单击 Run Batch （运行批处理） 以启动分析器。
读数后，弹出板并按照制造商的建议清洁磁珠分析仪。要进行分析，请转到 Batch Results （批处理结果） 选项卡。选择相应的分析文件，并使用选项将其导出为 csv 文件，然后使用电子表格软件创建平均值和原始分数。
确保控件显示预期的信号。使用数据科学平台或使用定义的算法来执行主成分分析，对样本原始数据进行归一化并分析数据分布。多重微珠检测仪和检测试剂盒的性能至关重要，在有价值的患者样品之前对注释良好的对照样品进行连续稀释可确保获得正确的结果。
对于属性，选择标准化基因数据的子集和名义型变量，例如乳腺癌亚型。应用经过训练和验证的分类算法来表征未知样本。所描述的方法已应用于同时测量 H&E 染色、显微解剖、高度降解的 FFPE 材料中的 40 个转录本。
使用这种方法，在比较各种受体阳性和阴性亚型中的肿瘤和匹配的对照组织时，可以显示受体状态和间充质标志物 FN1 差异表达的准确表征。可以使用这种方法来表征肿瘤内的异质性。ER 阳性肿瘤在显示不同肿瘤形态和有丝分裂活性的区域内表现出 FN1 的空间差异表达。
观看本视频后，您应该对如何在靶 RNA 与磁珠杂交、信号放大和定量后直接从组织裂解物中测量多个基因有很好的了解。检测灵敏度允许使用激光显微解剖材料。在尝试此程序时，请务必记住在每次检测前校准设备，并在运行珍贵的患者样本之前使用质量控制材料确定灵敏度范围。
检测工作流程很容易适应临床实验室。可在两天内在 12 小时内对多达 90 个样品进行 RNA 分析。在病理学实验室中测量乳腺癌受体状态非常耗时，并且需要经验丰富的病理学家。
使用这种基于多重微珠的数字化检测可准确定量 RNA 表达。在初步诊断中，活检中的分数生物标志物分析是肿瘤的表现。将这种方法与更广泛的生物标志物面板一起使用，并利用整个切片来识别异质性样本。
使用这种方法开发分析是通用的，并且需要的样品输入量低。样本包括对生物标志物验证很重要的临床注释样本，以及对患者监测和早期诊断很重要的液体活检。
概览
本研究解决了归档组织中核酸降解和肿瘤异质性对癌症诊断的挑战。作者优化了一种多重磁珠检测方法，以有效分类乳腺癌。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 病理学
- 生物标志物研究
背景
- 归档组织中的核酸降解影响诊断准确性。
- 肿瘤异质性使乳腺癌分类复杂化。
- 新鲜冷冻组织标本通常不可用。
- 多重检测可以改善分类和敏感性。
研究目的
- 优化乳腺癌分类的生物标志物组。
- 提高使用归档组织的检测的敏感性。
- 通过高分辨率输出验证结果。
使用的方法
- 使用激光微切割法准备组织样本。
- 多重磁珠检测法用于生物标志物分析。
- 从微切割样本中提取RNA。
- 基因表达数据的统计分析。
主要结果
- 该检测方法成功地将乳腺癌患者分类到治疗组中。
- 在异质性样本中实现了高敏感性。
- 展示了受体状态的准确表征。
- 结果在福尔马林固定石蜡包埋材料上是可重复的。
结论
- 优化的检测方法为乳腺癌分类提供了可靠的方法。
- 它允许分析高度降解的归档样本。
- 这种方法可以促进肿瘤生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This multiplex RNA-based expression assay addresses a critical bottleneck in oncology biomarker validation by enabling accurate molecular subtyping of breast cancer from degraded archival FFPE tissue. By overcoming limitations of nucleic acid degradation and tumor heterogeneity, the method provides a robust, quantitative platform for retrospective biomarker validation and liquid biopsy applications. Its compatibility with clinical workflows and low input requirements support scalable implementation in pathology laboratories for improved patient stratification and disease monitoring.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of 40 transcripts in microdissected FFPE material.
- Operational Value: Supports functional target validation by characterizing receptor status and mesenchymal marker FN1 expression across breast cancer subtypes.
- Predictive Value: Facilitates biomarker validation in clinically annotated archival libraries, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible quantitative outputs from laser microdissected H&E-stained FFPE sections.
- Scalability: Enables multiplexed analysis of up to 90 samples over two days, supporting high-throughput biomarker screening.
- Platform Reuse: Adaptable to liquid biopsy applications and wider biomarker panels for continuous monitoring applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling analysis of heterogeneous tumors via laser microdissection.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative biomarker measurements in archival material to support retrospective validation of clinical outcome correlations.
- Disease Relevance: Accurately classifies breast cancer into molecular subtypes, informing target selection and portfolio triage decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The assay integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical biomarker validation, enabling quantitative analysis of archival and liquid biopsy samples for oncology applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via multiplexed transcript measurement in microdissected tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible RNA quantification from degraded FFPE material.
- Analytics: Enables data normalization, distribution analysis, and principle component analysis for comparative condition assessment.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating biomarkers in clinically annotated archival libraries.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for biomarker validation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through accurate receptor status characterization and differential expression analysis in heterogeneous tumors.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility using H&E-stained FFPE material with low input requirements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling retrospective biomarker validation and reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker measurement in archival tissue for clinical outcome correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in laser microdissection and hybridization-based assay workflows.
- Dependent on magnetic bead analyzer instrumentation and calibrated validation protocols.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation, lysis, and hybridization steps.
- Requires adaptation considerations for varying degrees of tissue degradation and heterogeneity.
- Practical limitation: Sensitivity range must be determined using quality control material before running precious patient samples.
