Name: 早期雏鸡胚胎形态发生中物理力的作用探讨 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 探索早期雏鸡胚胎脑扭转形态发生中的物理力学机制，通过离卵培养实验结合OCT成像技术，研究机械力在神经管发育中的作用。该方法为发育生物学和生物力学研究提供了可靠的实验方案。

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Z.C. 感谢达特茅斯学院启动基金以及由苏黎世联邦理工学院管理的布兰科·魏斯科学学会奖学金的支持。作者感谢 Larry A. Taber 博士、Benjamen A. Filas 博士、Qiaohang Guo 博士和 Yunfei Shi 博士提供的有益讨论，同时也感谢匿名审稿人的意见。&#160;本研究工作得到美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：DGE-1313911）的支持。本文所表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。&#160;

1. 组织培养基的制备
<ol>
	<li>使用一瓶 0.5 L 的含 4.5 g/L 葡萄糖、碳酸氢钠和 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）作为培养基的基础。</li>
	<li>在无菌超净工作台中，向 0.5 L DMEM 中加入 10 mL 抗生素。</li>
	<li>使用无菌移液管，将 50 mL DMEM 抗生素溶液转移至一支无菌的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>在无菌超净工作台中，向 0.5 L 瓶内剩余的 DMEM 抗生素溶液中加入 50 mL 鸡血清。</li>
	<li>将最终溶液（以下简称鸡胚培养基 [CCM]）分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
2. 卵的孵化
<ol>
	<li>使用含70%乙醇的无尘擦拭布清洁已受精的无特定病原体白来航鸡卵，并将卵以纵向方向放置于卵架上。</li>
	<li>开启卵孵化箱，设定目标温度为37.5 °C，并将湿度维持在48 - 55%。&#160;通过向孵化箱内添加适量水来控制湿度。</li>
	<li>将卵孵化至Hamburger-Hamilton 11-13期，约需40 - 44小时。</li>
	<li>在用70%乙醇喷洒或清洁前，让卵在室温下冷却约15 - 30分钟。</li>
</ol>
3. 拉制玻璃毛细管
<ol>
	<li>将一根长度为 10 cm、外径为 1.0 mm、内径为 0.5 mm 的玻璃毛细管安装到微电极拉制仪上。</li>
	<li>将加热参数和拉制参数分别设置为 750 和 400，按下拉制按钮，将毛细管拉制成细针。</li>
</ol>
4. 滤纸载体法
<ol>
	<li>从滤纸上裁剪出直径约 3 cm 的圆形。</li>
	<li>使用打孔器从圆形滤纸上切下一枚大小约为 1 cm × 2 cm 的矩形。确保去除任何突出或尖锐的边角。</li>
</ol>
5. 胚胎采集与制备
<ol>
	<li>从底部敲裂鸡蛋，轻轻掰开蛋壳，小心地将内容物倒入 150 mm × 15 mm 培养皿中&#160;培养皿。为确保胚胎面朝上，在打蛋时应保持鸡蛋的摆放方向与孵化时一致。</li>
	<li>使用一次性巴斯德吸管去除薄层白蛋白。</li>
	<li>使用钝头镊子将浓稠的蛋清与蛋黄分离。&#160;用钝头镊子轻轻刮去蛋黄表面，以确保去除浓稠的白蛋白。</li>
	<li>使用尖头镊子将样品居中并&#160;将滤纸环置于胚胎上方，使滤纸环的长轴与胚胎的长轴对齐。</li>
	<li>用剪刀剪开滤纸环周围的蛋黄。</li>
	<li>以倾斜方向将环和胚胎从卵黄上拉起，朝向最初切割卵黄的位置。</li>
	<li>在两个连续的100毫米培养皿中，用室温的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗胚胎。</li>
	<li>先将一张滤纸环放入35 mm培养皿中，然后将胚胎背侧朝上置于已放置在35 mm培养皿中的滤纸环上。</li>
	<li>将一个不锈钢环置于滤纸夹层上方，注意不要损伤胚胎。</li>
	<li>加入3&#160;mL&#160;将先前配制的CCM分别加入每个培养皿中。</li>
	<li>用拉制的毛细玻璃针轻轻从胚胎顶部掠过，从胚胎前端（前脑正上方）开始，逐步剥离并移除每个胚胎的卵膜（VM），直至完成&#160;脊索（图1A).</li>
	<li>将八个35毫米的培养皿放入一个已铺有经水饱和的柔软擦拭纸（以维持湿度）的150毫米培养皿中。</li>
	<li>将150毫米培养皿放入可密封的塑料袋中，然后向袋内充入由95% O₂和5% CO₂组成的混合气体2 和5% CO₂2.</li>
	<li>密封袋子并将其放入37.5 °C培养箱中。</li>
	<li>将胚胎继续孵育27小时，直至HH15-HH16阶段（图1B).</li>
</ol>
6. 诱导表面张力
<ol>
	<li>从培养箱中取出胚胎，使用光学相干断层扫描（OCT）系统对胚胎进行成像。利用OCT确定神经管（NT）的扭转角度（图2）。</li>
	<li>将胚胎转移至光学显微镜下，在10倍放大倍数下进行观察。使用200微升移液器逐步从培养皿中移除0.2 mL培养基。</li>
	<li>在每个时间点拍摄明场图像，以观察培养基-空气界面对于胚胎的影响。</li>
	<li>持续移除培养基，直至胚胎表面张力引发扭转（图1C）。</li>
	<li>再次使用OCT系统对胚胎成像，以确定最终的扭转角度，并与对照组胚胎进行比较。&#160; 注意：明场图像通过体视显微镜获取。采用配备显微镜的光学相干断层扫描系统获取活体胚胎的横截面图像序列。图像在3 × 10 mm × 3 mm3的扫描范围内采集，随后在图像处理软件中进行处理。最后，物理模型图像使用数码单反相机拍摄。</li>
</ol>
7. 表面张力/体积力的物理建模
<ol>
	<li>在商业建模软件中构建一个简化的三维几何模型，以模拟HH14-17时期的胚胎形态图3A).</li>
	<li>在商业3D计算机图形软件中设计三维几何结构的负模。</li>
	<li>使用装有1.75 mm丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（acrylonitrile butadiene styrene）线材的3D打印机，以立体光刻（.stl）格式打印设计好的模具。</li>
	<li>为了制备模具，将硅橡胶弹性体组分A和B等比例混合，并立即将混合物倒入模具中；将浇铸模具在室温下固化12 h图3B).</li>
	<li>沿胚胎背侧的神经管标记物理模型，以观察扭转。</li>
	<li>使用盖玻片以复制施加于模拟的三维物理模型上的力&#160;VM 的或表面张力的图3D).</li>
	<li>在物理模型的一侧插入一系列等长的刚性金属丝。当盖玻片对脑模型施加外力后，金属丝会因位置不同而倾斜一定角度。通过计算每根金属丝投影长度与其原始长度比值的反正切（arctan）来确定其旋转角度。图3E).</li>
</ol>
8. 改变心脏环化的方向
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 和 3.2 操作，制备拉制好的毛细管。</li>
	<li>按照5.1至5.10步骤准备胚胎。</li>
	<li>使用一对镊子翻转滤纸，使胚胎腹面朝上。</li>
	<li>使用拉制的毛细管进行切割&#160;在脏壁层（SPL）膜上切开一个裂口。</li>
	<li>使用毛细管施加机械力，将心脏从右侧推向左侧。</li>
	<li>按照5.12至5.15步骤操作，观察扭转的变化。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管物理现象在形态发生过程中起着关键作用26,27,28,29,30，但具体的力学机制以及力学与分子机制之间的协调作用在很大程度上仍未被探索。已知原始脑的腹侧弯曲和向右扭转是早期胚胎形态发生的两个核心过程18,31,32,33,34，但此前尚无研究探讨脑扭转的力学起源，而脑扭转是最早发生的器官水平左右不对称事件之一。
该方案的关键步骤包括...

现代发育生物学研究主要集中在从分子遗传学的角度理解发育过程1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。已知物理现象在形态发生（即生物形态的形成）中起着核心作用14,15,16,17；然而，发育的具体力学机制在很大程度上仍未得到充分研究。在Hamburger-Hamilton 11期（HH 11）之后，原始脑管的腹侧弯曲和向右扭转是导致胚胎形态变化的两个主要过程18。特别是，胚胎脑部扭转发育背后的物理机制仍尚未完全阐明19,20。
鸡胚的胚胎扭转是发育过程中左右（L-R）不对称性最早的形态发生事件之一。当L-R不对称性过程受到干扰时，将导致诸如situs inversus、isomerism或heterotaxia等出生缺陷21。 
本文介绍了一种结合ex-ovo实验22,23与物理建模的方法，用于表征早期胚胎脑发育过程中的机械力。本方法的目标是识别导致脑部扭转的机械力以及影响早期发育过程中扭转程度的因素12。基于实验观察发现卵黄膜（VM）限制了胚胎背侧，我们提出假设：VM提供了诱导发育中脑部发生扭转所需的力。因此，在本方法中，我们移除了覆盖脑区部分的卵黄膜，以探究其对脑扭转的影响。此外，采用施加液体表面张力的方法，进一步验证VM的力学作用，并估算脑扭转所需的作用力，此前尚未有研究实现这一点。在胚胎形态发生过程中测量这些力是一项具有挑战性的任务。值得注意的是，在一项开创性研究中，Campàs及其同事24开发了一种利用注入微滴来量化细胞应力的新方法。然而，该方法仅限于测量细胞水平的力，因而不适用于组织或个体水平上的力探测。本文所提出的方案正是为了部分填补这一空白而开发的。

<table><tbody><tr><td>无特定病原体受精白来航鸡卵</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光学相干断层扫描显微镜</td><td>Thorlabs</td><td>GAN220C1</td><td></td></tr><tr><td>硅胶弹性体</td><td>Smooth-On, Inc.</td><td>EcoFlex 00-50</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>MZ8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Sigma</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>Sigma</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-30</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>5202-110</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Comsol 多物理场仿真软件</td><td>Comsol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>三维计算机图形软件</td><td>Rhino 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备光学相干断层扫描的显微镜</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>数码单反相机</td><td>EOS&amp;nbsp;</td><td>Rebel T3i</td><td></td></tr></tbody></table>

探究物理力在早期鸡胚形态发生中的作用

Probing the Roles of Physical Forces in Early Chick Embryonic Morphogenesis

胚胎发育的传统研究主要基于生物分子遗传学视角，但力学因素在形态发生中的根本重要性正日益受到重视。特别是鸡胚心脏和脑管在发育过程中会经历显著的形态变化，因此成为研究物理力在形态发生中作用的理想模型之一。在鸡胚发育过程中，管状鸡胚脑在器官水平左右不对称形成的最早阶段即发生持续的腹侧弯曲&#160;和向右扭转。卵黄膜（VM）限制了胚胎的背侧，并被认为提供了诱导脑部扭转所必需的力学作用。本文介绍了一种结合新型离体（ex-ovo）实验与物理建模的方法，用以揭示脑扭转的力学机制。在Hamburger-Hamilton 11期，将胚胎取出并在培养基中进行离体培养（ex ovo）。随后使用拉制毛细管移除卵黄膜。通过调节液体水平并使胚胎暴露于液-气界面，可利用培养基的液体表面张力来替代卵黄膜的机械作用。此外，还进行了显微外科手术以改变心脏的位置，从而观察脑扭转手性随之发生的变化。本实验方案的结果阐明了力学因素在驱动形态发生过程中的基础性作用。

本研究中，将HH11期胚胎从头端至胸段弯曲处的卵黄囊膜（VM）去除，并利用OCT系统对胚胎进行成像。在此阶段，神经管的扭转尚未开始（图1A）。当胚胎继续孵育至HH15-16期时，去除VM的胚胎表现出明显的脑神经管扭转减少，扭转角度约为35度（图1B），而对照组胚胎的扭转角度约为90度。当降低培养基液面以在去除VM的胚胎背侧诱导表面张力时，其脑部扭转程度恢复至与对照组胚胎相当的水平（图1C）。图2展示了HH13期胚胎的代表性OCT图像，其中标注了胸段方位角和头段方位角（图2A）。这些角度是相对于神经管横截面的垂直位置进行测量的（图2B、C）。实验结果表明，正常的脑神经管扭转是由胚胎背侧所...

在此，我们介绍一种引入新方法集的实验方案 体外培养 研究早期鸡胚脑扭转过程中形态发生力学的实验与物理建模方法。

胚胎发育的传统研究视角是生物分子遗传学，但力学在形态发生中的根本重要性……

本实验方案的总体目标是通过体外（ex ovo）实验研究机械力在胚胎早期脑发育中的作用。该方法有助于回答发育生物学和生物力学领域的一些关键问题，例如机械信号在形态发生（即生物形态的形成）过程中的作用。该技术的主要优势在于能够表征机械力在组织和个体水平上对形态发生的影响。开始此操作时，使用含70%乙醇的无菌擦拭巾清洁已受精的无特定病原体的白来航鸡鸡蛋。然后将鸡蛋纵向排列在蛋架上。接着，将孵卵器的温度设定为目标温度37.5摄氏度，并将湿度维持在48%至55%之间。通过向孵卵器中加入适量的水来控制湿度。将鸡蛋孵育约40至44小时，至Hamburger-Hamilton（HH）11至13期。随后，在使用70%乙醇清洁前，于室温下冷却鸡蛋约15至30分钟。在此步骤中，从蛋的底部敲裂蛋壳，轻轻掰开蛋壳，并小心将内容物倒入一个150 × 15毫米的培养皿中。为确保胚胎朝上，打蛋时应保持鸡蛋的朝向与孵化时一致。使用一次性巴斯德吸管去除稀薄的蛋清。用钝头镊子将浓稠的蛋清与蛋黄分离。轻轻刮除卵黄表面，确保已去除较厚的白蛋白。然后用尖头镊子将滤纸环置于胚胎上方并居中，使滤纸环的长轴与胚胎的长轴对齐。随后用剪刀剪开滤纸环周围的部分卵黄。随后，将环和胚胎从卵黄上沿斜向方向拉起，朝向最初切割卵黄的位置。然后，用室温的PBS在两个连续的100毫米培养皿中冲洗胚胎。接下来，将一张滤纸环放入一个35毫米的培养皿中。将胚胎背侧朝上放置于35毫米培养皿中另一张滤纸上。随后，将不锈钢环置于滤纸夹层上方。注意不要损伤胚胎。现在，向每个培养皿中加入三毫升先前配制好的CCM。用拉制的毛细玻璃针轻轻掠过胚胎表面，以去除每个胚胎的卵黄膜。然后从胚胎前端开始，向脊索方向剥离并移除卵黄膜。随后，将八个 35 毫米的培养皿放入一个内衬有饱和水湿巾的 150 毫米培养皿中，以维持湿度。然后，将该 150 毫米培养皿放入可密封的塑料袋中，并向袋内充入由 95% 氧气和 5% CO₂ 组成的混合气体。密封袋子后，置于 37.5 °C 的培养箱中。现在，将胚胎从培养箱中取出，使用OCT系统对其进行成像，以确定神经管的扭转角度。将胚胎转移至光学显微镜下，在10倍放大倍数下进行观察。使用200微升移液器，逐步从培养皿中移除0.2毫升培养基。每次移除培养基后均采集明场图像，以观察培养基-空气界面对于胚胎的影响。持续移除培养基，直至胚胎表面张力诱导产生扭转。再次使用OCT系统对胚胎成像，以确定最终的扭转角度，并与对照组胚胎进行比较。为了改变心脏环转的方向，使用一对镊子将滤纸翻转，使胚胎腹侧朝上。然后，用拉制的毛细管切开脏壁层膜，形成一条切口，并施加机械力将心脏从右侧推至左侧。利用液体表面张力使心脏保持在左侧位置。然后，将胚胎继续孵育20小时，以观察扭转手性的变化。图中显示的是在HH11期去除前庭膜（VM）后收获的胚胎。同一胚胎在去

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科研

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Bioengineering

生物工程

早期雏鸡胚胎形态发生中物理力的作用探讨

本视频展示了双色整体原位杂交技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化两种不同基因的空间和时间表达模式。该方法最初由 David Wilkinson、Domingos Henrique、Phil Ingham 和 David Ish-Horowicz...

早期鸡胚双重整体原位杂交

本文介绍了早期鸡胚的表面标记及ex...

追踪早期鸡胚中的形态发生组织形变

通过将浸泡过生长因子或特定信号通路抑制剂的微珠移植到发育中的胚胎中，可直接检测这些因子的作用效果...

将微珠移植至鸡胚肢体发育区域以鉴定影响基因表达的信号转导通路

本文描述了在鸡胚中利用不可渗透屏障阻断主轴体与 flank...

应用不可渗透屏障结合候选因子浸泡微珠研究鸡胚中的诱导信号

斑马鱼胚胎卵黄细胞中的原子力显微镜与微流变学研究

我们介绍了一种将光镊与光片显微镜耦合的装置，及其在无微珠条件下用于探测细胞力学特性的应用 果蝇...

利用无微珠光镊技术探测细胞力学特性 果蝇 胚胎

重组肢体是一种强大的实验模型，可用于研究在胚胎信号影响下细胞分化及模式形成的过程。本方案介绍了一种利用鸡肢芽中胚层细胞生成重组肢体的详细方法，该方法可适用于从不同生物体获得的其他细胞类型。...

鸡胚胎重组肢体实验：解析形态发生、模式形成及细胞分化早期过程

浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。...

利用浸润珠实验分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化、形态发生与图式形成

本文介绍了三种禽类胚胎皮肤外植体培养的实验方案，可用于研究组织间的相互作用、4D成像延时电影（三维加时间）、分子功能的全局或局部干扰，以及系统生物学表征。...

利用禽类皮肤外植体研究组织模式形成与器官发生

本方案旨在对鸡胚神经管形成过程中神经板组织的力学特性进行纵向监测。该方法结合了布里渊显微镜与载物台式培养系统，可实现神经板组织在活体状态下的力学成像 体外孵化...

监测鸡胚神经管闭合过程中组织的力学演变

探索早期雏鸡胚胎脑扭转形态发生中的物理力学机制，通过离卵培养实验结合OCT成像技术，研究机械力在神经管发育中的作用。该方法为发育生物学和生物力学研究提供了可靠的实验方案。

探究物理力在早期鸡胚形态发生中的作用

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