探究物理力在早期鸡胚形态发生中的作用

本实验方案的总体目标是通过体外（ex ovo）实验研究机械力在胚胎早期脑发育中的作用。该方法有助于回答发育生物学和生物力学领域的一些关键问题，例如机械信号在形态发生（即生物形态的形成）过程中的作用。该技术的主要优势在于能够表征机械力在组织和个体水平上对形态发生的影响。

开始此操作时，使用含70%乙醇的无菌擦拭巾清洁已受精的无特定病原体的白来航鸡鸡蛋。然后将鸡蛋纵向排列在蛋架上。接着，将孵卵器的温度设定为目标温度37.5摄氏度，并将湿度维持在48%至55%之间。通过向孵卵器中加入适量的水来控制湿度。

将鸡蛋孵育约40至44小时，至Hamburger-Hamilton（HH）11至13期。随后，在使用70%乙醇清洁前，于室温下冷却鸡蛋约15至30分钟。在此步骤中，从蛋的底部敲裂蛋壳，轻轻掰开蛋壳，并小心将内容物倒入一个150 × 15毫米的培养皿中。

为确保胚胎朝上，打蛋时应保持鸡蛋的朝向与孵化时一致。使用一次性巴斯德吸管去除稀薄的蛋清。用钝头镊子将浓稠的蛋清与蛋黄分离。

轻轻刮除卵黄表面，确保已去除较厚的白蛋白。然后用尖头镊子将滤纸环置于胚胎上方并居中，使滤纸环的长轴与胚胎的长轴对齐。随后用剪刀剪开滤纸环周围的部分卵黄。

随后，将环和胚胎从卵黄上沿斜向方向拉起，朝向最初切割卵黄的位置。然后，用室温的PBS在两个连续的100毫米培养皿中冲洗胚胎。接下来，将一张滤纸环放入一个35毫米的培养皿中。

将胚胎背侧朝上放置于35毫米培养皿中另一张滤纸上。随后，将不锈钢环置于滤纸夹层上方。注意不要损伤胚胎。

现在，向每个培养皿中加入三毫升先前配制好的CCM。用拉制的毛细玻璃针轻轻掠过胚胎表面，以去除每个胚胎的卵黄膜。然后从胚胎前端开始，向脊索方向剥离并移除卵黄膜。

随后，将八个 35 毫米的培养皿放入一个内衬有饱和水湿巾的 150 毫米培养皿中，以维持湿度。然后，将该 150 毫米培养皿放入可密封的塑料袋中，并向袋内充入由 95% 氧气和 5% CO₂ 组成的混合气体。密封袋子后，置于 37.5 °C 的培养箱中。

现在，将胚胎从培养箱中取出，使用OCT系统对其进行成像，以确定神经管的扭转角度。将胚胎转移至光学显微镜下，在10倍放大倍数下进行观察。使用200微升移液器，逐步从培养皿中移除0.2毫升培养基。

每次移除培养基后均采集明场图像，以观察培养基-空气界面对于胚胎的影响。持续移除培养基，直至胚胎表面张力诱导产生扭转。再次使用OCT系统对胚胎成像，以确定最终的扭转角度，并与对照组胚胎进行比较。

为了改变心脏环转的方向，使用一对镊子将滤纸翻转，使胚胎腹侧朝上。然后，用拉制的毛细管切开脏壁层膜，形成一条切口，并施加机械力将心脏从右侧推至左侧。利用液体表面张力使心脏保持在左侧位置。

然后，将胚胎继续孵育20小时，以观察扭转手性的变化。图中显示的是在HH11期去除前庭膜（VM）后收获的胚胎。同一胚胎在去除前庭膜后继续孵育27小时，显示扭转程度减小。

这是施加流体表面张力后发生脑扭转的同一胚胎，而这是处于相似发育阶段、具有正常脑扭转的对照组胚胎。在进行该操作时，需注意避免损伤胚胎。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如有限元分析），以计算模拟物理力如何影响形态发生。

因此，本研究中开发的技术为未来研究鸡胚形态发生过程中的力学机制铺平了道路。观看本视频后，您应掌握如何获取用于体外培养的鸡胚、显微手术去除卵黄膜、重现卵黄膜所提供的力学作用，以及通过光学相干断层扫描（OCT）和明场成像监测胚胎形态变化。