Name: 实验性曲霉病肺真菌负担的组织学定量测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 了解如何使用Gomori改良六胺银染色法对小鼠侵袭性曲霉病肺部真菌负荷进行组织学定量测定。该方法可利用现有组织样本，减少动物使用数量，结果与定量PCR相当，有助于研究真菌致病机制和宿主免疫反应。

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本研究部分得到了印第安纳大学医学院研究增强基金以及美国国立卫生研究院下属国家过敏与传染病研究所（NIH-NIAID 1R03AI122127-01）的资助。N.A. 在此期间部分获得了美国免疫学家协会免疫学职业奖学金的支持。

所有动物实验程序均经印第安纳州立大学动物护理与使用委员会批准，该大学为印第安纳大学医学院—特雷霍特校区的主办校园。
1. 准备 A. fumigatus 用于感染的分生孢子
<ol>
	<li>在通风良好的通风橱中操作，将 125 µL 的 A. fumigatus 293 储存液加入 900 µL 细胞培养级水（CCGW）中。然后用移液器将溶液转移至麦芽提取物琼脂（MEA）平板，并用接种环均匀涂布。</li>
	<li>将真菌平板置于 24 °C 黑暗环境中培养，时间不少于 14 天，且不超过 28 天。</li>
	<li>使用玻璃珠收集分生孢子，方法如前所述9。</li>
	<li>将 1.5 g 的 0.5 mm 玻璃珠倒入平板上，轻轻前后倾斜平板，直至玻璃珠表面均匀附着分生孢子，以完成分生孢子的提取。将玻璃珠与分生孢子的混合物收集至 15 mL 圆锥形离心管中。加入 5 mL 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），涡旋混匀。</li>
	<li>使用血细胞计数板对 DPBS 中 50 倍稀释的上清液进行分生孢子计数。计数 图 1 所示区域内的分生孢子数量，并使用 公式 1 计算浓度。 
	分生孢子数 × 稀释倍数 × 104 = 分生孢子/mL（公式 1） 
	注意：可额外计数四个 4×4 方格的角落区域，并以这些区域的平均值作为 公式 1 中的分生孢子数。</li>
</ol>
<img alt="静力平衡示意图；ΣFx=0，ΣFy=0；网格分析，矢量力，精度研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：血细胞计数板中用于分生孢子计数的代表性区域（方框，箭头）。
<ol start="6">
	<li>用无菌生理盐水（DPBS）稀释分生孢子悬液，以获得所需浓度，即每50 µL含5 × 106个分生孢子，对应浓度为1.0 × 108 个分生孢子/mL。为每只待感染小鼠准备50 µL分生孢子溶液，并额外多准备两份（'n + 2'）以补偿移液误差。 
	注意：也可采用标准的真菌收获与制备/过滤方法10。玻璃珠法最适合用于获取含有极少微小/可溶性菌丝抗原的分生孢子样本，以便进行吸入感染。</li>
</ol>
2. 小鼠模型的免疫抑制与感染
<ol>
	<li>使用7至10周龄的小鼠。 
	注意：本研究使用了 BALB/c、C57BL/6（B6）、嗜酸性粒细胞缺乏型（ΔdblGATA，BALB/c 背景）和 γδ T 细胞缺乏型（TCRδ-/-，B6 背景）小鼠。每次实验均采用年龄和性别匹配（包括雄性和雌性）的小鼠分组。</li>
	<li>耗竭中性粒细胞 通过 腹腔注射 0.1 mL（0.5 mg）抗小鼠 Ly-6G 抗体，溶于无菌生理盐水中，于 45° 右下外侧象限（实验时间安排见 图2).</li>
	<li>24 h后，通过吸气感染法用5.0 x 106A. fumigatus 分生孢子悬浮于 50 µL 无菌生理盐水（见步骤 2.4–2.10），如前所述11感染后，对部分动物注射抗真菌剂，例如本研究中使用的5 mg/kg卡泊芬净二乙酸盐溶于DPBS中（每日一次，参见 图2).</li>
	<li>使用兽用麻醉机以99.9%异氟烷麻醉小鼠。
	<ol>
		<li>在诱导室底部放置一张纸巾，用于接取粪便和尿液。</li>
		<li>将小鼠放入诱导室，盖紧盖子，设置蒸发器为5%异氟烷，持续2分30秒。 
		注意：由于麻醉总时间少于5分钟，因此不使用兽用软膏。</li>
		<li>将蒸发器调至最大设置的一半，持续 30 秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过观察小鼠呼吸减缓、无自主运动以及对脚趾夹捏刺激无反应，确认小鼠已充分麻醉。</li>
	<li>将小鼠从麻醉室中取出，置于倾斜板上，使其背部紧贴板面。用橡皮筋轻轻固定上切牙，用金属丝轻轻固定下切牙。</li>
	<li>用小镊子小心夹住完全伸出的舌头，并用移液器操作 50 µL 在舌根部接种分生孢子/PBS悬浮液。</li>
	<li>将舌头保持在完全伸展的位置；听是否有快速呼吸以及明显的吸气时发出的咔哒声。保持20秒，或直至悬浮液完全吸入。</li>
	<li>将小鼠从斜板上取下，轻柔地放入笼中进行观察。</li>
	<li>吸气后，小鼠应在1分钟内恢复意识。持续监测小鼠，直至其完全清醒并能够在笼内行走。动物应饲养在 21 °C 每天监测两次，直至收获肺组织。</li>
	<li>感染后24小时重复中性粒细胞耗竭操作（步骤2.2）图2).</li>
</ol>
<img alt="感染后第3天处死，中性粒细胞耗竭时间线，Af分生孢子，卡泊芬净处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：实验时间安排。 本图改编自先前发表的研究8。
3. 小鼠肺组织的收获与保存用于组织学分析
<ol>
	<li>通过腹腔注射0.1 ml浓度为390 mg/ml的戊巴比妥钠溶液，使动物深度麻醉至致死剂量。</li>
	<li>通过观察动物是否无自主呼吸以及用镊子刺激四肢无反应来确认安乐死。确认死亡后，用70%乙醇喷洒尸体以进行消毒。</li>
	<li>将尸体置于覆盖有吸水垫的泡沫板上。 
	注意：应将尸体仰卧放置，并用大头针固定四肢于泡沫板上。</li>
	<li>使用剪刀小心打开胸腔上部。剪除肋骨以暴露肺和心脏。剪断下腔静脉以便灌注。操作时应避免损伤血管和刺破器官。</li>
	<li>用25号针头以45°角向右心室缓慢灌注5 mL冷DPBS。随后用5 mL 10%福尔马林重复灌注一次。</li>
	<li>小心暴露气管并剥离周围脂肪组织。操作时需谨慎，避免刺破气管。确保彻底清除多余结缔组织，以便完全暴露气管后再进行下一步操作。暴露气管后，将镊子置于气管下方以抬高气管。</li>
	<li>使用25号针头在气管上端刺一个小孔。 
	注意：打孔位置应确保整个套管可插入气管内。操作时需小心，避免气管破裂。</li>
	<li>将套管经小孔插入并朝向肺部推进。用外科缝线在气管周围松松结扎以固定套管。 
	注意：若气管破裂，可尽可能将套管插入气管远端的气道中。</li>
	<li>使用注射器经套管向肺部注入1 mL 10%福尔马林缓冲液以充气膨胀肺组织。应观察到肺膨胀现象；若未见膨胀，需调整导管位置并重复操作。肺充分膨胀后，小心迅速拔出套管，并将缝线扎紧以封闭气管。 
	注意：若气管破裂导致无法充气膨胀肺部，仍可采集肺组织，但可能影响固定效果。</li>
	<li>用镊子小心分离气管周围的结缔组织，同时轻轻提起缝线，将气管和肺组织轻柔地从胸腔取出。将肺和气管放入含有15 mL 10%福尔马林缓冲液的50 mL锥形管中。将缝线一端留在管外，拧紧管盖。倒置试管，使样本完全浸没于固定液中。</li>
	<li>将样本在室温下保存至少24小时，或直至后续处理。 
	注意：福尔马林具有危害性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，包括护目镜和面罩。处理样本时应在化学通风橱内进行。</li>
</ol>
4. 小鼠肺组织的采集与保存以检测真菌DNA载量
<ol>
	<li>在另一只小鼠上按照上述步骤 3.1–3.5 进行操作。</li>
	<li>用 25 号针头以 45° 角从右心室缓慢灌注 10 mL 冷 DPBS。</li>
	<li>用剪刀切除肺组织，并置于已标记的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>将肺组织保存在 -80 °C，直至进一步处理。</li>
	<li>采用标准技术进行包埋和切片操作，具体步骤参见制造商说明书（见材料表）。</li>
</ol>
5. 显微镜与成像
<ol>
	<li>打开成像定量程序（参见 材料表）。</li>
	<li>使用光学显微镜获取至少4个不同视野的GMS染色切片图像（10倍物镜）。确保所选图像能够代表肺内感染气道区域，且组织密度相似。 
	注意：如果对照组与实验组之间菌丝灶的密度和分布存在明显差异，可增加拍摄视野数量，或对整个肺组织切片的GMS染色区域进行成像（4倍物镜）。如需，可在连续切片的苏木精-伊红（H&E）染色切片上，对相同肺区（通过相似组织形态学特征确定）获取对应图像。</li>
	<li>在必要时为图像添加比例尺，并保存待定量分析的图像。选择“编辑”&gt;“添加/编辑标定标记”&gt;菜单：设置线条粗细、颜色及比例尺大小 &gt; 在图像上点击以确定比例尺位置。关闭菜单后，选择“编辑”&gt;“合并”&gt;“合并标定标记”&gt; 选择“文件另存为”&gt; 命名文件并点击“保存”。</li>
</ol>
6. 使用图像处理程序计算真菌负荷（图3）
<ol>
	<li>打开图像处理程序。选择 文件 &gt; 包含待定量样本的文件夹 &gt; 图像（图3A）。选择 图像 &gt; 类型 &gt; 转换为“RGB堆栈”（图3B）。</li>
	<li>使用右箭头键选择三个图像中的第二个图像（图3B）。按下“control + shift + T”调出“阈值”菜单设置调节器（图3C）。找到原始的.tiff或.jpg图像作为参考，并使用图像查看程序打开（图3C）。</li>
	<li>将上方滑块完全向左移动，然后调节下方滑块，直到被选中的区域（红色显示）能够代表显微镜图像中的实际区域（通常范围在130–160之间，具体数值显示在滑块右侧）（图3C）。</li>
	<li>选定后，点击“设定” &gt; “确定”（图3D）。选择“分析” &gt; “设置测量项” &gt; 勾选“面积、面积百分比、限制于阈值范围、显示标签”，底部设置（下拉菜单和小数位数）保持默认 &gt; “确定”（图3D）。</li>
	<li>可通过使用区域或不规则多边形工具选择相应组织区域，排除大面积的空白区域或背景染色区域。</li>
	<li>最后选择“分析” &gt; “测量”（将弹出一个数据窗口，或在Windows任务栏上出现标签为“Results”的窗口）（图3E）。将数据导出至数据分析程序，用于作图和统计分析。</li>
	<li>输入每只肺样本四个面积百分比的平均值。通常每组5–8个样本足以检测组间显著差异。若比较两个实验组，可采用非配对student's t-检验来判断显著性。</li>
</ol>
<img alt="图像分割过程；A-E 阶段；示意图；视觉数据分析；聚类检测" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：GMS 组织学视野定量分析各步骤的代表性截图。（A）选择“文件”&gt; 包含待定量样本的文件夹 &gt; 选择图像。（B）选择“图像”&gt;“类型”&gt; 转换为“RGB 堆栈”。使用右箭头键选择三个图像中的第二个。（C）按下“Ctrl + Shift + T”调出“阈值”菜单设置调节器。找到原始的 .tiff 或 .jpg 图像作为参考，并使用图像查看程序打开。将顶部滑块完全向左移动，然后调节底部滑块，直到选中区域（红色显示）能够代表显微镜图像（通常范围为 130–160，具体数值显示在滑块右侧）。（D）选定后，点击“设定”&gt;“确定”。选择“分析”&gt;“设置测量项”&gt; 勾选“面积、面积分数、限制于阈值、显示标签”，底部设置（下拉菜单和小数位数）保持默认 &gt;“确定”。（E）最后选择“分析”&gt;“测量”（将弹出一个数据窗口，或在 Windows 任务栏上出现标签为“Results”的窗口）。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
7. DNA 真菌载量
<ol>
	<li>将肺组织从 -80 °C 取出，使用冷冻干燥系统冻干至少 4 小时（过夜最佳），直至完全干燥。</li>
	<li>在肺组织干燥过程中，配制 DNA 提取缓冲液（0.1 M NaCl、10 mM EDTA pH 8.0、10 mM Tris HCl pH 8.0 和 0.5% SDS）。</li>
	<li>将配制好的 DNA 提取缓冲液置于 60 °C 水浴中预热。同时，将苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）加入 50 mL 锥形管中，静置分层。</li>
	<li>将冻干后的肺组织放入 2 mL 螺口管中，加入 0.2 mL 玻璃珠。使用珠磨机干磨肺组织 15–30 秒，直至形成细粉。</li>
	<li>向每管中加入 0.8 mL 预热的 DNA 提取缓冲液，充分涡旋混匀。将各管在 65 °C 恒温振荡金属浴中孵育 15 分钟，涡旋混匀后继续孵育 15 分钟。孵育结束后再次涡旋，然后在 25,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>为每个样品标记三组 1.5 mL 离心管，将上清液的上层转移至第一组管中。用移液器吸取上层水相时需小心，避免扰动中间层。</li>
	<li>加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇，充分混匀，然后在 25,000 × g 离心 15 分钟，再将上层液体移入第二组管中。</li>
	<li>加入等体积的氯仿:异戊醇，充分混匀后在 25,000 × g 离心 10 分钟。小心将上层液体移入第三组管中。</li>
	<li>加入 500 µL 异丙醇和 50 µL 醋酸钠（NaOAc，pH 5.2），充分混匀，室温孵育 10 分钟。然后在 25,000 × g 离心 30 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用 750 µL 冰冷的 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，在 25,000 × g 离心 5 分钟。弃去乙醇，将沉淀在通风橱中室温晾干 40 分钟。</li>
	<li>将干燥的沉淀重悬于 300 µL TE 缓冲液中。 
	注：DNA 可在 -20 °C 保存，直至定量。</li>
	<li>使用分光光度计对 DNA 进行定量，并为每个 DNA 样品准备 100 µL 浓度为 0.2 µg/µL 的溶液用于 qPCR 分析。</li>
	<li>按照先前描述的方法，使用 1 µg DNA 样品、真菌 18S rDNA 引物及探针组合（探针淬灭基团修饰为 5'-/56-FAM/AGC CAG CGG/ZEN/CCC GCA AAT G/3IABkFQ/-3'），进行三复孔标准 qPCR 实验12,13。</li>
	<li>利用 A. fumigatus 基因组 DNA 制备标准曲线，根据平均报告荧光染料 Ct 值计算每个样品中真菌 DNA 的浓度（以 pg 为单位）。</li>
	<li>绘制每 µg 样品中真菌 DNA 含量（pg/µg）及其均值标准误的图表。采用学生 t 检验（student's t-test）分析显著性差异。 
	注：作为本实验所用苯酚-氯仿法 DNA 提取的低毒性替代方案，可使用基于离心柱的 DNA 提取试剂盒。</li>
</ol>

<ol><li>Hohl, T. M., Feldmesser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus%3A+principles+of+pathogenesis+and+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus: principles of pathogenesis and host defense.</a> Eukaryot Cell. 6 (11), 1953-1963 (2007).</li>
<li>Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillus+fumigatus--what+makes+the+species+a+ubiquitous+human+fungal+pathogen%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Aspergillus fumigatus--what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen?</a> PLoS Pathog. 9 (12), e1003743(2013).</li>
<li>Ostrosky-Zeichner, L., Casadevall, A., Galgiani, J. N., Odds, F. C., Rex, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+antifungal+pipeline%3A+selected+new+molecules+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">An insight into the antifungal pipeline: selected new molecules and beyond.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (9), 719-727 (2010).</li>
<li>Desoubeaux, G., Cray, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Models+of+Invasive+Aspergillosis+due+to+Aspergillus+fumigatus%3A+Still+a+Long+Path+toward+Standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rodent Models of Invasive Aspergillosis due to Aspergillus fumigatus: Still a Long Path toward Standardization.</a> Front Microbiol. 8, 841(2017).</li>
<li>Hohl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+vertebrate+animal+models+of+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Overview of vertebrate animal models of fungal infection.</a> J Immunol Methods. 410, 100-112 (2014).</li>
<li>Sheppard, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+methodologies+for+the+determination+of+pulmonary+fungal+burden+in+experimental+murine+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis.</a> Clin Microbiol Infect. 12 (4), 376-380 (2006).</li>
<li>Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+animal+models+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Mycol%22%5BJournal%5D)">The future of animal models of invasive aspergillosis.</a> Med Mycol. 43 Suppl 1, S115-S119 (2005).</li>
<li>Amarsaikhan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspofungin+Increases+Fungal+Chitin+and+Eosinophil+and+gammadelta+T+Cell-Dependent+Pathology+in+Invasive+Aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Caspofungin Increases Fungal Chitin and Eosinophil and gammadelta T Cell-Dependent Pathology in Invasive Aspergillosis.</a> J Immunol. 199 (2), 624-632 (2017).</li>
<li>Templeton, S. P., Buskirk, A. D., Law, B., Green, B. J., Beezhold, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+germination+in+murine+airway+CD8%2B+T-cell+responses+to+Aspergillus+conidia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of germination in murine airway CD8+ T-cell responses to Aspergillus conidia.</a> PLoS One. 6 (4), e18777(2011).</li>
<li>Brunel, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Antifungal+Activity+by+Human+Primary+Neutrophils+and+Monocytes+in+Response+to+A.+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus.</a> J Vis Exp. (122), (2017).</li>
<li>Rao, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+technique+for+exposing+the+mouse+lung+to+particles+aspirated+from+the+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22J+Toxicol+Environ+Health+A%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a technique for exposing the mouse lung to particles aspirated from the pharynx.</a> J Toxicol Environ Health A. 66 (15), 1441-1452 (2003).</li>
<li>Bowman, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+assay+to+measure+Aspergillus+fumigatus+burden+in+a+murine+model+of+disseminated+aspergillosis%3A+demonstration+of+efficacy+of+caspofungin+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR assay to measure Aspergillus fumigatus burden in a murine model of disseminated aspergillosis: demonstration of efficacy of caspofungin acetate.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45 (12), 3474-3481 (2001).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+RacA+mediates+intracellular+reactive+oxygen+species+production%2C+polarized+growth%2C+and+virulence+in+the+human+fungal+pathogen+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">The small GTPase RacA mediates intracellular reactive oxygen species production, polarized growth, and virulence in the human fungal pathogen Aspergillus fumigatus.</a> Eukaryot Cell. 10 (2), 174-186 (2011).</li>
<li>Sucher, A. J., Chahine, E. B., Balcer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinocandins%3A+the+newest+class+of+antifungals%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Echinocandins: the newest class of antifungals.</a> Ann Pharmacother. 43 (10), 1647-1657 (2009).</li>
<li>Herrera, M. L., Vallor, A. C., Gelfond, J. A., Patterson, T. F., Wickes, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+variation+in+18S+ribosomal+DNA+Copy+numbers+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent variation in 18S ribosomal DNA Copy numbers in Aspergillus fumigatus.</a> J Clin Microbiol. 47 (5), 1325-1332 (2009).</li>
<li>Kirkpatrick, W. R., Perea, S., Coco, B. J., Patterson, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+caspofungin+alone+and+in+combination+with+voriconazole+in+a+Guinea+pig+model+of+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Efficacy of caspofungin alone and in combination with voriconazole in a Guinea pig model of invasive aspergillosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (8), 2564-2568 (2002).</li>
<li>Petraitiene, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+efficacy+of+caspofungin+%28MK-0991%29+in+experimental+pulmonary+aspergillosis+in+persistently+neutropenic+rabbits%3A+pharmacokinetics%2C+drug+disposition%2C+and+relationship+to+galactomannan+antigenemia%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Antifungal efficacy of caspofungin (MK-0991) in experimental pulmonary aspergillosis in persistently neutropenic rabbits: pharmacokinetics, drug disposition, and relationship to galactomannan antigenemia.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (1), 12-23 (2002).</li>
<li>Cowley, A. C., Thornton, D. J., Denning, D. W., Horsley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspergillosis+and+the+role+of+mucins+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Aspergillosis and the role of mucins in cystic fibrosis.</a> Pediatr Pulmonol. 52 (4), 548-555 (2017).</li>
<li>Taylor, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fungal+organisms+in+eosinophilic+mucin+using+a+fluorescein-labeled+chitin-specific+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Detection of fungal organisms in eosinophilic mucin using a fluorescein-labeled chitin-specific binding protein.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 127 (5), 377-383 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文旨在介绍一种利用GMS染色的小鼠肺组织病理切片进行图像分析和定量，以测定侵袭性曲霉病（IA）小鼠肺部真菌负荷的方法。本研究中，针对β-葡聚糖合成的抗真菌药物卡泊芬净14在中性粒细胞减少的野生型IA小鼠中并未改善其存活率或降低真菌负荷8。然而，在缺乏嗜酸性粒细胞或γδ T细胞的情况下，小鼠的存活率和真菌负荷均有所改善。本研究结果还表明，GMS染色法测定真菌负荷所得结果与广泛使用的真菌DNA定量PCR方法6具有可比性。
使用GMS真菌负荷定量方法具有多个优势。首先，该方法可利用现有的组织学样本，从而可能减少为确定显著差异所需进行的实验次数。其次，在本研究中，与基于真菌DNA的qPCR方法相比，GMS真菌负荷定量需要更少的动物即可达到显著差异（图6，图7）。第三，通过qPCR比较不同分离株的真菌负荷时，可能受到各分离株核糖体DNA拷贝数差异的影响15。相比之下，GMS定量不受拷贝数影响，因为真菌负荷是通过肺部真菌生长的相对水平来确定的。因此，采用GMS法进行真菌负荷定量可减少脊椎动物的使用，并且无需预先测定rDNA拷贝数。最后，除了改变真菌形态外，卡泊芬净治疗还会增加真菌的碎片化，因此在通过肺组织匀浆中菌落形成单位的分离来测定时，可能人为地增加真菌负荷12,16,17。因此，GMS法在真菌负荷定量中避免了其他常用方法所固有的多个局限性。
然而，需要注意GMS染色定量方法和/或本研究的局限性。首先，作者假设各实验组小鼠肺内菌丝生长的分布具有可比性，因此采用每张切片4个代表性10倍物镜视野的定量结果作为整个肺组织真菌负荷的代表性测量值图6B). 在某些情况下，菌丝灶的相对分布、大小和密度可能存在足够差异，导致该方法显示的真菌负荷量不同，而qPCR方法检测结果则相当。然而，我们使用4倍物镜视野对整肺切片进行定量的额外结果显示，各组之间的差异趋势相似，尽管统计学意义较低 (图6C）。采用此策略会增加定量结果的标准误差，可能是因为使用4倍物镜时菌丝分辨率降低，以及在非最佳视野中背景信号增强。因此，更推荐在较高放大倍数下对较少视野进行具有代表性的定量分析。其次，每个样本仅使用了一个位于中央的单一切片。根据所用真菌分离株或小鼠品系的不同，某些研究中菌丝生长可能存在分布不均的情况。在这种情况下，应对每块石蜡包埋组织的多个不同位置切片进行定量分析，以获得更具代表性的感染负荷数据。第三，在诱导黏蛋白大量产生的实验中即，定量分析变应性支气管肺曲霉病（ABPA）中的气道真菌生长18 或囊性纤维化（CF）18），GMS染色对富含多糖的黏蛋白的反应性19 可能导致非特异性的GMS阳性结果，从而使得某些样本的真菌负荷被高估。由于本研究仅采用了中性粒细胞减少的侵袭性曲霉病模型，使用其他免疫正常或免疫抑制模型可能会导致结果的可比性降低。尽管存在这些局限性，GMS染色定量仍提供了一种可比较的方法来测定真菌负荷，其在后续研究中的持续应用可能进一步验证该方法在一致性、可靠性和成本效益方面的实用性。

侵袭性曲霉病（IA）是一种机会性感染，可能在因先天或获得性免疫缺陷、免疫抑制治疗或慢性感染而导致免疫功能低下的易感个体中发生1,2。原发感染通常发生在肺部，但在某些情况下，Aspergillus fumigatus 可播散至肝脏、肾脏、心脏和脑部，导致菌丝广泛侵入组织，引发严重疾病并具有较高的死亡率1,2。此外，现有药物治疗的疗效有限，且环境中抗真菌药物耐药菌株的出现可能进一步削弱治疗效果3。因此，深入了解促进侵袭性真菌病发生或加重的真菌毒力机制与宿主病理过程至关重要。
小鼠模型对于研究侵袭性曲霉病（IA）的发病机制仍然具有重要意义，因为它们可使研究人员评估真菌毒力基因和宿主免疫效应分子在体内A. fumigatus定植与生长过程中的作用4,5。因此，已开发出多种策略，用于有效量化或比较实验动物组中的真菌负荷量6,7。这些策略包括基于培养、生化检测、免疫测定或定量PCR（qPCR）的方法，每种方法均有其独特的优缺点。此外，使用这些方法时，需额外牺牲一部分动物，而其他动物则用于免疫效应功能评估、基因表达分析以及比较组织病理学检查7。因此，全面的侵袭性曲霉病研究通常需要大量实验动物，成本较高。因此，若能通过利用同一批动物组织进行多种分析，从而缩短实验时间、降低动物使用成本并减少伦理考量的策略，将极具价值7。
本报告介绍了一种通过量化组织切片中GMS染色来比较侵袭性曲霉病（IA）小鼠实验组间相对真菌负荷的方法。从真菌培养、感染、组织采集与处理，到图像获取及数据分析的每一步均进行了详细描述。通过中性粒细胞减少的IA模型，以及经卡泊芬净处理的野生型或嗜酸性粒细胞缺乏型IA小鼠模型，将GMS定量获得的真菌负荷结果与qPCR结果进行了比较8。结果表明，GMS定量与真菌DNA的qPCR检测结果具有相似性。这提示，GMS定量可能作为组织学分析研究人员的一种补充或替代方法，用于比较IA小鼠模型中的相对真菌负荷，并最终有助于降低复杂机制研究中科研动物的使用数量和成本。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatus&lt;/em&gt; 293 储存液</td><td>真菌遗传资源中心</td><td>FGSC #A1100</td><td></td></tr><tr><td>HyPure 细胞培养级水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr><tr><td>麦芽提取物</td><td>MP Biomedicals</td><td>2155315</td><td>白色粉末</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;BBL 酸性酶解脱水培养基：蛋白胨</td><td>费舍尔科技</td><td>L11843</td><td></td></tr><tr><td>无水右旋糖（D-葡萄糖）（颗粒粉末/ACS认证）</td><td>费舍尔科技</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents 琼脂，粉末/薄片，Fisher BioReagents</td><td>费舍尔科技</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>自动干燥柜</td><td>上海哈苏仪器制造有限公司</td><td>HSFC160FD</td><td></td></tr><tr><td>1300 系列 II 级 A2 型生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mm 玻璃珠</td><td>BioSpec 产品公司</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>费舍尔科技</td><td># 0267110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DME 型显微镜</td><td>Leica</td><td>13595XXX</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 管</td><td>费舍尔科技</td><td># 05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide&amp;nbsp;注射器针头，27 号，长度 1/2 英寸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z192384</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly-6G 抗体</td><td>BioXCell</td><td>BP0075-1</td><td>克隆 1A8</td></tr><tr><td>醋酸卡泊芬净</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>亨利·谢恩动物健康公司</td><td>1169567762</td><td></td></tr><tr><td>非重复呼吸台式兽用麻醉机</td><td>Supera 麻醉创新公司</td><td>M3000</td><td></td></tr><tr><td>Pureline 氧气浓缩器</td><td>Supera 麻醉创新公司</td><td>OC8000</td><td></td></tr><tr><td>斜板固定装置</td><td>印第安纳州立大学设施管理部</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&amp;nbsp;PIPETMAN Classic 200 ml 移液器</td><td>费舍尔科技</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠（Fatal-Plus）</td><td>Vortech 制药公司</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>通用宽头镊子</td><td>费舍尔科技</td><td>10-300</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;标准解剖剪</td><td>费舍尔科技</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 通用弯头镊子</td><td>费舍尔科技</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>乙醇-200 证明</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 吸水垫</td><td>费舍尔科技</td><td>14-206-63</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide&amp;nbsp;注射器针头，25 号，长度 1 英寸</td><td>费舍尔科技</td><td>Z192406</td><td></td></tr><tr><td>全塑料 Norm-Ject 注射器</td><td>费舍尔科技</td><td>14-817-30</td><td></td></tr><tr><td>IV 导管 Angiocath 22G×1 英寸 50B</td><td>费舍尔科技</td><td>NC9742754</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林溶液，中性缓冲，10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon 包埋盒 II，管装</td><td>费舍尔科技</td><td>B1000729</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest&amp;nbsp;Histoplast 石蜡</td><td>费舍尔科技</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>一次性底模</td><td>费舍尔科技</td><td>22-363-554</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Jung Histocut 820 切片机</td><td>Labequip.com</td><td>31930</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Precision Scientific</td><td>66630-23</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>费舍尔科技</td><td>116875H</td><td></td></tr><tr><td>银染（改良 GMS）试剂盒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT100A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>费舍尔科技</td><td>AC410530250</td><td></td></tr><tr><td>磨砂载玻片</td><td>费舍尔科技</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Fisherfinest Superslip 盖玻片</td><td>费舍尔科技</td><td>12-545-89</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>费舍尔科技</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Provis AX70 显微镜</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-AX70</td><td></td></tr><tr><td>U-PHOTO 通用摄影系统</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-PHOTO</td><td></td></tr><tr><td>U-MCB-2 多功能控制盒</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-MCB-2</td><td></td></tr><tr><td>U-PS 电源单元</td><td>Olympus</td><td>OLYMPUS-U-PS</td><td></td></tr><tr><td>FreeZone 1 升台式冷冻干燥系统</td><td>LABCONCO</td><td>7740020</td><td></td></tr><tr><td>Maxima C&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;真空泵</td><td>费舍尔科技</td><td>01-257-80</td><td>排气量-6.1 cfm</td></tr><tr><td>1-丁醇</td><td>费舍尔科技</td><td>A383-4</td><td></td></tr><tr><td>AMRESCO&amp;nbsp;苯酚-氯仿-异戊醇 100 mL&amp;nbsp;DFS</td><td>费舍尔科技</td><td>NC9573988</td><td></td></tr><tr><td>带螺帽的独立式微量离心管</td><td>费舍尔科技</td><td># 02-682-557</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-24</td><td>BioSpec 产品公司</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>BioSpec 产品公司供应商多元化合作伙伴 2.3 mm 氧化锆珠</td><td>费舍尔科技</td><td>NC0451999</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱（白色晶体或结晶粉末/分子生物学级）</td><td>费舍尔科技</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，ACS Plus 认证</td><td>费舍尔科技</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>费舍尔科技</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS），白色粉末，电泳级</td><td>费舍尔科技</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>氯仿/异戊醇 24:1</td><td>费舍尔科技</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Biotek Epoch 微孔板分光光度计</td><td>费舍尔科技</td><td>11-120-570</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;trade;&amp;nbsp;ABsolute Blue qPCR 混合液</td><td>费舍尔科技</td><td>AB4137A</td><td></td></tr><tr><td>杂交探针，5&amp;prime;-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3&amp;prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>正向扩增引物，5&amp;prime;-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3&amp;prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>反向扩增引物，5&amp;prime;-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3&amp;prime;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems&amp;trade; MicroAmp&amp;trade; 光学 8 孔管条，0.2 mL</td><td>费舍尔科技</td><td>43-165-67</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;圆顶和平面 PCR 盖条</td><td>费舍尔科技</td><td>AB-0386</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P QPCR 系统，110 伏</td><td>安捷伦</td><td>401443</td><td>Stratagene 现为安捷伦旗下公司</td></tr><tr><td>BALB/c 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000651</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 (B6) 小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>嗜酸性粒细胞缺陷型（&amp;Delta;dblGATA，BALB/c 背景）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>005653</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;&amp;delta; T 细胞缺陷型（TCR&amp;delta;-/-，B6 背景）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>002120</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>N/A</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Spot Advanced 软件</td><td>Spot Imaging</td><td>SPOT53A</td><td>http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad 软件公司</td><td>N/A</td><td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr><tr><td>Fisherbrand 吸水垫</td><td>费舍尔科技</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>步骤 4.5</td><td></td><td></td><td>http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf</td></tr></tbody></table>

组织学定量法测定实验性曲霉病中的肺部真菌负荷

Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis

肺部真菌负荷量的定量对于确定肺部真菌感染小鼠模型中免疫保护水平与真菌毒力的相对关系至关重要。尽管目前有多种方法用于评估真菌负荷，但针对真菌DNA的定量聚合酶链式反应（qPCR）技术已显示出较传统基于培养的方法的多项优势。目前，对侵袭性曲霉病（IA）小鼠的肺部病理学、白细胞募集、真菌负荷及基因表达进行全面评估，通常需要使用大量实验组和对照组动物。本文详细探讨了利用较少数量动物通过肺组织病理染色定量来测定真菌负荷的方法。肺组织切片采用改良戈莫里六胺银（GMS）染色法以识别真菌结构。从每例福尔马林固定石蜡包埋肺组织的4个不同视野获取GMS染色切片图像。利用图像分析软件对每幅图像中的GMS染色区域进行定量，并据此计算各样本的平均染色面积百分比。采用该策略发现，嗜酸性粒细胞缺陷小鼠在接受卡泊芬净治疗后真菌负荷和疾病程度均降低，而野生型IA小鼠在接受卡泊芬净治疗后未见改善。类似地，通过qPCR和GMS定量检测发现，缺乏γδ T细胞的小鼠在接受卡泊芬净治疗后真菌负荷亦得到改善。因此，GMS染色定量被提出作为一种测定肺部相对真菌负荷的方法，有望最终减少侵袭性曲霉病综合研究所需的实验动物数量。

图4 包含一张图表，显示了经卡泊芬净治疗的野生型或嗜酸性粒细胞缺乏小鼠在侵袭性曲霉病（IA）中的生存情况。结果显示，与野生型小鼠相比，嗜酸性粒细胞缺乏小鼠的存活率更高（死亡率分别为50%和100%）。图5 展示了中性粒细胞减少的野生型和嗜酸性粒细胞缺乏小鼠在侵袭性曲霉病中经卡泊芬净治疗或未治疗时，其代表性GMS染色结果。卡泊芬净治疗在嗜酸性粒细胞缺乏小鼠中表现出相对的真菌清除效果，但在野生型小鼠中未见此效果（右侧面板）；而未接受卡泊芬净治疗的两组小鼠之间则无明显差异（左侧面板）。图6 通过真菌DNA的qPCR检测（图6A）以及4个代表性视野（10倍物镜）的GMS染色定量分析（图6B），比较了经卡泊芬净治疗与未治疗的对照组野生型或嗜酸性粒细胞缺乏小鼠的真菌负荷。两种技术所得结果均显示，在卡泊芬净治疗后，嗜酸性粒细胞缺乏小鼠相较于野生型小鼠的真菌负荷下降最为显著（图6A）。然而，在未治疗的小鼠中，仅GMS定量分析显示出缺乏嗜酸性粒细胞的小鼠真菌负荷显著降低（图6B）。当计算全肺GMS染色切片的平均面积（4倍物镜）时，其差异趋势与4个代表性10倍视野的结果相似，但统计学显著性较低（图6C）。图7 展示了γδ T细胞缺乏（TCRδKO）小鼠在接受卡泊芬净治疗后与未治疗对照组小鼠相比的生存情况、代表性GMS染色图像（4个10倍视野）以及两种方法对真菌负荷的定量分析结果。卡泊芬净治疗改善了TCRδKO小鼠的生存率（图7A）及真菌负荷（图7B–D）。与图6的结果类似，通过qPCR测定的真菌负荷（图7B）与代表性GMS定量分析结果（图7C）具有可比性。
<img alt="生存分析图；感染后天数 vs. 生存率；WT 与 Caspofungin 处理的 Eo-/- 小鼠。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：经卡泊芬净治疗后，嗜酸性粒细胞缺陷（ΔdblGATA）小鼠在侵袭性曲霉病（IA）中的生存率提高。 每组 15–30 只小鼠。数据汇总自 3–6 次独立实验。**** p &lt; 0.0001。本图改编自先前发表的研究8。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="肺组织病理学；抗真菌药物卡泊芬净治疗；对照组/治疗组；显微镜检查。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：患有侵袭性曲霉病（IA）的野生型、嗜酸性粒细胞缺乏型以及接受卡泊芬净治疗或未治疗对照小鼠的GMS染色肺组织切片代表性图像。 每组代表3-4只小鼠。比例尺相当于100 µm。本图改编自先前发表的研究8。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="qPCR 和 GMS 结果；柱状图显示 Caspo 对真菌 DNA 和 GMS+ 面积的治疗效果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：经卡泊芬净治疗或对照处理的野生型和嗜酸性粒细胞缺乏型小鼠在侵袭性曲霉病（IA）中的真菌负荷。（A）真菌DNA的qPCR检测结果，每组15-30只小鼠，汇总自3-6次实验。（B）组织切片GMS染色定量分析，数据来自4个视野（10倍物镜）的GMS染色平均百分比。（C）全肺切片GMS染色定量分析（4倍物镜），取每组5只小鼠结果的汇总。* p &lt; 0.05。*** p &lt; 0.001。**** p &lt; 0.0001。本图所用数据来自先前发表的研究8。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="TCRδKO感染分析；生存曲线、DNA定量、GMS面积比较；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57155/57155fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：卡泊芬净治疗后γδ T细胞缺陷小鼠侵袭性曲霉病（IA）严重程度降低。（A）生存率。（B）真菌DNA的qPCR检测。（C）组织学GMS染色定量分析。（D）患有IA的γδ T细胞缺陷小鼠经卡泊芬净治疗或未治疗的GMS染色组织切片代表性图像。A和B为两项独立实验的汇总结果，每组7–10只小鼠；C和D为每组4只小鼠的汇总结果。*p &lt; 0.05。**p &lt; 0.01。***p &lt; 0.001。本图改编自先前发表的研究8。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57155/57155fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本文介绍了一种通过定量组织切片中Gomori改良银染法染色来测定侵袭性曲霉病小鼠肺部真菌负荷的实验方案。与通过肺组织真菌DNA的定量PCR评估真菌负荷的方法相比，该方法在使用较少动物的情况下即可获得可比的结果。

肺部真菌负荷量的定量对于确定小鼠体内免疫保护水平与真菌毒力的相对程度至关重要...

本实验方案的总体目标是通过组织学分析来定量评估侵袭性曲霉病小鼠肺部的真菌负荷。该方法有助于解答真菌致病机制领域中的关键问题，例如宿主保护性与有害免疫应答机制以及真菌关键毒力因子的作用。该技术的主要优势在于，可利用现有的组织学样本进行真菌负荷评估，其结果与基于肺组织真菌DNA的定量PCR检测结果具有可比性。尽管该方法可为侵袭性曲霉病提供研究依据，也可应用于其他疾病的研究，其中病原体可在宿主组织内进行差异染色。我们最初产生该方法的想法，是在探索肺部真菌负荷量化替代方法时，希望获得比DNA定量方法变异性更小的结果。感染与组织收获操作的示范将由研究技术员Angar Tsoggeral完成。感染前24小时，将0.5毫克抗小鼠Ly-6G抗体溶于无菌生理盐水中，以45度角注射至每只7至10周龄实验小鼠的右下腹外侧象限腹腔内，以耗竭其中性粒细胞，并将小鼠放回笼中。次日早晨，将1.5克直径0.5毫米的玻璃珠倒入一株烟曲霉分生孢子培养皿中，轻轻来回倾斜培养皿，直至玻璃珠表面均匀附着真菌。收集带有分生孢子的玻璃珠混合物至15毫升锥形管中，并用5毫升DPBS悬浮玻璃珠。涡旋珠子以使其从真菌上脱离，并用血细胞计数板对上清液50倍稀释后计数分生孢子。将分生孢子稀释至每毫升DPBS溶液含1×10⁸个分生孢子的浓度，每只小鼠使用独立的微量移液器加入50微升分生孢子溶液。确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将第一只麻醉的小鼠仰卧置于倾斜板上，用橡皮筋轻轻固定上切牙，用金属丝固定下切牙。然后，用小镊子小心夹住舌头并将其完全伸展，将50微升分生孢子溶液滴加至舌根部。保持舌头完全伸展，观察20秒或直至悬液完全吸入，期间注意听快速呼吸声以及吸入时特有的咔哒声。随后，轻柔地将小鼠放回笼中，持续监测直至其完全恢复卧姿，并对下一只动物进行感染操作。当所有小鼠均完成感染后，对其中一部分动物注射抗真菌药物，并在感染后24小时对所有动物重复进行中性粒细胞耗竭处理。接种真菌三天后，将第一只小鼠仰卧固定于覆盖吸水垫的泡沫板上。通过脚趾夹捏法确认小鼠已安乐死，并用70%乙醇对体表毛发进行消毒。固定四肢后，使用剪刀小心地打开上胸部腔体，剪除肋骨以暴露肺和心脏。剪断从心脏下行的下腔静脉，注意避免损伤其他血管或刺破任何器官，并使用配备25号针头的5毫升注射器，以45度角缓慢将5毫升冷DPBS注入右心室。以相同方式用5毫升10%福尔马林灌注后，小心暴露气管并分离周围脂肪组织，注意不要刺破气管。用镊子抬起暴露的气管，使用25号针头在上段气管处刺一个小孔。小心地将套管经小孔插入并朝向肺部，用手术线在气管周围轻轻打结以固定套管。使用1毫升注射器通过套管向肺内注入1毫升10%甲醛缓冲液，然后迅速但小心地拔出套管。收紧手术缝线以封闭气管，并轻轻牵拉缝线，分离结缔组织，从而取出肺脏和气管。将组织置于含有15毫升10%福尔马林缓冲液的15毫升锥形管中，缝线的一端留在管外。然后，盖紧管盖并倒置试管，使样本和固定液完全浸没，固定至少24小时。为了对获取的组织进行成像，首先打开合适的图像定量分析软件，使用光学显微镜在10倍物镜下对每张改良Gomori六胺银（GMS）染色切片至少采集四个不同的视野。确保所获取的图像能够代表肺内受感染的气道，并且组织密度相似。为图像添加比例尺时，在“编辑”菜单下选择“添加/编辑校准标记”，然后选择线条粗细、颜色和比例尺大小。单击要放置比例尺的图像位置，然后打开“编辑”菜单，选择“合并”和“合并校准标记”，以向每幅图像添加比例尺，并将图像保存到相应的实验分组文件夹中。为计算每只动物的真菌负荷量，请打开合适的图像处理程序，并打开第一个图像文件夹。在“图像”菜单下，选择“类型”和“RGB堆栈”以转换图像。使用右箭头键选择三张图像中的第二张，然后按下 Control-Shift-T 打开阈值菜单设置调节器。找到原始的 tiff 或 jpg 图像作为参考，并使用图像查看程序打开该图像。在选择阈值时，必须能够查看原始图像，以确保所选区域能代表真菌菌丝，并保证样品之间的一致性。将顶部滑块完全移至最左侧，调整底部滑块，直至选定的红色区域能够代表显微图像。单击“Set”和“OK”，然后选择“Analyze”菜单中的“Set Measurements”，勾选“Area”、“Area fraction”、“Limit to threshold”、“Display label”，底部设置保持默认。单击“OK”，然后选择“Analyze”菜单中的“Measure”。结果将会显示。然后，将数据导出至数据分析程序，用于绘图和统计分析，并输入每份肺组织样本的四个或更多区域百分比的平均值。正如该代表性生存曲线所示，感染后接受抗真菌药物治疗的侵袭性曲霉病嗜酸性粒细胞缺陷小鼠，其存活率高于野生型动物。中性粒细胞减少的野生型小鼠和嗜酸性粒细胞缺陷小鼠在侵袭性曲霉病情况下进行GMS染色的代表性结果显示，在接受抗真菌治疗的基因敲除小鼠中几乎完全清除了真菌，而无论是否接受抗真菌治疗的野生型动物中均未观察到类似效果。此外，如前所述，定量PCR和人工显微镜下GMS定量分析均证实，抗真菌药物治疗导致野生型小鼠与嗜酸性粒细胞缺陷小鼠之间的真菌负荷下降最为显著。然而，在未治疗的小鼠中，仅GMS定量分析确定本实验中嗜酸性粒细胞缺陷小鼠的真菌负荷存在显著降低。在4倍放大倍数下计算整个肺组织GMS染色切片的平均面积时，所得差异与选取四个代表性10倍视野所获得的结果相似，但统计学显著性较低。在接受相同抗真菌药物治疗的情况下，γδ T细胞缺陷小鼠也表现出相似的存活率、真菌负荷量及真菌清除结果。在进行该操作时，拍摄组织学切片图像以及调整阈值参数应保持一致性，以获得可比较的结果。完成此操作后，还可采用其他组织学分析方法，对目标染色与背景染色之间存在明显差异的样本进行分析，以进一步探讨肺部及其他组织中与疾病病理相关的问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过非自主吸入法使小鼠感染真菌分生孢子，以及如何利用图像处理软件定量分析肺组织切片中的真菌生长情况。请务必注意，操作烟曲霉（Aspergillus fumigatus）和使用改良戈莫里六胺银染色法具有潜在危险性，进行该实验时必须采取适当防护措施，例如佩戴个人防护装备，并在通风良好的通风橱内操作。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

实验性曲霉病肺真菌负担的组织学定量测定

我们展示了如何使用双光子显微镜观察感染肺组织中中性粒细胞的动态行为，包括其中性粒细胞吞噬病原体或形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过程。...

利用双光子显微镜直接观察感染肺组织中中性粒细胞的吞噬作用及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成

关键词：中性粒细胞，吞噬作用，中性粒细胞胞外诱捕网（NET），双光子显微镜，肺部感染，活体成像

种子感染性真菌对谷类作物造成的破坏已促使大量研究致力于深入理解植物与病原体之间的相互作用。为了在实验室条件下研究种子与真菌的相互作用，我们开发了一种可靠的方法，通过籽粒生物测定来定量分析真菌繁殖、生物量及真菌毒素污染情况。...

利用籽粒生物测定法量化真菌定殖、产孢及真菌毒素的产生

本视频展示了一种定量检测斑马鱼幼鱼真菌感染的方法。将真菌孢子显微注射至幼鱼后脑室，随后孵育以促进感染发展。在预定时间点收集感染幼鱼，并通过计数菌落形成单位来评估感染进展。...

一种定量斑马鱼幼鱼真菌感染的技术

本视频展示了一种定量检测人白细胞吞噬FITC标记的致病性真菌孢子的方法。通过复染区分被吞噬的孢子与黏附在细胞表面的孢子，随后进行流式细胞术分析。...

定量流式细胞术检测人吞噬细胞对真菌孢子的吞噬作用

一种通过共聚焦显微镜评估分离的小鼠肺泡巨噬细胞控制吞噬的Aspergillus孢子生长能力的方法。...

通过共聚焦显微镜评估分离肺泡巨噬细胞的抗真菌活性

本方案提供了一种快速、可靠的方法，利用流式细胞术定量检测人原代吞噬细胞对Aspergillus...

使用流式细胞术测量人白细胞对Aspergillus fumigatus分生孢子的吞噬作用

本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中建立Aspergillus感染的模型。Aspergillus孢子被显微注射至幼鱼的后脑，通过化学处理诱导免疫抑制。利用每日成像系统监测感染进展，以观察真菌生长和免疫反应，并通过菌落形成单位平板法对存活孢子进行计数。...

斑马鱼幼虫感染 曲霉属 用于宿主-病原体相互作用分析的孢子

我们描述了一种对小鼠气道中Aspergillus fumigatus分生孢子（大小为3...

基于共聚焦激光扫描显微镜的整装透明化小鼠肺组织中Aspergillus fumigatus分生孢子分布的定量分析

我们介绍一种无需标记的活体成像方案，利用透射光显微技术对丝状真菌A.

使用活体显微镜和开源软件对Aspergillus nidulans生长速率进行定量分析

我们提出了一种真菌致病模型方法，该方法可保持真菌孢子在肺部气道中的自然定位，以便通过荧光显微镜进行分析。...

一种高效成像小鼠肺部的方法，可保留气道内真菌孢子的空间动态

了解如何使用Gomori改良六胺银染色法对小鼠侵袭性曲霉病肺部真菌负荷进行组织学定量测定。该方法可利用现有组织样本，减少动物使用数量，结果与定量PCR相当，有助于研究真菌致病机制和宿主免疫反应。

组织学定量法测定实验性曲霉病中的肺部真菌负荷

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