Name: 一种体内评价大鼠缺血性中风模型中血脑屏障的破坏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学习一种在大鼠缺血性中风模型中评估血脑屏障破坏的体内方法。该技术采用线栓法诱导大脑中动脉闭塞，并通过伊文思蓝染料渗透性检测来定量分析屏障完整性，为神经科学研究提供可靠的可重复实验方案。

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作者感谢伊朗阿尔达比勒医科大学研究副校长提供的资金支持（资助编号：9607）。

所有操作均按照阿尔达比尔医科大学研究委员会关于动物实验的指南进行（伦理编号：IR.ARUMS.REC.1394.08）。在本可视化研究中，我们使用了来自伊朗德黑兰巴斯德研究所的成年雄性Sprague-Dawley大鼠（300-350克）。
1. 麻醉与血流测定
<ol>
	<li>使用4%异氟烷诱导麻醉，并在手术期间通过一氧化二氮（70% v/v）和氧气（30% v/v）的混合气体中维持1-1.5%的异氟烷浓度以维持麻醉状态。</li>
	<li>将麻醉后的动物俯卧于反馈控制的加热毯上，并通过连接该加热装置的直肠探针将体温维持在37±0.5 °C。</li>
	<li>在双眼上涂抹少量眼用软膏，以防角膜干燥。</li>
	<li>使用电动剃刀剃除颅骨左侧手术区域的毛发，然后用浸有聚维酮碘溶液的纱布擦拭皮肤进行消毒；再用含70%乙醇的无菌纱布擦拭该区域，上述两步操作重复三个循环17。</li>
	<li>为实现镇痛，于手术区域皮下注射0.2 mL的0.5%布比卡因17。</li>
	<li>在颅骨上做一条长约1 cm的皮肤切口（从左眼外眦延伸至左耳根部），分离左侧颞肌以暴露颅骨。随后，在前囟外侧5 mm、后方1 mm处钻一小孔18，以便放置多普勒血流仪笔式探头的尖端。</li>
	<li>将大鼠由俯卧位转为仰卧位，然后将激光笔式探头插入先前钻好的颅骨盲孔中，以监测局部脑血流量（rCBF）。</li>
	<li>记录每只动物的基础rCBF值，并将其设定为100%。值得注意的是，一旦检测到rCBF下降超过80%，即开始中动脉闭塞（MCAO）操作19,20。</li>
</ol>
2. 局灶性脑缺血的诱导
<ol>
	<li>剃除颈部区域的毛发，并用聚维酮碘溶液和70%乙醇对皮肤进行消毒。在手术部位皮下注射0.2 mL的0.5%布比卡因以进行镇痛17。</li>
	<li>在颈部腹侧做一条长约2 cm的手术切口，以暴露左侧颈总动脉（LCCA）。分离LCCA与其周围的筋膜及迷走神经，以显露颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）的分叉处。</li>
	<li>使用5-0丝线永久结扎LCCA或ECA，并游离ICA至翼腭动脉水平。</li>
	<li>在LCCA周围松松地打一个结（5-0丝线），然后用血管微夹暂时夹闭ICA。</li>
	<li>在先前放置的松结之前，于LCCA上做一个小切口，随后将一根4-0硅胶包被的尼龙线经此切口插入ICA管腔内，并收紧LCCA周围的结扎线以固定尼龙线，防止血液渗漏。</li>
	<li>移除ICA上的血管微夹，然后推进硅胶包被的管腔内纤维，直至观察到局部脑血流（rCBF）显著下降，表明大脑中动脉（MCA）起始段已被阻塞。缺血期结束（90分钟）后，通过撤出管腔内尼龙线开始再灌注21。</li>
</ol>
3. 颈静脉插管与伊文思蓝（EB）注射
<ol>
	<li>在颈部中线左侧做一长约1 cm的纵行切口，钝性分离浅层筋膜以暴露左侧颈外静脉（LGV）。用5-0丝线永久结扎LGV的头端，在静脉上松松地绕两道结扎线，然后用血管微夹暂时夹闭LGV的心端。</li>
	<li>在两道结扎线之间的LGV上做一小切口，将充满肝素化血清的导管插入静脉管腔内并推进约10 mm。随后收紧静脉周围的结扎线以固定导管并防止出血。注入少量血清以避免静脉塌陷。</li>
	<li>在再灌注期开始时，缓慢注射伊文思蓝染料（2% EB溶液，1 mL/kg），持续5分钟。随后用0.5 mL生理盐水冲洗导管，并从静脉中撤出注射导管12,22。</li>
	<li>最后缝合颈部和头部切口，并腹腔注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡（IP），在再灌注期间每6-8小时重复给药一次，以提供术后镇痛17。</li>
	<li>腹腔注射5 mL预温的生理盐水，以在恢复笼中提供水合支持17。</li>
	<li>将动物置于配备温控和空调系统的专用恢复笼中，并监测其从麻醉状态恢复的情况。</li>
</ol>
4. 血脑屏障通透性的评估
<ol>
	<li>在再灌注24小时后，使用硫喷妥钠对动物进行深度麻醉。随后，在胸骨下方打一个小孔以打开胸腔。</li>
	<li>在右心房做一个小切口，通过左心室以110 mmHg的压力注入250 mL预热至37 ˚C的0.9%生理盐水，持续15分钟，冲洗循环系统中的EB，直至从心房流出的生理盐水变为无色。23.</li>
	<li>立即从颅骨中取出大脑并放入脑切片矩阵中。分离嗅球和小脑，然后使用洁净的剃刀刀片沿中线将大脑右半球与左侧（损伤侧）分开。</li>
	<li>称取每个半脑的重量，分别加入2.5 mL磷酸盐缓冲液进行匀浆，再加入2.5 mL三氯乙酸（60%），使用涡旋振荡器混匀2分钟。</li>
	<li>将脑组织样本在1,322 × g条件下离心30分钟，并置于4 °C冰箱中冷却10分钟。</li>
	<li>使用上清液在610 nm波长下通过分光光度计测定EB的吸光度23.</li>
	<li>根据标准曲线计算EB浓度，并以每克脑组织中的微克数（µg/g）表示结果。</li>
</ol>
5. EB 标准曲线的制备
<ol>
	<li>配制10份EB样品溶液，每份含1-10 µg EB溶于5 mL磷酸盐缓冲液中。</li>
	<li>使用分光光度计在610 nm波长下测定各样品的吸光度值。</li>
	<li>利用电子表格绘制散点图，以EB浓度为X轴，吸光度值为Y轴（图1）。</li>
	<li>为曲线拟合线性趋势线并显示其方程，然后利用该方程计算样品中EB的浓度。</li>
	<li>以每克脑组织重量所含EB的µg数（µg/g）报告EB外渗的最终结果。</li>
</ol>
6. 假手术操作
<ol>
	<li>对假手术组大鼠执行相同的手术操作（包括在颈部区域做切口和EB注射），但不进行大脑中动脉阻塞（MCAO）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

迄今为止，已有多种方法被用于评估血脑屏障损伤，包括放射自显影和放射性示踪剂检测24,25、免疫荧光显微镜技术26,27以及伊文思蓝（EB）外渗技术20,23。伊文思蓝染料可强烈结合血清白蛋白，常被用作检测血管渗漏和量化血脑屏障破坏的示踪剂11,28,29。作为一种广泛接受且可靠的方法，伊文思蓝外渗技术可直接评估受不同脑损伤（包括缺血性脑卒中）影响的血脑屏障完整性。
体内评估血脑屏障（BBB）可使研究人员研究缺血诱导的血管源性脑水肿可...

由于血脑屏障（BBB）破坏所导致的血管源性脑水肿仍是缺血性卒中的重要并发症，并且是影响卒中患者生存率的主要因素1,2。血脑屏障（BBB）由脑毛细血管内皮细胞（BCECs）构成，并包含特定的神经血管组分（例如，BCECs之间的紧密连接、周细胞、星形胶质细胞和神经元细胞3），在中枢神经系统（CNS）与外周血液循环之间形成一个特化的动态界面4,5。缺血-再灌注损伤等损害可破坏BBB的功能完整性，导致循环中的白细胞继而侵入脑实质，最终引发脑部炎症和原发性脑损伤6,7。为了精确检测卒中发生后BBB功能障碍，需要借助动物模型。这类模型对于研究潜在的病理生理机制以及开发新的神经保护策略具有重要意义。体外基于细胞培养的BBB模型已得到高度发展，并广泛用于BBB病理生理学的分子研究8,9,10。然而，能够产生类似于人类临床状况下BBB缺血性损伤的体内动物模型，在此领域同样具有重要价值。伊文思蓝（Evans blue, EB）外渗的定量检测是一种被广泛认可且敏感的技术，已用于评估包括缺血性卒中在内的神经退行性疾病中BBB的完整性和功能11,12,13,14。该方法成本低、可行性强、可重复，并且完全适用于任何实验实验室。其实施无需依赖其他方法所必需的高级设备，例如放射性示踪剂15或磁共振成像（MRI）16。本文全面展示了在缺血性卒中大鼠模型中利用EB外渗评估BBB功能的基本技术流程。

<table><tbody><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td>AWN 34041100</td><td>20 - 25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）</td><td>Molekula</td><td>31216368</td><td>4年</td></tr><tr><td>Sprague&amp;ndash;Dawley大鼠&amp;nbsp;</td><td>伊朗德黑兰Pasture研究所</td><td></td><td>300-350g</td></tr><tr><td>伊文思蓝&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>76-03-9</td><td>2年</td></tr><tr><td>盐酸布比卡因（0.5%）</td><td>Delpharm Tours</td><td></td><td>低于&amp;nbsp;25 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Exir（伊朗）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>EMD Millipore&amp;nbsp;</td><td>231-448-7</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>硅胶（Xantopren）</td><td>Heraeus</td><td>EN ISO 4823</td><td></td></tr><tr><td>通用活化剂Plus</td><td>Heraeus</td><td>66037445</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Stoelting</td><td>52100-41</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Stoelting</td><td>52130-00</td><td></td></tr><tr><td>手术剪&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>52140-70</td><td></td></tr><tr><td>脑组织切片模具&amp;nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51390</td><td></td></tr><tr><td>小动物麻醉机</td><td>&amp;nbsp;Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Power Lab系统</td><td>AD Instruments</td><td>ML880</td><td></td></tr><tr><td>激光多普勒血流仪</td><td>AD Instruments</td><td>ML191</td><td></td></tr><tr><td>加热反馈系统</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-7560</td><td></td></tr><tr><td>血管微夹</td><td>FineScience Tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>5-0丝线缝合线</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td></td></tr><tr><td>4-0尼龙缝合线&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>EH6740G</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

缺血性脑卒中可导致血管源性脑水肿及继发的原发性脑损伤，其机制与血脑屏障（BBB）破坏有关。本研究建立并使用了诱导性缺血性脑卒中大鼠作为体内模型，以评估血脑屏障的功能完整性。通过分光光度法检测缺血损伤脑组织中伊文思蓝（EB）的含量，可为新型治疗策略的研发提供可靠依据。该方法结果可重复，且无需特殊设备，适用于任何实验室。本文提供了在大鼠缺血性脑卒中诱导后检测伊文思蓝外渗的可视化技术操作指南。

假手术组大鼠右侧半球与左侧半球的伊文思蓝（EB）水平之间无显著差异（分别为 1.06 ± 0.1 µg/g 和 1.1 ± 0.09 µg/g）。如图2A-2B所示，短暂性缺血诱导（90 分钟缺血/24 小时再灌注）导致缺血组大鼠左侧半球 EB 水平显著升高（10.41 ± 0.84 µg/g，p &lt;0.001），与假手术组大鼠相应半球相比具有显著差异。综上所述，这些结果表明，在正常情况下，EB 不能轻易穿过血脑屏障（BBB）进入脑实质，而脑缺血损伤则通过增加血脑屏障通透性，诱导 EB 渗出（图2A 和 2B）。
<img alt="线性回归图，溴化乙锭吸光度与浓度的关系，R²=0.99，校准曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57156/57156fig1.jpg" data-altupdatedat="17...

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的技术，用于在缺血性脑卒中大鼠模型中进行血脑屏障破坏的体内评估。

缺血性脑卒中可导致血管源性脑水肿及继发的原发性脑损伤，其机制与血脑屏障的破坏有关……

本实验的总体目标是提供一种高度可重复的方法，用于在缺血性卒中再灌注模型中评估血脑屏障的破坏情况。该方法通过使用血管内线栓法阻塞大脑中动脉左侧，从而诱导缺血性卒中。实验的下一步是在颈外静脉分支处进行插管，并在大脑中动脉阻塞结束及再灌注期开始时注射伊文思蓝染料。24小时后，在深度麻醉下，将动物体内的伊文思蓝从循环系统中冲洗干净，并取出脑组织。随后分离两个大脑半球，进行匀浆和离心处理，最终采用分光光度计测定组织上清液中的伊文思蓝浓度。麻醉与血流测定。使用4%异氟烷诱导麻醉，并在手术期间通过70%氧化亚氮和13%氧气混合气体中含1-1.5%异氟烷维持麻醉。将麻醉后的动物俯卧位置于反馈控制加热毯上，并通过连接该加热装置的直肠探针将体温维持在正常生理范围内。剃除颅骨左侧手术区域的毛发，并使用纱布蘸取碘伏溶液对皮肤进行消毒。更换为含有70%乙醇的无菌垫，并重复上述两个步骤，共进行三个循环。在颅骨上做一长度为1厘米的皮肤切口，从左眼外眦延伸至左耳根部，分离左侧颞肌以暴露颅骨。然后在冠状缝外侧5毫米、后方1毫米处钻一小孔，以便放置多普勒血流仪笔式探头的尖端。将大鼠从俯卧位转为仰卧位，然后将激光笔式探头插入先前钻好的颅骨孔中，以监测局部脑血流量。记录每只动物的基础局部脑血流量，并将其视为100%。诱导局灶性脑缺血。剃除颈部区域毛发，并用聚维酮碘溶液和70%乙醇对皮肤进行消毒。在手术部位皮下注射 0.2 毫升 0.5% 布比卡因以进行镇痛。在颈部腹侧做一处长约 2 厘米的手术切口，以暴露左侧颈总动脉。分离颈总动脉与其周围的筋膜及迷走神经，暴露颈外动脉与颈内动脉的分叉处。使用5-0丝线永久结扎左侧颈总动脉或颈外动脉，并游离颈内动脉至翼腭动脉水平。在颈总动脉上松松地放置一根5-0丝线，然后用血管显微夹暂时夹闭颈内动脉。在先前放置的松结 proximal 端的颈总动脉上做一小切口，将一根4-0硅胶包被的尼龙线插入颈内动脉管腔内，收紧围绕颈总动脉的结扎线以固定尼龙线，并防止血液渗漏。移除颈内动脉上的血管微夹。然后推进硅胶包被的管内缝合线，直至观察到局部脑血流量显著下降，表明大脑中动脉起始部已被阻塞。值得注意的是，当检测到局部脑血流量减少超过80%时，即开始判定为大脑中动脉阻塞。在此模型中，我们使用微型夹暂时阻断翼腭动脉，以引导丝线正确进入翼腭动脉路径。注意，此步骤对于大脑中动脉阻塞的成功至关重要。颈静脉插管及伊文思蓝注射。在颈部中线左侧做一厘米长的纵向切口，然后钝性分离浅筋膜，暴露左侧颈静脉的外支。随后使用5-0缝线永久结扎颈静脉的角端。在静脉周围松松地放置两道结扎线，然后用血管显微夹暂时夹闭颈静脉的心脏端。用两根缝线在颈静脉上做一个小切口，然后将充满肝素化血清的导管插入静脉管腔内，并推进约10毫米。随后收紧静脉周围的结扎线以固定导管并防止出血。注射少量血清以避免静脉塌陷。缺血期结束时（即90分钟时），通过撤出血管内缝线开始再灌注。在再灌注期开始时，于5分钟内缓慢注射伊文思蓝染料，剂量为每千克体重1毫升的2%生理盐水溶液。随后，通过注射0.5毫升生理盐水冲洗导管，并从静脉中撤出注射导管。观察伊文思蓝注射后组织的颜色变化。最后，缝合颈部和头部切口，并将动物置于恢复笼中。评估血脑屏障通透性。再灌注24小时后，使用硫喷妥钠深度麻醉动物。随后在胸骨下方开一个小孔，打开胸腔。在右心房上做一个小切口，通过左心室注入250毫升预热的生理盐水，持续15分钟，以冲洗循环系统中的伊文思蓝，直至从心房流出的生理盐水变为无色为止。立即从颅骨中取出脑组织并置于脑切片矩阵中。分离嗅球和小脑，然后使用干净的剃须刀片沿中线将脑的右半球与左半球分开。称量每个半脑，分别在2.5毫升磷酸盐缓冲液中匀浆，再使用涡旋振荡器与2.5毫升16%三氯乙酸混合振荡两分钟。将脑组织样本离心30分钟，并在冰箱中冷却10分钟。取上清液，使用分光光度计在610纳米波长下测定伊文思蓝的吸光度。代表性结果。在假手术动物中，大脑双侧半球组织的伊文思蓝浓度均极低，且彼此之间无显著差异。缺血90分钟后再灌注24小时，可导致缺血大鼠脑损伤半球的伊文思蓝水平显著升高。总体而言，这些结果表明，在正常情况下，伊文思蓝难以穿过血脑屏障进入脑实质；而脑缺血损伤则导致伊文思蓝通过血脑屏障通透性增加而外渗。照片显示了假手术组和缺血组动物的脑组织。注意，脑组织中伊文思蓝外渗的程度表现为蓝色区域，其强度反映了损伤半球血脑屏障破坏的范围。结论：在体评估血脑屏障可使研究人员研究缺血诱导的血管源性脑水肿可能的病理生理机制，并探索新的治疗干预手段。该技术简单且可靠。研究人员需要考虑一些技术要点，以进一步提高该技术的性能并确保其准确性。使用激光多普勒血流仪持续记录局部脑血流量，并采用硅胶包被的尼龙线，可提高大脑中动脉阻塞（MCAO）的成功率，并降低死亡率。由于缺血性损伤后血脑屏障具有动态变化的特性，注射剂量和注射时间点是获得可靠结果的两个关键参数。

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科研

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Neuroscience

神经科学

一种体内评价大鼠缺血性中风模型中血脑屏障的破坏

本视频演示了如何评估经大脑中动脉阻塞处理的大鼠脑切片中的梗死区域和脑水肿。使用氧化还原染色法识别梗死区域，同时通过图像分析软件中的蓝色滤光片和阈值功能，对受损半脑的梗死区域和水肿进行定量分析。...

测量大鼠大脑中动脉闭塞后脑梗死区域和脑水肿

来源：Kuts, R. 等．大鼠运动皮层激光诱导脑损伤．J. Vis. Exp.

评估激光诱导脑损伤大鼠模型中的血脑屏障完整性

血脑屏障的破坏有助于某些药物向脑部的递送。通过动脉内给予甘露醇可使血管周围细胞收缩，从而在物理上破坏该屏障。...

血脑屏障破坏的大鼠模型以实现靶向性神经血管治疗

脑灌注监测已被证明可提高缺血性卒中模型的准确性。技术难题常常限制了这一脑血管研究重要工具的应用。本视频展示了一种优化的系统，可在大鼠大脑中动脉内栓塞过程中实现单部位或多部位的血流动力学监测。...

改良的大鼠大脑中动脉内栓塞卒中模型脑灌注监测系统

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。...

重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

本研究中，我们介绍了一种在神经退行性条件下评估血脑屏障破坏的简便高效方法。为实现研究目标，我们将高分子量的异硫氰酸荧光素标记（FITC）-白蛋白注入小鼠颈静脉，并通过荧光显微镜观察其向脑实质的渗漏情况。...

神经退行性疾病小鼠模型中通过静脉输注FITC标记白蛋白评估血脑屏障通透性

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。...

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

本方案描述了一种在同一批啮齿类动物脑样本上测量缺血性脑损伤三个最重要参数的新技术。仅使用一个脑样本在伦理和经济成本方面具有显著优势。...

在一组啮齿类动物脑样本中同时测量卒中后脑水肿、梗死区域及血脑屏障破坏

通过在不同时间点向小鼠注射两种荧光染料，建立了一种可视化血脑屏障（BBB）破坏所致染料外渗的方法。使用甘油作为冷冻保护剂，有助于在同一组织样本上进行免疫组织化学染色。...

轻度创伤性脑损伤小鼠模型中血脑屏障破坏的评估

评估缺血性脑卒中大鼠模型中细胞死亡信号通路的免疫荧光方法

学习一种在大鼠缺血性中风模型中评估血脑屏障破坏的体内方法。该技术采用线栓法诱导大脑中动脉闭塞，并通过伊文思蓝染料渗透性检测来定量分析屏障完整性，为神经科学研究提供可靠的可重复实验方案。

一个在体内缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

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一个 在体 内 缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估

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一个在体内缺血性中风大鼠模型中血脑屏障破坏的评估