从人牙槽骨膜中分离间充质干细胞及维生素D对骨膜来源细胞成骨活性的影响

本研究的总体目标是探讨维生素D对培养的牙槽骨膜来源间充质干细胞成骨诱导作用的影响。过去十年中，间充质干细胞在牙科领域的应用取得了重大进展。这些细胞已成功地从多种牙组织部位分离并进行体外培养。

本实验的目的是分离并培养牙槽骨膜来源的间充质干细胞，并研究维生素D化合物的成骨诱导潜能。一般来说，由于牙槽骨膜来源的间充质干细胞成骨形成的全新概念，初学者在该领域可能会遇到困难。实验操作将由实验室工作人员纪欣文（Hsin-Wen Chi）小姐进行示范。

她是我的实验室的一名研究助理。首先，在牙科手术过程中使用骨膜剥离器采集患者的骨膜组织，收集大小约为2毫米×5毫米的组织片。

将组织切片保存在含有抗生素的DPBS中。在实验室中，使用手术刀在取材后24小时内充分切碎肺泡骨膜组织碎片。随后，将组织置于35毫米的培养皿中，用适当的培养基进行培养。

使用含5%二氧化碳气体的37摄氏度加湿培养箱。三天后，弃去收集的骨膜组织，并更换培养基。当细胞增殖至约80%融合度时，加入胰蛋白酶消化，使培养的细胞脱落。

将培养物孵育三分钟。随后加入0.8毫升培养基以终止细胞脱落。收集并计数后，将5,000个细胞分配至每孔1毫升培养基中。

在此阶段将接种的细胞标记为第一代。培养这些细胞，待其增殖至80%融合度后再次进行分离。第一代培养基最初呈橙红色。

三天后当培养基开始变橙时，更换培养基。当第一代细胞达到80%融合度时，重复零代至第一代细胞的制备步骤，制备第二至第五代细胞。每周更换两次培养基。

四周后，在显微镜下观察细胞形态，评估细胞向成骨细胞系分化的潜能。采用冯库萨（von Kossa）染色法对细胞进行检测。该检测方法可区分培养物中钙化沉积物的存在。

用 PBS 清洗细胞，然后在 1 毫升 10% 福尔马林中固定 30 分钟。之后去除福尔马林，再次清洗细胞，并用 5% 硝酸银处理。将细胞暴露于紫外光下照射 1 小时。

接下来，去除硝酸银溶液，用 2 毫升 5% 硫酸钠溶液处理细胞，每次 3 分钟，共处理 4 次。每次处理之间更换溶液。最后，用蒸馏水洗涤细胞 2 次。

34份骨膜组织样本中有20份成功获得了骨髓来源的干细胞克隆。未发现与供者相关的任何因素对培养成功率产生显著影响。最初，PDCs形成克隆和球形簇，其中包含圆形和纺锤形细胞的混合。

首次传代后，细胞呈均一的成纤维细胞样，具有梭形形态。成骨分化结束时，von Kossa 染色显示可能存在钙盐沉积和成骨分化。这些结果强烈表明，在骨膜细胞群体中，前体细胞具有向成骨细胞分化的潜能。

成骨前体细胞还经过骨化三醇处理，并采用RT-PCR检测碱性磷酸酶的表达水平，该酶是细胞早期成骨分化的强有力指标。维生素C和骨化三醇（维生素D的活性代谢产物）处理均能增加碱性磷酸酶的表达。此外，相同处理也诱导了I型胶原mRNA表达水平的升高。

研究发现，经较高浓度骨化三醇处理的细胞中，骨唾液酸蛋白mRNA的表达增加。然而，CBFA1和骨钙素mRNA的表达未对处理产生响应。观看本视频后，观众应能够充分理解人牙槽骨膜的矿化及培养方案。

一旦掌握，若操作得当，可在四到五周内完成此项工作。进行该实验时，必须采用细致且无菌的技术，以避免细胞污染。