真涡虫的化学截肢和咽部再生Schmidtea mediterranea

这种截肢手术的总体目标是选择性地、完全地从涡虫中切除咽部，而不会损害其他器官。这种方法可以帮助回答再生领域中的关键问题。例如干细胞如何识别缺失的器官并启动它们的再生。

这种技术的主要优点是它非常精确，并且在此过程中不会损坏其他器官。我第一次想到这种方法是在我用叠氮化钠麻醉涡虫时。我注意到接触叠氮化钠会导致咽部弹出。

这种方法的视觉演示至关重要，因为截肢需要正确选择动物以及仔细观察动物的运动和形态。演示该程序的是我实验室的研究生 Divya Shiroor。在开始该程序之前，使用塑料移液管选择前 5 到 7 天喂入干净培养皿中的蠕虫。

在培养皿下方放置一把平尺，以确认每个涡虫在培养皿中爬行时至少有 6 毫米的长度。然后将多达 20 个选定的蠕虫转移到 35 毫米培养皿中，并使用移液管从培养皿中去除所有涡虫水。将培养皿置于立体显微镜下并调整放大倍率，以便可以看到多个动物。

向培养皿中加入 5 毫升新鲜制备的 100 毫摩尔叠氮化钠溶液。在不移动培养皿的情况下监测动物 3 到 4 分钟，以观察咽部的挤压情况。当培养皿中至少有一半的动物已经完全伸展咽部时，使用塑料移液管吸出并强行分配培养皿周围的蠕虫几次。

如果任何咽部完全伸展，这种剧烈的移液将导致它们分离。或者，使用一对细镊子抓住咽部，同时将涡虫向上抬向半月板。随着动物的饲养，表面张力会导致咽部分离。

移动咽部时要小心，不要对动物造成意外伤害。涡虫的体型非常柔软，很容易损坏，尤其是在叠氮化钠中时。使用移液管将大约 15 只截肢的动物移入装有新鲜涡虫水的新培养皿中，并用新鲜涡虫水冲洗蠕虫 3 次。

确保完全洗掉叠氮化钠。即使是微量的化学物质也可能导致动物溶解。然后将蠕虫在 20 摄氏度下孵育 7 天。

截肢后第二天，将蠕虫放回显微镜下，以确定蠕虫的背侧是否可见黑点。为了喂养蠕虫，将适量的肝膏转移到微量离心管中，并短暂离心管以去除任何气泡。在估计糊状颗粒的体积后，加入涡虫水至其体积的五分之一。

根据试管中的总体积，加入 2% 的红色食用色素。充分混合食品样品，直到染料均匀分布在整个糊状物中，然后再次短暂离心试管。将截肢的动物转移到新的培养皿中，并在黑暗中放置约一小时。

孵育结束时，从 P200 移液器吸头末端修剪约半厘米，然后使用改良的吸头将 25 微升红肝糊剂转移到培养皿中。让动物喂食 30 分钟。然后将蠕虫放在白色背景上，对显示为红色的动物数量进行评分。

在叠氮化钠溶液中约 6 分钟后，可以看到咽部的白色尖端。几分钟后，动物主动收缩并强行将咽部排出体外。叠氮化物暴露约 11 分钟后，动物放松，此时咽部特有的钟形变得清晰可见。

它现在已经准备好截肢了。去除这一大块未着色的组织会导致截肢动物的背侧出现黑点。为了更精确地监测咽部再生，可以用荧光偶联的链霉亲和素对动物进行过夜染色。

通过将食用色素与肝酱混合，可以区分吃东西的动物和不吃东西的动物。然后可以量化红色动物的数量以评估具有功能性咽部的动物的百分比。一旦掌握，这项技术可以在 20 或 30 分钟内完成。

尝试此程序时，请记住仔细观察涡虫运动，以确定何时应该开始截肢。选择性截肢可以帮助解决诸如干细胞如何启动适当的谱系决策以完成再生等问题。该视频应该可以很好地理解如何使用叠氮化钠进行选择性咽部切除。

使用叠氮化钠可能非常危险。请记住始终戴手套处理它，正确丢弃废物，并在实验后清洁您的工作区。