尺寸事项:新生隐球菌中胶囊直径的测定
February 27th, 2018
多糖胶囊是新生隐球菌的主要毒力因子, 其大小与菌株的毒力密切相关。胶囊直径测量用于表型检测和测量疗效。本文提出了一种标准的胶囊诱导方法, 并比较了两种染色法和测量直径法。
该程序的总体目标是对新型隐球菌菌株的多糖胶囊进行染色，以可视化和测量胶囊直径。这些方法可以帮助研究人员对新型隐球菌的胶囊大小进行诱导、成像和测量。染色和成像技术的主要优点是它们简单、快速，并且可以准确测量胶囊直径。
这种方法的视觉演示至关重要，因为第一次使用时，软件步骤可能会令人困惑。新型隐球菌荚膜的直径通常用作毒力的衡量标准。自动执行此过程的能力可以节省大量分析时间。
为了诱导胶囊生产，首先将新型隐球菌落在酵母蛋白胨葡萄糖汤中于 37 摄氏度下摇动孵育 18-36 小时，直到培养物处于对数期。在培养结束时，通过离心使酵母沉淀，并在 PBS 中洗涤酵母 3 次。最后一次洗涤后，以每 2 毫升 DMEM 浓度 10 至 5 个细胞的两倍重悬酵母，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物 18 小时。
第二天，通过离心收集细胞，并去除除最后 10 μL 上清液外的所有上清液。要用印度墨水对酵母进行染色，请将沉淀重悬于剩余的上清液中，并将 4 微升细胞悬液和 4 微升印度墨水转移到玻璃显微镜载玻片上。轻轻混合所得溶液，不要产生气泡。
然后将 1.5 号厚度的 13 毫米玻璃盖玻片放在细胞样品上，并用无毒密封剂密封边缘。要用荧光染料对酵母进行染色，将过夜培养沉淀重悬于 50 μL 补充有 1% 牛血清的 PBS 中，并将细胞在 55-60 μL 钙氟-white 和 Alexa Fluor 488 偶联胶囊单克隆 18B7 抗体中在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束时，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 10 微升 PBS 加牛血清白蛋白中。
然后将 8 微升细胞转移到玻璃显微镜载玻片上，用 1.5 号厚的 13 毫米玻璃盖玻片覆盖细胞样品，并用无毒密封剂密封边缘。要用两种染料对酵母进行染色，首先将细胞与荧光胶囊和细胞壁染色剂一起孵育，如刚才所示。然后将 4 微升荧光染色细胞和 4 微升印度墨水添加到载玻片上，并将密封的盖玻片放在真菌细胞样品上，如图所示。
要通过光学显微镜对细胞成像，请选择 100X 物镜，并在每个条件下对至少 50 个不重叠的细胞进行成像，并优化曝光时间，以最大限度地提高图像对比度，同时最大限度地减少小细胞运动引起的模糊。要通过荧光显微镜对细胞进行成像，请打开显微镜成像软件，并为所使用的荧光团选择合适的激发和发射波长。在 Z 堆栈控制面板中，选择第一个 last 选项。
使用显微镜上的微调控制，首先聚焦在单个酵母细胞的细胞体最宽点下方，以及当前视野内所有细胞的胶囊下方，然后首先单击设置。接下来，使用精细聚焦控件聚焦在当前视野内所有单元的同一单元和胶囊体的最宽点上方，然后单击 Set last（最后设置）。然后打开 acquisition 选项卡并单击 start experiment 以获取当前位置的 Z 堆栈。
要手动测量胶囊和细胞直径，请打开适当的细胞测量程序并选择要测量的图像。选择 measure 并使用光标绘制一条穿过整个单元最宽点的直线，以测量单元总直径。再次单击 measure 并绘制一条穿过单元体的直线以测量单元体直径并打开下一个单元。
测量完所有细胞后，保存图像。要自动测量胶囊和细胞直径，首先打开适当的图像编辑程序并反转所有印度墨水染色的细胞图像。接下来，要将原始图像和倒置图像导入单元测量软件，请打开测量程序中的文件菜单，然后选择导入序列、加载图像、手动定义序列、尺寸通道、导入和应用。
要检测和掩膜细胞体，请选择第一个感兴趣的倒置图像的菌落分析仪荧光方案，然后单击应用。再次选择菌落分析仪荧光方案，从其胶囊中分割倒置的新型隐球菌细胞体图像，然后再次单击应用以创建计数掩码。右键单击以重命名计数遮罩细胞体，并在原始图像上使用细胞增殖协议来检测和遮罩胶囊。
单击 Apply 为原始图像创建计数蒙版，并重命名计数蒙版胶囊。要在原始图像上创建新蒙版以将相邻的胶囊彼此分区，请为胶囊区域选择 Capsule partition 和 Capsule。要导出数据，请单击电子表格，然后单击导出到电子表格图标。
选择要导出的测量值，然后最后保存数据。大多数菌株在诱导后胶囊尺寸明显增加，尽管有些菌株表现出自然的小胶囊。在这个代表性实验中，在最大的菌株和两个较小的菌株之间始终观察到胶囊大小的显着差异。
胶囊大小的差异也可以使用荧光染料进行检测。Z 堆栈图像捕获可确保为每个细胞采集最大胶囊和细胞体直径。然后可以处理堆栈以产生最大强度投影，用于手动测量酵母细胞胶囊和细胞直径。
使用两种染色方法的胶囊测量之间没有显着的实验内差异，尽管与荧光染料染色相比，使用 India 墨水测量胶囊直径时观察到更大的实验间差异。无论使用何种方法，通常都不会观察到不同研究人员之间胶囊直径测量的显著差异，而使用自动测量方法可以检测到胶囊尺寸的微小但显著的差异。为了成功进行自动测量，细胞必须聚焦，具有中等到较大的胶囊，并且不能过度聚集。
看完这个视频后，您应该对如何在新型隐球菌中诱导胶囊、使用印度墨水或荧光染色、胶囊成像并通过自动化软件进行测量有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种用于染色和测量新型隐球菌多糖荚膜的方法，这是一个关键的毒力因子。所描述的技术便于准确的可视化和直径测量，这与菌株毒力相关。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 致病性
- 免疫学
背景
- 多糖荚膜对新型隐球菌的毒力至关重要。
- 荚膜直径是衡量菌株毒力的重要指标。
- 准确的测量技术对于评估治疗效果至关重要。
- 视觉演示有助于理解方法。
研究目的
- 提供一种标准化的荚膜诱导方法。
- 比较不同的染色和测量技术。
- 提高荚膜直径测量的准确性和效率。
使用的方法
- 在新型隐球菌菌株中诱导多糖荚膜。
- 用于可视化的染色技术。
- 使用成像软件测量荚膜直径。
- 比较不同染色方法的有效性。
主要结果
- 所介绍的方法允许简单和快速的荚膜可视化。
- 实现了准确的荚膜直径测量。
- 过程自动化可以显著减少分析时间。
- 视觉辅助对于理解所涉及的软件步骤至关重要。
结论
- 所介绍的方法对于研究新型隐球菌毒力有效。
- 准确的荚膜测量对于评估治疗效果至关重要。
- 未来的研究可以从这些技术的自动化中受益。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of Cryptococcus neoformans capsule diameter provides a quantitative proxy for virulence assessment, supporting target validation in antifungal discovery. The ability to automate capsule size measurement enhances reproducibility and throughput in phenotypic screening campaigns. This method enables mechanistic de-risking by linking capsule modulation to therapeutic intervention efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of virulence-associated phenotypes through direct measurement of capsule diameter.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical modulators of capsule biosynthesis.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by correlating capsule size with pathogenic potential.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable readout for high-content screening of compounds affecting capsule formation.
- Operational Value: India ink staining with automated image analysis enables scalable, standardized capsule diameter measurement.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility and reduces inter-operator variability in virulence phenotype assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links capsule diameter changes to strain virulence, supporting predictive modeling of therapeutic efficacy.
- Operational Value: Fluorescent co-staining with confocal imaging allows for precise, resolution-enhanced capsule visualization.
- Strategic Value: Enables translational continuity from in vitro phenotype to in vivo pathogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical evaluation, where capsule diameter serves as a biomarker of virulence modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of capsule biosynthesis pathways as virulence determinants.
- Screening: Enables automated, quantitative measurement of capsule size for compound library screening.
- Analytics: Generates morphometric data (capsule and cell body diameter) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro capsule measurements to in vivo virulence models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for antifungal lead identification and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virulence assessment through direct, quantifiable phenotyping.
- Operational Value: Standardization via automated image analysis improves throughput and reduces manual measurement bias.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in go/no-go decisions by linking capsule size to pathogenic potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antifungal candidates based on virulence attenuation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological culture techniques and microscopy-based imaging.
- Dependent on access to light or fluorescence microscopy and image analysis software capable of morphometric segmentation.
- Necessitates standardization of capsule induction protocols across laboratories to ensure comparability.
- Automated measurement requires cells to be in focus with sufficient capsule size and minimal clustering for accurate segmentation.
- Inter-experiment variability is higher with India ink than fluorescent staining, necessitating careful protocol adherence.
