大小很重要：Cryptococcus neoformans 荚膜直径的测量

本实验的总体目标是对新型隐球菌（C. neoformans）菌株的多糖荚膜进行染色，以实现荚膜直径的观察和测量。这些方法可帮助研究人员完成新型隐球菌荚膜的诱导、成像及尺寸测量。染色与成像技术的主要优势在于操作简便、快速，并可实现对荚膜直径的精确测量。

该方法的可视化演示至关重要，因为初次使用时软件操作步骤可能令人困惑。新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）荚膜直径常被用作毒力的衡量指标。实现该过程的自动化可显著节省分析时间。

为了诱导荚膜产生，首先将新型隐球菌（C. neoformans）菌落在酵母胨葡萄糖肉汤中于37摄氏度振荡培养18至36小时，直至菌液处于对数生长期。培养结束后，通过离心收集酵母细胞，并用PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，将酵母细胞重悬于2毫升DMEM培养基中，浓度为每毫升2×10⁵个细胞，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养18小时。

第二天，通过离心收集细胞，并除去上清液，仅保留最后10微升。为了用印度墨水对酵母染色，将沉淀重悬于剩余的上清液中，取4微升细胞悬液和4微升印度墨水，转移到玻璃显微镜载玻片上。轻轻混合所得溶液，避免产生气泡。

然后将一块厚度为1.5、直径为13毫米的玻璃盖玻片置于细胞样品上，并用无毒封片剂密封边缘。为了用荧光染料染色酵母，将过夜培养的菌体沉淀重悬于50 µL添加了1%牛血清的PBS中，并在37°C下用55–60 µL的Calcofluor White和Alexa Fluor 488标记的荚膜单克隆抗体18B7孵育细胞30分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于10 µL含牛血清白蛋白的PBS中。

然后将八微升细胞转移至玻璃显微镜载玻片上，用厚度为1.5、直径为13毫米的玻璃盖玻片覆盖细胞样本，并用无毒封片剂密封边缘。若需用两种染料对酵母进行染色，首先按照前述方法用荧光胶囊和细胞壁染料对细胞进行孵育。随后，将四微升荧光染色的细胞与四微升印度墨水加到玻璃载玻片上，并如前所述在真菌细胞样本上加盖密封的盖玻片。

使用光学显微镜成像时，选择100倍物镜，并针对每种条件至少对50个无重叠的细胞进行成像，曝光时间应优化至可在最大程度上提高图像对比度的同时，最小化因细胞微小运动导致的模糊。使用荧光显微镜成像时，打开显微镜成像软件，选择所用荧光染料对应的激发和发射波长。在Z轴层扫控制面板中，选择“首尾”选项。

使用显微镜的细调焦旋钮，首先将焦距调至单个酵母细胞细胞体最宽处的下方，并对当前视野内所有细胞的荚膜进行对焦，然后单击“设置起始”。接着，使用细调焦旋钮将焦距调至同一细胞细胞体最宽处的上方，并对当前视野内所有细胞的荚膜进行对焦，然后单击“设置终止”。随后打开采集选项卡，单击“开始实验”，以获取当前位置的Z轴层扫图像。

为手动测量荚膜和细胞直径，打开合适的细胞测量程序并选择待测图像。选择“测量”功能，使用光标穿过整个细胞最宽处画一条直线，以测量总细胞直径。再次点击“测量”，穿过细胞体画一条直线以测量细胞体直径，然后打开下一个细胞。

当所有细胞测量完成后，保存图像。为自动测量荚膜和细胞直径，首先打开合适的图像编辑程序，并对所有印度墨水染色的细胞图像进行反相处理。接着，将原始图像和反相图像导入细胞测量软件：在测量程序中打开文件菜单，选择导入序列、加载图像、手动定义序列、通道维度、导入，然后应用。

为了检测并遮蔽细胞体，选择目标第一张倒置图像的菌落分析仪荧光方案，然后点击应用。再次选择菌落分析仪荧光方案，以将隐球菌（C.neoformans）细胞体的倒置图像与其荚膜分割开来，再次点击应用以生成细胞体计数遮罩。右键单击，将该计数遮罩重命名为“细胞体”，然后在原始图像上应用细胞增殖分析方案，以检测并遮蔽荚膜。

单击“应用”以对原始图像创建计数掩膜，并重命名计数掩膜胶囊。若要在原始图像上创建新掩膜，以将相邻的胶囊彼此分割开，请选择“胶囊分割”和“胶囊区域”中的胶囊。要导出数据，请单击电子表格，然后单击“导出至电子表格”图标。

选择您希望导出的测量数据，然后保存数据。大多数菌株在诱导后均表现出荚膜尺寸增大，尽管某些菌株天然具有较小的荚膜。在此代表性实验中，最大菌株与两个较小菌株之间的荚膜尺寸差异始终显著。

使用荧光染料也可检测荚膜大小的差异。通过Z轴层扫成像可获取每个细胞的最大荚膜和细胞体直径。随后可对层扫图像进行处理，生成最大强度投影图，用于人工测量酵母细胞荚膜及细胞直径。

使用两种染色方法进行荚膜测量时，实验内的差异不显著，但在不同实验间，使用印度墨汁测量荚膜直径的变异性大于使用荧光染料染色法。无论采用何种方法，不同研究人员之间的荚膜直径测量值通常无显著差异；然而，通过自动测量方法可检测到荚膜大小存在虽小但具有显著性的差异。要成功实现自动测量，细胞必须处于清晰对焦状态，具有中等到较大的荚膜，且不应过度聚集。

观看本视频后，您应能充分理解如何诱导新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的荚膜，使用印度墨水或荧光染色法对荚膜进行染色，对荚膜进行成像，并通过自动化软件测量其大小。