Name: 一种确定环境富集对小鼠结肠肿瘤模型结肠菌群生物多样性影响的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解环境富集对小鼠结肠肿瘤模型肠道菌群生物多样性的影响方法。该方案通过菌群归一化和16S rDNA测序技术，评估富集环境对肿瘤携带小鼠微生物组组成的影响，为疾病微生物组研究提供可重复的实验方法。

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感谢犹他大学基因组学核心的 B. Dalley 提供文库测序服务，以及犹他大学生物统计学核心的 K. Boucher 提供统计学建议；这些技术核心由美国国家癌症研究所资助项目 P30 CA042014 支持。本项目得到了美国国家癌症研究所基金 P01 CA073992 和 K01 CA128891 以及亨茨曼癌症基金会的支持。

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作者声明不存在利益冲突。

该实验方法可用于分析经环境富集处理的正常动物或荷瘤动物粪便中分离出的微生物群。由于此类实验规模较大，需通过繁育获得多种性别和基因型的大量动物，因此在实验开始前对动物间的微生物组进行标准化处理至关重要，以避免非环境富集因素对微生物组生物多样性产生影响。
为了确保新环境（NE）与丰富环境（EE）条件之间的一致性，通过繁育过程确保所有小鼠最初均暴露于相同的微生物，因此预期其微生物组构成相似。小鼠基因型可能影响微生物组的组成，且这种影响很可能存在。因此，在新环境与丰富环境条件下，各基因型的小鼠数量均保持一致，以确保任何摄食粪便的小鼠所接触到的微生物组多样性相似。
设计环境富集（EE）实验时会遇到若干困难。首先，实验所需的动物总数取决于具体的实验细节，但也受限于笼内允许饲养的动物数量。例如，以往关于小鼠在初步环境富集实验中存活情况的历史数据被用于计算所需动物数量，以明确先前实验中观察到的存活率改善背后的机制。根据这些数据，在双侧t检验（alpha=0.05）中若要以80%的检验效能检测存活率差异，对照组总共需要17只动物。因此，在实验组...

环境富集（EE）研究利用复杂的饲养条件来影响社会刺激（大型饲养笼、更大数量的动物群体）、认知刺激（小屋、隧道、筑巢材料、平台）和身体活动（跑轮）。许多实验室已采用环境富集方法，结合多种小鼠模型，研究增加活动量以及改善社会和认知互动对疾病发生和进展的影响，这些模型包括理毛行为诱导的脱发、阿尔茨海默病、Rett综合征，以及多种肿瘤和消化系统疾病模型1,2,3,4,5,6。
已开发出多种小鼠模型用于研究小鼠结肠肿瘤的发生。其中定义最明确的模型可能是ApcMin小鼠。该ApcMin&#160;小鼠由William Dove实验室于1990年建立7，被用作研究APC基因突变的小鼠模型，这类突变通常与人类结直肠癌相关。与携带APC突变的人类不同，ApcMin小鼠主要发生小肠肿瘤，而结肠肿瘤极为罕见。然而，当ApcMin&#160;等位基因与一个在Tcf4基因中具有单次基因敲入-敲除杂合突变的Tcf4Het等位基因联合时，可极大增强结肠肿瘤的发生8。最近，这一结肠肿瘤发生的小鼠模型已被用于确定环境富集（EE）对结肠肿瘤发生的影响6。在Bice等人进行的研究中，明确了环境富集对四种不同小鼠品系（野生型（WT）、Tcf4Het/+ Apc+/+、Tcf4+/+ ApcMin/+和Tcf4Het/+ApcMin/+）的雄性和雌性个体的生理及表型效应。其中最引人注目的发现是，环境富集显著延长了雄性和雌性结肠肿瘤携带动物的寿命。这表明环境富集可能减轻与结肠肿瘤发生相关的部分症状，并改善动物健康状况。值得注意的是，雄性动物寿命的延长并非肿瘤发生减少的直接结果，而是与肿瘤伤口愈合反应的启动有关，包括微生物组生物多样性的改善6。
已发表多项针对环境富集（EE）的特定研究，结果颇具启发性。然而，从技术角度来看，这些重要结果往往难以在其他实验室中重现。在不同实验室之间保持完全相同的EE方法极为复杂，其影响因素不仅包括所使用的富集装置和饲养环境，还涉及垫料、食物、通风、繁殖方式、遗传背景、房间内的活动情况以及动物实验方案要求等9,10,11。其中一个例子是动物的整合问题：为避免非干预因素带来的影响，实验动物必须稳定地融入小鼠种群，从而确保遗传背景和饮食成分的一致性。此外，许多EE研究完成于人们认识到微生物组在疾病中重要性之前，未能考虑常规小鼠饲养操作对肠道微生物组构成的潜在影响10,12。
如果操作不当，富集环境（EE）中的繁殖策略和动物安置可能会增加动物的应激反应。由于富集环境研究需要使用大量雄性和雌性动物以及多种基因型，且实验设计要求将来自多个窝的动物合并饲养，因此实验设置较为复杂。为此，我们制定了一种繁殖和断奶策略，以便将不同窝中具有正确基因型的断奶后动物进行合并。该策略的主要目的是在不同窝之间标准化微生物群，并在动物转移至实验环境时减少应激。微生物群由母鼠传递10。为了向种群提供微生物多样性，实验前一个月从杰克逊实验室（Jackson Labs）购入雌鼠并将其整合入种群中9,10,12。为进一步使动物间的微生物组多样性趋于一致，雌鼠在繁殖前进行合笼饲养。繁殖后，在幼鼠培育期间采用群体饲养方式，并允许母鼠在哺乳期间暂时离开幼崽，这有助于改善母性照料过程中的应激水平13,14，可能进一步促进微生物组的标准化。为避免非富集环境因素对微生物组产生影响，所有实验动物均采用群体饲养，从而防止将来自不同窝的多只雄性动物合并在同一实验笼中时可能引发的争斗及其他附加应激。最后，每个笼中均包含相同数量的不同基因型动物。这一安排有助于提升跨基因型的微生物群多样性，并消除了食粪行为（动物摄食粪便的倾向）或可能存在的基因型特异性行为差异对整体研究结果的干扰。
本方案提供了一种策略，可将以往的丰富环境（EE）研究加以拓展，纳入微生物组研究中已知的关键因素，包括微生物群的传播以及动物种群的整合以实现微生物群的标准化，从而在实验动物之间建立更为均一的微生物组群体。由于非处理因素导致的微生物群差异可能干扰研究结果，因此遵循这些注意事项至关重要。消除与丰富环境无关的微生物群变化，将使研究人员能够明确界定丰富环境在疾病发生和发展过程中对微生物群组成所起的特定作用。

<table><tbody><tr><td>Teklad 饲料/Harlan 实验室饲料</td><td>Harlan Labs</td><td>3980X</td><td>由 Mario Capecchi 博士与 Harlan 实验室合作配制的标准辐照饲料。</td></tr><tr><td>Cell-Sorb Plus 垫料</td><td>Fangman Specialties</td><td>82010</td><td>使用前需高压灭菌。</td></tr><tr><td>AIMS 新生动物纹身系统</td><td>AIMS</td><td>NEO-9</td><td>https://animalid.com/neonate-rodent-tattoo-identification/32。其他动物级纹身系统和墨水也可使用，效果类似，包括 Aramis 微型纹身套件。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone 小鼠微隔离系统，包含笼具、AllerZone 滤膜盖和模块化饲料输送系统</td><td>Lab Products</td><td>82120ZF</td><td>每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 寿命延长富集装置</td><td>Lab Products</td><td>82109ZF</td><td>每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 笼具，13-7/8&quot; 长 × 19-1/16&quot; 宽 × 7-3/4&quot; 深</td><td>Lab Products</td><td>82100ZF</td><td>每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。</td></tr><tr><td>Zyfone One Cage 2100 AllerZone 微隔离滤膜盖</td><td>Lab Products</td><td>82101ZF</td><td>每个 EE 笼具需要各一个目录号为 82120ZF、82100ZF 和 82101ZF 的部件，以及两个 82109ZF 部件。饲料仅放置在一侧。</td></tr><tr><td>连接隧道</td><td>Bio-Serv</td><td>K3323 或 K3332</td><td>用于连接笼具并提供环境富集</td></tr><tr><td>用于连接隧道与笼具的衬套</td><td>由犹他大学机械车间制造</td><td>n/a</td><td>确保材料耐啃咬且可高压灭菌</td></tr><tr><td>快速跑轮</td><td>Bio-Serv</td><td>K3250 或 K3251</td><td>与小鼠 igloo 和底板配合使用</td></tr><tr><td>小鼠 igloo</td><td>Bio-Serv</td><td>K3328、K3570 或 K3327</td><td>与快速跑轮和底板配合使用</td></tr><tr><td>小鼠 igloo 底板</td><td>Bio-Serv</td><td>K3244</td><td>与小鼠 igloo 和快速跑轮配合使用</td></tr><tr><td>小鼠小屋</td><td>Bio-Serv</td><td>K3272、K3102 或 K3271</td><td></td></tr><tr><td>爬行球</td><td>Bio-Serv</td><td>K3330 或 K3329</td><td></td></tr><tr><td>Bio-hut</td><td>Bio-Serv</td><td>K3352</td><td>由木浆制成的小屋，用于遮蔽和筑巢</td></tr><tr><td>粘性薄膜&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>60941-072</td><td>用于临时覆盖大笼具上钻出的孔，防止小鼠逃逸</td></tr><tr><td>层流通风笼架</td><td>Techniplast</td><td>Bio-C36</td><td>本研究中使用的柜体目前不再供应。Bio-C36 型号非常相似。</td></tr><tr><td>1.5 mL 微离心管（无 RNA 酶和 DNA 酶）</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Stool MiniKit</td><td>Qiagen</td><td>51504</td><td>该试剂盒提供 50 次 DNA 提取所需的试剂。粪便裂解缓冲液 = ASL；氯化胍裂解缓冲液 = AL；含氯化胍的洗涤缓冲液 1 = AW1；洗涤缓冲液 2 = AW2；含 EDTA 的洗脱缓冲液 = AE</td></tr><tr><td>水浴锅（可加热至 95°C）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>用于将粪便样本在 94°C 下孵育以裂解细胞。</td></tr><tr><td>水浴锅（可加热至 70°C）</td><td>任意供应商</td><td></td><td>用于将粪便样本在 70°C 下孵育&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇（200 证明）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>荧光计：Qubit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 宽范围检测试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>EB 缓冲液或 10 mM Tris pH 8.5</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>实验特异性引物</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 级水</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2X KAPA HiFi HotStart 即用型预混液&amp;nbsp;</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2601</td><td>用于扩增子扩增（1.25 mL 可进行 100 次反应）。</td></tr><tr><td>用于运行诊断凝胶的琼脂糖</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 高灵敏度 D1000 屏幕胶带检测</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td>TapeStation 或 Bioanalyzer 仪器在机构基因组核心设施中常用于分析文库质量。也可使用 Bioanalyzer DNA1000 芯片（Agilent，5067-1504）。</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>用于 PCR 产物纯化的磁珠，5 mL 可纯化 250 次 PCR 反应</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Life Technologies</td><td>AM10027</td><td></td></tr><tr><td>文库制备指南</td><td>Illumina</td><td></td><td>Illumina. 16S 宏基因组测序文库制备：为 Illumina MiSeq 系统制备 16S 核糖体 RNA 基因扩增子。https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf。</td></tr><tr><td>双端唯一索引</td><td>Illumina</td><td>Illumina Experiment Manager 软件</td><td>免费获取地址：https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloads.html</td></tr><tr><td>Nextera XT 96 索引试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1002</td><td>用于为扩增子添加条形码</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 孔反应板</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq 索引板固定装置</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1005</td><td></td></tr><tr><td>透明粘性板封</td><td>Applied Biosystems /ThermoFisher</td><td>4360954</td><td>Applied Biosystems/ThermoFisher Microamp 粘性膜</td></tr><tr><td>使用 MiSeq v3 试剂进行双端 300 bp 测序</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX 控制试剂盒</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K（600 mAU/ml）</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td>相当于 20 mg/ml 的蛋白酶 K。随 QiaAmp 试剂盒提供</td></tr><tr><td>数据分析工具</td><td>Qiime</td><td>QIIME 软件工具</td><td>安装方式可能因系统而异，QIIME 网站描述了多种选项（http://qiime.org/install/install.html）。本研究使用了 MacQIIME 软件包 1.9.1（由 SUNY Werner 实验室编译，http://www.wernerlab.org/software/macqiime）</td></tr><tr><td>步骤 13.2。</td><td>Qiime</td><td>FastQ Join 方法</td><td>&amp;nbsp;（http://code.google.com/p/ea-utils &amp;nbsp;）。&amp;nbsp; 本研究中使用了多重连接成对末端方法 http://qiime.org/scripts/multiple_join_paired_ends.html。Aronesty, E. ea-utils: 用于处理生物测序数据的命令行工具。Expression Analysis, Durham, NC. (2011)。</td></tr><tr><td>步骤 13.3。</td><td>Qiime</td><td>从头聚类 OTU 挑选流程</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html。</td></tr><tr><td>步骤 13.3.1。</td><td></td><td>使用 Uclust 的操作分类单元（OTUs）</td><td>Edgar, R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26 (19), 2460-2461, doi:10.1093/bioinformatics/btq461 (2010)。</td></tr><tr><td>步骤 13.3.1。</td><td>Pynast</td><td>Pynast</td><td>Caporaso, J.G. 等。PyNAST：一种灵活的序列比对工具，可将序列比对至模板。Bioinformatics. 26 (2), 266-267, doi:10.1093/bioinformatics/btp636 (2010)。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>步骤 13.3.1。</td><td>Pynast</td><td>Pynast_Greengenes</td><td>DeSantis, T.Z. 等。Greengenes：一个经嵌合体检查的 16S rRNA 基因数据库及与 ARB 兼容的工作平台。Appl Environ Microbiol. 72 (7), 5069-5072, doi:10.1128/AEM.03006-05 (2006)。本研究使用了 Greengenes 版本 13_8</td></tr><tr><td>13.3.1. 注：&amp;nbsp;</td><td>Qiime</td><td>多重拆分文库</td><td>http://qiime.org/scripts/multiple_split_libraries_fastq.html。</td></tr><tr><td>13.3.1. 注：&amp;nbsp;</td><td>Qiime</td><td>从头聚类 OTU 挑选脚本</td><td>http://qiime.org/scripts/pick_de_novo_otus.html&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>步骤 13.2.2。</td><td>Qiime</td><td>创建映射文件</td><td>http://qiime.org/documentation/file_formats.html。</td></tr><tr><td>步骤 13.2.2。</td><td>Qiime</td><td>验证映射文件</td><td>http://qiime.org/scripts/validate_mapping_file.html。</td></tr><tr><td>步骤 13.3.3。</td><td>Qiime</td><td>将 OTU 与样本描述链接至映射文件</td><td>http://qiime.org/scripts/make_otu_network.html。</td></tr><tr><td>步骤 13.3.4。</td><td>Qiime</td><td>通过图表汇总分类信息</td><td>http://qiime.org/scripts/summarize_taxa_through_plots.html。</td></tr><tr><td>步骤 13.3.5。</td><td>Qiime</td><td>Biome 汇总表</td><td>http://biom-format.org/documentation/summarizing_biom_tables.html&amp;nbsp; 本研究中，所有样本均稀疏化至 20,000 个 OTU，随后使用 QIIME 中的 alpha 稀疏化脚本进行分析。</td></tr></tbody></table>

一种定义环境富集对小鼠结肠肿瘤模型中结肠微生物组多样性影响的方法

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

近期多项研究揭示了生活在丰富环境中的有益作用，可改善人类疾病状况。在小鼠中，环境丰富化（EE）可通过激活小鼠免疫系统来减少肿瘤发生，或通过刺激伤口修复反应（包括提高肿瘤微环境中的微生物组多样性）来影响荷瘤动物的生存。本文提供了一种详细的实验流程，用于评估环境丰富化对小鼠结肠肿瘤模型中微生物组生物多样性的影响。文中描述了有关动物繁育的注意事项，以及动物基因型和小鼠群体整合的考虑因素，这些因素最终均会影响微生物的生物多样性。遵循这些注意事项可能有助于实现更均一的微生物组传播，从而减轻非处理因素带来的干扰效应，避免对研究结果造成混淆。此外，本实验流程通过长期环境丰富化后从小鼠远端结肠采集的粪便样本中提取DNA，并采用16S rDNA测序技术对肠道菌群变化进行表征。肠道微生物群失衡与炎症性肠病和结肠癌的发病机制相关，同时也与肥胖、糖尿病等多种疾病有关。重要的是，该环境丰富化及微生物组分析方案可用于研究微生物组在多种疾病发病机制中的作用，前提是存在能够有效模拟人类疾病的稳健小鼠模型。

多项研究表明，身心医学的实践可改善健康结局。类似地，在小鼠中，环境富集可改善包括寿命延长和肿瘤伤口修复在内的多种结局6。因此，本研究建立了一种环境富集（EE）实验流程，旨在明确微生物群在此表型中的作用，同时在实验开始前首先对微生物组进行标准化处理（图1）。重要的是，所有用于繁殖的动物在开始繁殖前至少需整合进入小鼠群体中一个月，新生幼崽则与母鼠共同饲养于一个大笼中，以在实验前标准化微生物群的传播。当动物年龄处于21至28天之间时，将每种基因型数量相等的小鼠断奶后分别转入相应的饲养环境，即EE或标准环境（NE）（图2A）。在16周时，收集所有动物的粪便样本并进行均质化处理（图2B），随后提取细菌DNA。最后，从粪便微生物组DNA中扩增16S扩增子，并通过条形码索引，以实现所有微生物组文...

环境富集（Environmental Enrichment, EE）是一种动物饲养环境，用于揭示生活方式、应激与疾病之间关联的潜在机制。本方案描述了一种利用结肠肿瘤发生小鼠模型和环境富集方法，特异性界定可能影响动物死亡率的微生物群多样性变化的实验流程。

最近几项研究已阐明生活在丰富环境中对改善人类疾病的有益作用。在小鼠中，环境……

本出版物的主要目标是介绍一种用于标准化啮齿类动物微生物组的方法。在本演示中，检测了环境富集在结肠肿瘤发生过程中对微生物组的影响。该方案表明，在实施环境富集干预之前对微生物组进行标准化，可提高实验的可重复性。我们还展示了如何通过丰富化环境来减少动物应激并改善其行为互动。尽管本研究主要关注环境丰富化在结肠肿瘤模型中的作用，但该方法也可轻松应用于深入理解微生物组在疾病病因学中的作用。在通风橱内以无菌条件设置笼具。本实验的对照组使用常规笼具，笼内铺有垫料和用于筑巢的实验室用纸巾，但不包含任何环境富集装置。为了设置幼崽饲养或环境富集笼具，使用经灭菌的衬套固定隧道将两个大型灭菌笼具连接起来，并在每个笼具中放置一个灭菌平台，以增加活动面积。对于环境富集（EE）组，还需提供灭菌的跑轮、隧道、圆顶屋、小屋、爬行球以及筑巢材料。将富集组和对照组的笼子放置在同一架上，以确保通风条件一致。进行繁殖时，将一只雄鼠与两只雌鼠放入普通笼子中。每天早晨检查阴道栓，以确认动物是否在夜间完成交配。如果未观察到阴栓，可通过检测对阴道探查的阻力来判断是否存在已内化的阴栓。若雌性小鼠有阴道阴栓，则将其转移至大型幼仔培育笼中。只要所有怀孕母鼠预计在同一周内分娩，最多可将12只怀孕母鼠共同饲养在配备平台的环境丰富化笼具中。当幼鼠生长至21至28天时，按基因型将雄性和雌性分配到对照环境或富集环境中。确保每种基因型在每个鼠笼中保持相同比例。非富集环境的鼠笼最多可容纳5只小鼠，而富集环境的鼠笼需要至少20只小鼠以提供充分的社会刺激，并最多可容纳41只小鼠。在处死小鼠前一到两天开始收集粪便。每次收集应固定在每天的同一时间进行。收集活体动物粪便时，小心抓住动物颈部皮肤，将其置于洁净的笼子上方。然后使用无菌镊子收集排出的粪便，并转移至无菌的微量离心管中。如果动物未立即排便，将其放入清洁的笼子中，等待其排便，此过程可能需要长达一小时。若需从安乐死的动物收集粪便，需进行解剖以暴露结肠。 然后在盲肠下方切断结肠，并将结肠平铺在一张滤纸上。接着用镊子提起结肠管的上端，用剪刀切开肠腔。从远端向近端纵向剪开，以将结肠全长展开。然后使用无菌镊子将远端结肠的粪便收集到无菌的微量离心管中。将粪便样本储存在负80摄氏度条件下。除了粪便外，还需收集结肠和小肠的其他组织样本、微粒体、脂肪组织等。采用商用试剂盒，按照粪便病原体检测试剂盒说明书从粪便样本中提取微生物DNA。操作时，将样本从-80°C冰箱中取出并置于干冰上转移，并进行称重。随后，根据文本方案所述条件设置PCR反应，扩增微生物DNA。然后使用磁珠纯化反应产物。纯化时，首先将扩增PCR板短暂离心，以汇集反应产物。接着，涡旋振荡磁珠使其均匀分散，并将20 µL等分试样转移至各反应孔中。用移液器缓慢吹打全部液体10次，充分混匀磁珠与溶液。然后静置5分钟，使磁珠沉降。接着将PCR板置于磁力架上，等待2分钟，待磁珠被磁力吸附后，上清液变澄清。然后移除并弃去上清液。接下来，将平板仍置于磁铁上，向每孔磁珠中加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇，静置 30 秒。然后小心移除上清液。重复此洗涤步骤一次，并让磁珠在空气中干燥10分钟。现在将反应产物从磁珠上洗脱：将微孔板从磁力架上取下，向每孔中加入52.5 µL Tris。通过缓慢移液10次，将磁珠完全混入溶液中，每次吸取全部液体体积。然后将磁珠置于磁力架上，如同之前操作一样收集磁珠，并将50微升上清液转移至新的PCR板中。用透明粘性封膜覆盖该PCR板，于-20摄氏度保存，最长可保存一周。使用所收集的上清液进行指数PCR，以将条形码连接至接头序列。然后纯化产物并制备带索引的文库用于测序。在小鼠中，环境富集已知可延长寿命并促进肿瘤伤口修复。为了明确微生物群在此表型中的作用，将繁殖用动物引入小鼠群体中至少一个月，以使微生物群趋于正常化。然后将它们进行繁殖，并将其后代饲养于富集环境或正常环境中。后代包括荷瘤个体和野生型个体。16周后，对动物实施安乐死，并收集粪便样本以分离微生物DNA。接下来，采用PCR扩增样品中的16S核糖体亚基，以检测微生物组成分。随后通过条形码索引对扩增产物进行鉴定。有趣的是，富集环境并不能改善野生型动物的生物多样性，但却显著提高了荷瘤动物的生物多样性。这表明了该方法的灵敏度。生物多样性的增加归因于变形菌门（Proteobacteria）的丰度上升，其中α-变形菌纲（alphaproteobacteria）和β-变形菌纲（betaproteobacteria）显著增加，而致病性的γ-变形菌纲（gammaproteobacteria）则有所减少。在β-变形菌纲中增幅最大的是Sutterella属，该菌可能是一种共生菌，参与分泌型免疫球蛋白A的降解。观看本视频后，您应能充分了解如何调整饲养管理措施，以便在开展感兴趣的干预实验前，使实验动物之间的微生物组趋于一致。在实施该操作过程中，请记住动物已在环境中建立了自己的领地。因此，环境的改变可能引发应激反应，进而影响动物的微生物组。动物行为的突然变化是应激的一种生理表现。通过本实验步骤，可分离特定微生物并进一步表征，以验证所鉴定微生物对疾病进展的充分性作用。

a-method-to-define-effects-environmental-enrichment-on-colon

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

一种确定环境富集对小鼠结肠肿瘤模型结肠菌群生物多样性影响的方法

我们展示了一种实验方案，该方案通过给予小鼠致基因毒性试剂偶氮甲烷（AOM），随后进行三轮促炎剂葡聚糖硫酸钠（DSS）处理，可快速且稳定地诱导小鼠结肠肿瘤形成，其形态学和分子特征与人类结肠炎相关性癌症中的肿瘤具有相似性。...

使用氧化偶氮甲烷（AOM）和硫酸葡聚糖钠（DSS）建立结肠炎相关性癌症模型

本视频介绍了从结肠肿瘤小鼠粪便样本中分离DNA的实验方案。提取的DNA通过PCR扩增，产物再采用基于磁珠的方法进行纯化。该方法可用于研究环境富集对结肠微生物群及动物死亡率的影响。...

粪便微生物DNA提取：研究环境富集对小鼠肿瘤模型中微生物组多样性的影响

在本视频中，我们介绍了一种用于构建小鼠近端结肠袢（pcLoop）节段的外科手术方法，随后向该节段进行管腔内注射荧光标记物，以研究肠道上皮通透性。...

小鼠近端结肠袢模型的建立：一种通过肠腔内注射荧光标记物并检测血清中荧光信号以评估肠道通透性的外科手术方法

本视频演示了在结肠炎的白细胞介素-10缺陷小鼠中进行粪便微生物移植的操作过程。肠道内定植的粪便微生物会释放次级代谢产物，诱导抗炎性细胞因子的释放，从而减轻结肠炎症。...

评估粪菌移植在白细胞介素-10缺陷小鼠中的作用

我们介绍了利用刚性内窥镜对小鼠结肠疾病治疗疗效进行纵向监测的方法。该方案可直接用于活体小鼠中单个肿瘤治疗反应的表征，也可用于监测潜在的疾病复发。...

利用活体小鼠连续内窥镜成像无创评估新型肠道疾病治疗药物的疗效

为小鼠提供环境富集需要复杂的挑战性设置，以及全面的饲养管理和操作技术，以确保小鼠产生稳定的代谢和抗肿瘤效应。本方案提供了详细的操作步骤，用于在小鼠中重现上述效应。...

一种小鼠丰富环境饲养方案

目前对炎症性肠病（IBD）的治疗旨在缓解疾病症状，但可能引起严重副作用。因此，研究人员正在利用动物结肠炎模型探索替代性治疗策略。本文将介绍如何在结肠炎模型中分析膳食补充剂对临床IBD症状的有益作用。...

分析营养补充剂在实验性结肠炎期间对肠道上皮屏障功能的有益作用

本文介绍了一种建立抗生素诱导的伪无菌右旋糖酐硫酸钠诱导结肠炎小鼠模型的实验方案，用于研究肠道微生物群在调控Bacillus...

探究缓解效应 Bacillus cereus 通过肠道微生物群调节治疗结肠炎

我们描述了一种从小鼠结肠隐窝中分离并建立三维结肠类器官的实验方案。所建立的结肠类器官可进一步终末分化，以模拟宿主上皮细胞的组成，随后可用于炎症刺激实验，或进一步诱导形成上皮单层细胞模型。...

研究肠道炎症对上皮的影响 体外 已建立的小鼠结肠类器官

本实验方案描述了在非炎症条件下使小鼠定植 pks+ Escherichia coli 所需的步骤，以及验证定植效果和评估粪便中 pks+ E. coli...

在非炎症条件下小鼠pks+ Escherichia coli的定植

了解环境富集对小鼠结肠肿瘤模型肠道菌群生物多样性的影响方法。该方案通过菌群归一化和16S rDNA测序技术，评估富集环境对肿瘤携带小鼠微生物组组成的影响，为疾病微生物组研究提供可重复的实验方法。

一种定义环境富集对小鼠结肠肿瘤模型中结肠微生物组多样性影响的方法

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