一种定义环境富集对小鼠结肠肿瘤模型中结肠微生物组多样性影响的方法

本出版物的主要目标是介绍一种用于标准化啮齿类动物微生物组的方法。在本演示中，检测了环境富集在结肠肿瘤发生过程中对微生物组的影响。该方案表明，在实施环境富集干预之前对微生物组进行标准化，可提高实验的可重复性。

我们还展示了如何通过丰富化环境来减少动物应激并改善其行为互动。尽管本研究主要关注环境丰富化在结肠肿瘤模型中的作用，但该方法也可轻松应用于深入理解微生物组在疾病病因学中的作用。在通风橱内以无菌条件设置笼具。

本实验的对照组使用常规笼具，笼内铺有垫料和用于筑巢的实验室用纸巾，但不包含任何环境富集装置。为了设置幼崽饲养或环境富集笼具，使用经灭菌的衬套固定隧道将两个大型灭菌笼具连接起来，并在每个笼具中放置一个灭菌平台，以增加活动面积。对于环境富集（EE）组，还需提供灭菌的跑轮、隧道、圆顶屋、小屋、爬行球以及筑巢材料。

将富集组和对照组的笼子放置在同一架上，以确保通风条件一致。进行繁殖时，将一只雄鼠与两只雌鼠放入普通笼子中。每天早晨检查阴道栓，以确认动物是否在夜间完成交配。

如果未观察到阴栓，可通过检测对阴道探查的阻力来判断是否存在已内化的阴栓。若雌性小鼠有阴道阴栓，则将其转移至大型幼仔培育笼中。只要所有怀孕母鼠预计在同一周内分娩，最多可将12只怀孕母鼠共同饲养在配备平台的环境丰富化笼具中。

当幼鼠生长至21至28天时，按基因型将雄性和雌性分配到对照环境或富集环境中。确保每种基因型在每个鼠笼中保持相同比例。非富集环境的鼠笼最多可容纳5只小鼠，而富集环境的鼠笼需要至少20只小鼠以提供充分的社会刺激，并最多可容纳41只小鼠。

在处死小鼠前一到两天开始收集粪便。每次收集应固定在每天的同一时间进行。收集活体动物粪便时，小心抓住动物颈部皮肤，将其置于洁净的笼子上方。

然后使用无菌镊子收集排出的粪便，并转移至无菌的微量离心管中。如果动物未立即排便，将其放入清洁的笼子中，等待其排便，此过程可能需要长达一小时。若需从安乐死的动物收集粪便，需进行解剖以暴露结肠。

然后在盲肠下方切断结肠，并将结肠平铺在一张滤纸上。接着用镊子提起结肠管的上端，用剪刀切开肠腔。从远端向近端纵向剪开，以将结肠全长展开。

然后使用无菌镊子将远端结肠的粪便收集到无菌的微量离心管中。将粪便样本储存在负80摄氏度条件下。除了粪便外，还需收集结肠和小肠的其他组织样本、微粒体、脂肪组织等。

采用商用试剂盒，按照粪便病原体检测试剂盒说明书从粪便样本中提取微生物DNA。操作时，将样本从-80°C冰箱中取出并置于干冰上转移，并进行称重。随后，根据文本方案所述条件设置PCR反应，扩增微生物DNA。

然后使用磁珠纯化反应产物。纯化时，首先将扩增PCR板短暂离心，以汇集反应产物。接着，涡旋振荡磁珠使其均匀分散，并将20 µL等分试样转移至各反应孔中。

用移液器缓慢吹打全部液体10次，充分混匀磁珠与溶液。然后静置5分钟，使磁珠沉降。接着将PCR板置于磁力架上，等待2分钟，待磁珠被磁力吸附后，上清液变澄清。

然后移除并弃去上清液。接下来，将平板仍置于磁铁上，向每孔磁珠中加入 200 µL 新鲜的 80% 乙醇，静置 30 秒。然后小心移除上清液。

重复此洗涤步骤一次，并让磁珠在空气中干燥10分钟。现在将反应产物从磁珠上洗脱：将微孔板从磁力架上取下，向每孔中加入52.5 µL Tris。通过缓慢移液10次，将磁珠完全混入溶液中，每次吸取全部液体体积。

然后将磁珠置于磁力架上，如同之前操作一样收集磁珠，并将50微升上清液转移至新的PCR板中。用透明粘性封膜覆盖该PCR板，于-20摄氏度保存，最长可保存一周。使用所收集的上清液进行指数PCR，以将条形码连接至接头序列。

然后纯化产物并制备带索引的文库用于测序。在小鼠中，环境富集已知可延长寿命并促进肿瘤伤口修复。为了明确微生物群在此表型中的作用，将繁殖用动物引入小鼠群体中至少一个月，以使微生物群趋于正常化。

然后将它们进行繁殖，并将其后代饲养于富集环境或正常环境中。后代包括荷瘤个体和野生型个体。16周后，对动物实施安乐死，并收集粪便样本以分离微生物DNA。

接下来，采用PCR扩增样品中的16S核糖体亚基，以检测微生物组成分。随后通过条形码索引对扩增产物进行鉴定。有趣的是，富集环境并不能改善野生型动物的生物多样性，但却显著提高了荷瘤动物的生物多样性。

这表明了该方法的灵敏度。生物多样性的增加归因于变形菌门（Proteobacteria）的丰度上升，其中α-变形菌纲（alphaproteobacteria）和β-变形菌纲（betaproteobacteria）显著增加，而致病性的γ-变形菌纲（gammaproteobacteria）则有所减少。在β-变形菌纲中增幅最大的是Sutterella属，该菌可能是一种共生菌，参与分泌型免疫球蛋白A的降解。

观看本视频后，您应能充分了解如何调整饲养管理措施，以便在开展感兴趣的干预实验前，使实验动物之间的微生物组趋于一致。在实施该操作过程中，请记住动物已在环境中建立了自己的领地。因此，环境的改变可能引发应激反应，进而影响动物的微生物组。

动物行为的突然变化是应激的一种生理表现。通过本实验步骤，可分离特定微生物并进一步表征，以验证所鉴定微生物对疾病进展的充分性作用。