脂多糖处理小鼠肝脏中免疫反应期间白细胞的双光子活体成像

本实验的总体目标是在脓毒性休克期间观察肝脏内白细胞的形态和功能。该技术的主要优势在于能够直接获取肝脏内白细胞的动态影像。手术前，使用70%乙醇对手术台和所有器械进行消毒。

然后准备肝脏手术所需的器械，并将加热板调节至37摄氏度。根据文本方案对注射LPS或PBS的小鼠进行麻醉后，涂抹少量眼膏以防止角膜干燥。使用剃刀和脱毛膏去除腹部周围的毛发。

然后用湿纱布清理腹部。使用胰岛素注射器进行眶后注射，注入 200 µL Texas red 葡聚糖溶液。用记号笔标记右侧肋缘下区域，从剑突至肋骨末端。

然后将聚维酮碘涂抹于小鼠腹部，以防止继发感染。使用镊子和剪刀剪开表皮。接着，用显微剪刀和镊子打开腹腔，小心暴露肝脏。

用棉签将左侧叶向外展开。然后向腹腔内加入500微升无菌PBS，以防止肝脏干燥。将小鼠置于特制腔室中的右侧卧位，并在硅胶垫上涂抹少量组织胶。

然后使用棉签小心地固定肝脏。肝组织极为脆弱。在暴露和持握肝脏时，切勿使用尖锐或沉重的工具。

数秒后，用 500 微升无菌 PBS 再次润湿肝脏，以防止其干燥。然后将金属框架置于肝脏上，并使用螺母将其牢固固定。放置金属框架前，务必先安放支撑螺母。

这有助于减轻金属框架的压力。为了进行肝脏的活体成像，请运行 Zen 软件以开启激光器。将激光波长设置为 880 纳米，并设置绿色和红色通道。

然后根据荧光强度调整激光功率。将样品腔室置于成像载物台上，并将20倍水浸物镜靠近盖玻片。将硅橡胶加热器固定在小鼠身体下方，以维持其体温。

接着在金属支架上吸取500 µL蒸馏水。然后将物镜靠近肝脏，调节焦距，并确定成像区域的深度和时间。

出于伦理考虑，对于长期成像，每小时注射一次先前配制的 Zoletil 和 Rompun 麻醉混合物的一半剂量。保持小鼠体温在 37 摄氏度，并始终密切观察小鼠，因为每只小鼠的麻醉时间存在差异。为分析数据，请打开 Velocity 软件，并从数据库中导入原始数据。

然后去除图像中的噪声并截取快照。最后将编辑后的内容调整为100%大小，并将快照图像导出为JPEG或TIF文件，视频导出为AVI文件。对照小鼠的活体成像分析显示，仅有少量中性粒细胞在血管内循环。

与对照小鼠相比，LPS处理的小鼠中性粒细胞数量显著增加。在LPS处理条件下，大量中性粒细胞在血液中循环，但并未迁移至血管外。如这些视频所示，与对照小鼠相比，LPS处理小鼠中的中性粒细胞更牢固地黏附于血管腔表面，导致在血管内更频繁地检测到中性粒细胞。

除了中性粒细胞的运动性之外，在 CX3CR1-GFP 小鼠中，肝脏包膜巨噬细胞（LCMs）被观察到位于肝脏组织表面，而非组织深部。此外，即使在经 LPS 处理的小鼠中，LCMs 在肝脏中也表现出极少的移动或活化。一旦熟练掌握，该技术若操作得当，可在 30 分钟内完成。

进行该操作时，重要的是要记住切口线应从剑突延伸至右侧肋缘腹部的末端。完成该操作后，还可进行其他方法，例如治疗性注射，以回答更多问题，如肝脏如何从损伤和感染中恢复。该技术建立后，为医学领域的研究人员探索脓毒症期间白细胞的反应以及测试潜在药物铺平了道路。

观看本视频后，您应能够很好地掌握如何通过最小腹部切口暴露肝脏。请务必注意，操作脂多糖时可能具有极高危险性，因此在进行该操作时，应始终采取灭菌、洗手等防护措施。