Name: 大动物淋巴结的采集与处理 RNA 分析: 大动物 Transcriptomic 淋巴结的制备研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: 学习从大型动物淋巴结中采集和处理样本以进行RNA分析的标准化方法。本方案涵盖组织识别、切片取样及保存技术，确保RNA完整性，适用于转录组学研究和免疫反应分析。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨此感谢 James Fosse 在所有视频拍摄和视频处理方面所做的出色工作；感谢 Michael Marti 在生成数字化牛图像方面的出色贡献；感谢 Lilia Walther 在 RNA 提取和 Bioanalyzer 检测中的帮助；感谢 Mitch Palmer 和 Carly Kanipe 对淋巴结图像提供的有益审阅和反馈；同时感谢国家动物疾病中心的动物护理和兽医团队在动物饲养以及剖检准备工作中的辛勤付出与协助。

作者无任何利益冲突需要披露。所有研究均由美国农业部农业研究局内部资金资助。提及特定产品仅出于实验可重复性的目的，不代表联邦政府对这些产品有任何 endorsement。

大多数转录组学研究及相关实验方案主要关注小鼠、大鼠或死后人类样本。然而，对家畜和野生动物的研究为表征免疫系统对疾病的应答提供了广泛的机会，这些研究不仅适用于兽医学，也与人畜共患疾病的公共卫生密切相关。本实验方案概述了从牛、野牛、山羊和绵羊等大型动物组织中提取高完整性RNA的关键注意事项。由于动物体型较大，且样本采集条件复杂，使得组织获取过程更为耗时，其死后处理时间也比小鼠淋巴结的获取更长。同样，这些淋巴结体积较大，因此需要采用能够从不同动物中平行获取样本、并能代表淋巴结内免疫学/病理学变化的实验方案。本方案中关于样本采集的建议，有助于获得完整的RNA，同时通过淋巴结分段取样，确保获得具有代表性的分子谱型。
为了说明此处所介绍的标准化取样策略和方案的重要性，我们从 PubMed Central 数据库中检索了 25 篇表征家畜淋巴结转录组的研究论文。其中一篇论文提到一次性处理大块淋巴结组织，一篇讨论了特定的激光捕获显微切割方法，一篇提到从淋巴结中采集了“&#34;代表性样本&#34;”，仅有一篇论文46&#160;明确指出所采集的淋巴结...

对淋巴结转录组进行RNA测序分析，可为研究动物对多种病原体的免疫应答提供机会。尽管该方法已在小鼠中得到广泛应用，但近年来相关研究正逐步扩展至大型哺乳动物1,2。家畜或大型动物的淋巴结可用于表征宿主对感染的应答，不仅可用于疫苗研发、遗传易感性研究以及药物开发靶点的鉴定，还可作为研究人畜共患病的人类疾病模型系统。例如，对于布鲁氏菌病（一种每年影响全球约五十万人的人畜共患细菌性疾病），尽管研究成本显著增加，但在绵羊或山羊中开展的研究相较于实验室动物模型，更贴近人类感染情况和人类疫苗的研发。小鼠感染模型虽能模拟网状内皮系统的感染过程，但无法再现其特征性临床症状3。
与实验室动物研究相比，在大型动物实验中，组织采样过程必然存在安乐死后与组织采集之间更长的延迟，这给高质量RNA的保存带来了潜在挑战。完整的RNA对于生成具有生物学意义的转录组数据至关重要。在生物安全 containment 设施中开展的大型动物病原体研究中，从组织样本中获取高质量RNA尤为关键。此类研究本身实施难度较大，不仅需要经过批准的设施和高度训练的专业人员，还涉及显著的经济成本，根据具体工作的不同，费用可能从数万到数十万美元不等。这类研究通常还需要跨学科协作与跨学科知识的整合，进一步增加了其复杂性。因此，对样本采集与保存流程进行系统化培训、开发并严格执行标准化操作，将为感染动物组织的后续分子生物学研究带来显著优势。
与小鼠淋巴结的类似取样相比，获取较大的淋巴结在组织采集方面带来了额外的挑战。样本切除前的准备工作需要对淋巴结的解剖结构有基本了解，包括相关的内部构造。淋巴结的结构由淋巴小叶组成，周围环绕着充满淋巴液的窦腔，整个结构被一层坚韧的纤维性被膜所包裹4。淋巴小叶是“淋巴结的基本解剖和功能单位”，由滤泡、深层皮质区以及髓索和髓窦构成4（图 1A）。B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞分别定位于滤泡和深层皮质区。这些结构提供了三维支架，并促进淋巴细胞与抗原或抗原呈递细胞之间的相互作用。
肉眼观察时，滤泡和深层皮质单位在切面上可被识别，因其含有较致密的网状结构，颜色较深，而窦部结构由较纤细的网状组织构成，颜色较浅（图1B）。按照惯例，病理学家将淋巴结的区域分为浅层皮质（滤泡）、副皮质（深层皮质单位）和髓质（髓索和窦）。在淋巴结的常规病理学检查指南中，对这三个区域进行全面检查被认为是最佳实践5。需要注意的是，即使在同一动物体内，淋巴结的质地、大小和颜色也存在显著差异。随着动物年龄增长，其淋巴结通常会逐渐缩小并变得更为坚实，这通常与结缔组织增加以及正常淋巴组织结构减少有关6,7。
<img alt="淋巴结解剖结构示意图及组织切片，突出显示皮质、副皮质和髓质结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 淋巴结的解剖结构。（A）此示意图展示淋巴结的解剖结构，描绘了关键结构。（B）此图片显示一个牛淋巴结的横切面。肉眼可见的相关结构/层次已被标出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
根据实验问题的不同，用于采集和分析的淋巴结也会有所差异。外周淋巴结位于皮下组织深层。在牛中，临床和实验实践中常用的外周或浅表淋巴结包括腮腺淋巴结、下颌下淋巴结、咽后淋巴结、肩前淋巴结、股前淋巴结（胫前淋巴结）以及浅腹股沟淋巴结（雌性为乳房上淋巴结，雄性为阴囊淋巴结）（图2）。在 表1 中，列出了牛体系统中所述主要浅表淋巴结的特性8。以下列出了一些针对牛细菌性传染病研究的潜在淋巴结采集方案，可作为开展研究的起点。
布鲁氏菌 abortus/布鲁氏菌 melitensis：标准尸体解剖用于 B. abortus-感染的牛和 B. melitensis在中国台湾的国家动物疾病中心，对感染山羊采集肩上、肩前和腮腺淋巴结组织，用于细菌计数的研磨处理以及宿主RNA表达谱分析的RNA提取。 B. abortus 在实验感染的牛中，可定期从上述每个淋巴结中回收到9. 可在每种类型的淋巴结中检测到细菌的存在 B. melitensis-感染山羊体内至少九个月，采用本研究中的基于RNA的方法学（Boggiatto 等，未发表）。 沙门氏菌 sp.：肩前、髂下（股前）和肠系膜淋巴结在对牛胴体进行特征分析时具有重要价值 沙门氏菌 患病率10,11,12 并且可能对转录组学研究具有潜在意义。 E. coli O157:H7肠系膜淋巴结（位于中段小肠和远端小肠处）可能是感染犊牛中偶尔分离出细菌的部位（但在感染的成年牛中则未见）。13. 钩端螺旋体病（钩端螺旋体 sp.在乳腺引流淋巴结中已观察到细菌的长期持续存在14. Mycobacterium bovis: 在牛中，实验感染后已从犊牛的纵隔和气管支气管淋巴结中分离出该细菌15此外，淋巴结RNA已被用于研究大型动物宿主对病毒的应答，例如猪繁殖与呼吸综合征病毒2. 图2 展示了这些主要淋巴结在牛体内的部分位置。
<img alt="牛淋巴结示意图；腮腺、下颌下、咽后、肩前、股前、乳房上。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2： 示意图展示家牛（Bos taurus）部分淋巴结的位置。图中编号的淋巴结已作标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在本文及相关的视频中，我们介绍了一种用于RNA研究的大型动物淋巴结分离方案，旨在为从事大型动物感染转录组学研究的分子生物学家提供参考。首先，我们以牛和野牛组织取样为例，概述了淋巴结分离的操作流程。配合视频展示的内容，提供了一套可重复的组织取样工作流程，用于RNA提取。接下来，我们详细说明了处理感染性淋巴结时的重要注意事项，重点包括安全性、操作一致性以及RNA质量的保障。
使用酸化酚-胍基异硫氰酸盐试剂从组织中提取RNA的方法基于Chomczynski和Sacchi16,17的原始方法，并结合Vogelstein和Gillespie18开创的在变性剂存在下通过基于硅胶的离心柱进行纯化的技术。我们还探讨了从采用不同保存方法的牛淋巴结中回收用于转录组学研究的RNA的可能性。最后，我们研究了时间变量对大型动物尸体解剖中RNA质量的影响，包括一个代表性实验，展示从安乐死到采样之间时间延长对野牛和牛淋巴结中回收RNA谱型的影响。本文不仅对分子生物学家，也对刚开始开展转录组学研究的兽医研究人员具有参考价值。

<table><tbody><tr><td>RNA保存液（本实验均使用RNALater）</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml或2 ml聚丙烯微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>组织镊，鼠齿型</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>也可选用其他类型的组织镊，如弯头、锥形边缘等，视用户偏好而定</td></tr><tr><td>3 mm穿刺活检针</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>锐器盒（小型且便于携带，用于解剖）</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td><td>图示为1夸脱规格</td></tr><tr><td>切片板或一次性托盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>有多种尺寸可选，视用户偏好而定</td></tr><tr><td>个人防护装备</td><td></td><td></td><td>根据病原体不同而异（手套、呼吸器面罩、护目镜等）</td></tr><tr><td>酚类RNA提取试剂（本实验均使用TRIzol试剂）</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>基于二氧化硅柱的RNA提取试剂盒（本实验均使用PureLink RNA Mini试剂盒）</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>适用于最多100 mg组织</td></tr><tr><td>100%乙醇（分子生物学级，200 proof）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>配备封闭式匀浆管的组织匀浆仪（本实验均使用gentleMACS解离仪）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（通用型，用于凝胶电泳）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>也可在实验室自行配制</td></tr><tr><td>去离子甲酰胺</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计（本实验使用NanoDrop分光光度计）</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>用于RNA定量分析的设备（本实验使用Bioanalyzer及其配套组件和方案）</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>FFPE组织RNA提取试剂盒（本实验使用RecoverAll总核酸分离试剂盒，适用于甲醛固定、石蜡包埋组织）</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>塑料涂布棒（L形涂布棒）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>仅用于感染动物样本的无菌检测</td></tr><tr><td>解剖刀</td><td>Livestock Concepts</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

大型动物淋巴结的采集与处理以用于rna分析：为大型动物物种淋巴结转录组学研究做准备

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

大型动物（包括家畜和野生动物）是人畜共患病原体的重要储存宿主，包括 布鲁氏菌, Mycobacterium bovis, 沙门氏菌，以及 E. coli，并且可用于研究细菌在自然宿主中的致病机制和/或传播过程。鉴于淋巴结在宿主免疫反应中的关键作用，淋巴结组织可作为下游转录组分析的潜在RNA来源，以评估感染过程中细胞基因表达的时间动态变化。本文概述了家畜淋巴结采集、组织取样及后续RNA处理的流程，以牛（*Bos taurus*）为例进行说明。关键词：淋巴结采集，组织取样，RNA提取，转录组分析，感染模型，家畜，牛Bos taurus) 作为模型，并以美洲野牛（Bison bison）。该方案包含了有关从动物体内多个关键部位进行淋巴结定位、识别和摘除的信息。此外，还介绍了一种活检取样方法，可实现跨多个动物个体的一致性取样。文中讨论了多种样本保存的注意事项，包括制备适用于下游技术（如RNA测序和RT-PCR）的RNA。由于大型动物研究中固有的长时间延迟问题 与 小鼠时间序列研究，本文展示了来自野牛和牛淋巴结组织的代表性结果，用以描述此类组织中RNA降解的时间进程，并结合以往关于其他组织中RNA降解方法学研究的综述进行阐述。总体而言，本方案对于启动大型动物样本转录组研究的兽医研究人员，以及希望学习相关技术的分子生物学家均具有实用价值。 体内 组织取样和 体外 处理。

本文所述注意事项（方案中的步骤 1 - 4）将有助于从大型动物样本中提取适用于宿主基因表达研究下游分析的 RNA。通过多种标准方法评估 RNA 在下游应用中的质量。在分光光度法检测中，A260/A280 比值可反映蛋白质污染程度，而 A260/A230 比值则可用于评估纯度，以检测苯酚等化学污染物。通常，比值约为 2.0 表明 RNA 质量较高，比值降低则提示存在污染。重要的是，这些比值无法提供有关 RNA 降解的信息，RNA 降解情况可通过定性方法（步骤 4.15 - 4.17）和定量方法（步骤 4.18，例如通过 RNA 完整性数值或 RIN 评分）进行评估。
需要注意的是，从淋巴结组织切片中回收的RNA质量水平通常低于从牛外周血白细胞样本中回收的RNA。在Fleige和Pfaffl开展的一系列针对牛组织和细胞系的RNA提取研究中30 发现平均RIN（在Bioanalyzer上测得的RNA完整性数值）在不同样本间存在差异 &lt; 5 用于空肠...

本方案概述了从大型动物淋巴结组织中分离RNA以进行转录组分析的操作流程，包括家畜和野生动物淋巴结的识别与切除步骤、在多个动物间保持一致性的取样方法，以及采集后RNA分析所需的保存与处理注意事项和代表性结果。

大型动物淋巴结的采集与处理以用于RNA分析：为大型动物物种淋巴结转录组学研究做准备

大型动物（包括家畜和野生动物）是多种人畜共患病原体的重要储存宿主，包括布鲁氏菌（Brucella）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、沙门氏菌（Salmonella）以及……

您好，我叫 Dr.Robert Schaut，是位于美国爱荷华州艾姆斯市的国家动物疾病中心的一名科学家。在本 JoVE 视频中，我们将向您介绍如何采集和处理大型动物的淋巴结，以用于后续的 RNA 实验。例如，这些实验可能包括对反转录产物进行定量 PCR，或对转录组进行 RNA 测序研究。淋巴结是评估宿主免疫反应的有用样本，同时也可以作为病原体RNA的研究来源，例如存在于淋巴结内免疫细胞中的胞内病原体。包括家畜和野生动物在内的大型动物样本，在人畜共患病研究中具有重要意义。在国家动物疾病中心，我们研究家畜感染布鲁氏菌（brucella abortus）的情况，该病原体可导致牛和野牛患布鲁氏菌病，同时也研究牛肠道排出的大肠杆菌O157:H7。我们还将从野生动物（如鹿和麋鹿）中采集组织样本。可从感染不同疾病的动物体内收集多种淋巴结。对这些自然宿主物种的组织研究通常比小鼠模型更能反映疾病的自然发展过程。然而，从大型物种采集组织的过程必然比从小鼠采集更为复杂，包括安乐死后到组织收集之间的时间更长，以及淋巴结体积更大。本文将介绍一种用于RNA研究的大型动物淋巴结分离方案，可为从事大型动物感染转录组学研究的分子生物学家以及刚开始开展转录组学研究的兽医研究人员提供参考。在本视频中，我们将以牛的淋巴结为例进行操作演示。在进行剖检之前，我们建议准备以下专用于组织分离的用品：装有约 1 ml RNA 组织保存液（如 RNAlater）的微量离心管、一次性解剖刀、洁净且经过高压灭菌的镊子、活检针、用于丢弃使用过的解剖刀和针头的锐器盒，以及根据所涉及材料的感染性水平选择使用的砧板或一次性托盘。在本例中，我们将以通常从牛体采集的淋巴结为例，演示该操作的关键步骤。它们感染了引起布鲁氏菌病的细菌。这些是肩前淋巴结和腮腺淋巴结。在进行大型动物解剖以回收RNA时，最好至少有三名参与者共同处理动物组织。解剖人员一负责对动物的不同部位进行大体解剖分割，解剖人员二在主解剖台从动物各个部分回收淋巴结，解剖人员三在另一张工作台上处理每个淋巴结，分离其中的组织片段并转移至含有保存液的试管中。我们将首先识别并摘取肩前淋巴结。理想情况下，在解剖前通过触诊淋巴结有助于确定其具体位置。虽然并非总能检测到，但在健康的动物中，肩前淋巴结通常可触及。首先将动物置于侧卧位，通过在膝关节水平向后移动前肢来伸展肩部。该动作可使肩部后移，便于轻松触诊淋巴结。按图示方法触摸是否存在淋巴结。一旦确定位置，并保持肩部处于伸展状态，使用解剖刀或手术刀沿肩部轮廓做皮肤切口。向后牵拉皮肤，以暴露肩部和颈部肌肉组织。有时可见一层皮下脂肪，尤其是在体况过佳的动物中。肩前淋巴结常与皮下脂肪组织相伴存在。在这里可以看到皮肤、肌肉和皮下脂肪的三层结构。再次触诊淋巴结的位置。与皮下脂肪不同，触诊时淋巴结会保持其原有形状。找到肩前淋巴结后，仔细分离皮下脂

collection-processing-lymph-nodes-from-large-animals-for-rna-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

大动物淋巴结的采集与处理 RNA 分析: 大动物 Transcriptomic 淋巴结的制备研究

分离淋巴结基质细胞是一个多步骤过程，包括酶消化和机械解离，以获得纤维状网状细胞、淋巴管和血管内皮细胞。在本描述的方法中，采用短时间消化结合自动化的机械解离，以最大程度减少活的淋巴结基质细胞表面标志物的降解。...

小鼠淋巴结基质细胞的分离

我们介绍一种对新生仔猪的肠淋巴干进行插管的外科手术方法，以从输出淋巴液中收集大量脂质代谢成分。...

新生猪肠道淋巴干的长期插管及淋巴液采集

本文介绍一种用于猕猴肝脏和肠系膜淋巴结（MLN）系列取样的微创腹腔镜技术，该方法可提高取样频率，并与开腹手术相比降低手术并发症的风险。...

猕猴肝脏和肠系膜淋巴结系列采集的腹腔镜技术

本文的目的是介绍一种从小鼠体内采集不同白色脂肪组织、处理脂肪样本并提取RNA的逐步操作流程。...

小鼠脂肪组织采集与RNA分析前处理

本文介绍了一种优化的实验方案，可从单份全血样本中制备编码（mRNA）和非编码 （ncRNA）珠蛋白富集的RNA测序文库。...

猪全血中表达的编码与非编码RNA类别鉴定

本方案旨在为野外捕获蝙蝠的基因组学、转录组学和蛋白质组学分析提供最佳的组织制备方法。内容包括蝙蝠捕获与解剖、组织保存以及蝙蝠组织细胞培养的详细操作步骤。...

用于组学分析和原代细胞培养的蝙蝠组织采集

本文介绍一种简单且经济的方法，可用于定量分析肿瘤细胞在淋巴结（LN）冷冻切片上的黏附情况。通过光学显微镜可轻松识别黏附于淋巴结的肿瘤细胞，并采用基于荧光的方法进行确认，从而获得反映肿瘤细胞与淋巴结实质结合亲和力的黏附指数。...

淋巴结冷冻切片中肿瘤细胞黏附的定量分析

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。...

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

表达IL-9的T细胞和ILC2细胞在……期间被诱导产生 N. brasiliensis 感染，但由于其频率较低且动力学特征不同，这些细胞在受感染肠道中的表征在很大程度上被忽视。本方案描述了从不同靶器官中分离这些细胞并鉴定其身份的方法。 通过...

一种研究Nippostrongylus brasiliensis感染模型中产生IL-9的淋巴细胞的策略

本方案描述了一种安全且耐受性良好的小鼠双侧肾淋巴结切除术的存活手术操作。...

小鼠双侧肾淋巴结切除术

本方案描述了一种可存活的小鼠肠系膜淋巴结清扫术，该手术安全且耐受性良好，可沿肠系膜淋巴结链的四个站点分别进行。本方案具有可调整性，可用于选择性阻断远端结肠、近端结肠和/或小肠的淋巴通路。...

小鼠肠系膜淋巴结切除术以选择性阻断特定区域肠道的淋巴通路

学习从大型动物淋巴结中采集和处理样本以进行RNA分析的标准化方法。本方案涵盖组织识别、切片取样及保存技术，确保RNA完整性，适用于转录组学研究和免疫反应分析。

大型动物淋巴结的采集与处理以用于RNA分析：为大型动物物种淋巴结转录组学研究做准备

探索更多视频