大动物淋巴结的采集与处理 RNA 分析: 大动物 Transcriptomic 淋巴结的制备研究

嗨，我叫 Robert Schaut 博士，是爱荷华州艾姆斯国家动物疾病中心的一名科学家。在本 JoVE 视频中，我们将与您分享有关收集和处理大型动物淋巴结以用于下游 RNA 实验的信息。例如，这些实验可能包括对逆转录产物进行定量 PCR，或对转录组进行 RNA 测序研究。

淋巴结是评估宿主免疫反应的有用样本，但也可以提供用于研究的病原体 RNA 来源，例如淋巴结内免疫细胞中存在的细胞内病原体的情况。来自大型动物（包括牲畜和野生动物物种）的样本在人畜共患疾病研究中具有重要意义。在这里，在国家动物疾病中心，我们研究了牲畜感染布鲁氏菌流产症等物种的情况，布鲁氏菌流产会导致牛和野牛的布鲁氏菌病，以及从牛肠道脱落的大肠杆菌 O157：H7。

我们还将从鹿和麋鹿等野生动物物种中回收组织样本。可以从感染不同疾病的动物中收集一系列淋巴结。与小鼠模型相比，对这些自然宿主物种中的组织的研究通常与疾病的自然进展更相关。

然而，从大型物种中采集组织的过程必然比从小鼠中采集更复杂，包括安乐死和组织采集之间的延迟时间更长，以及淋巴结的尺寸更大。在这里，我们将介绍一种分离大型动物淋巴结用于 RNA 研究的方案，该方案将为参与大型动物感染转录组学研究的分子生物学家以及开始转录组学研究的兽医研究人员提供信息。在本视频中，我们将演示牛淋巴结的手术。

在尸检之前，我们建议组装以下专用于组织分离程序的用品。根据所涉材料的传染性水平，应使用装有约 1 ml RNA 组织防腐剂（如 RNAlater）、一次性手术刀、清洁和高压灭菌钳、活检针、用于存放用过的手术刀和针头的锐器容器以及砧板或一次性托盘的微量离心管。在这种情况下，我们将使用我们通常从牛身上收集的淋巴结来演示该程序的关键要素。

他们感染了导致布鲁氏菌病的细菌。这些是肩胛前淋巴结和腮腺淋巴结。在进行大型动物尸检以回收 RNA 时，至少有三名参与者对动物组织进行研究是有用的。

解剖器 1 将负责对动物的不同部位进行大型动物切片，解剖器 2 将在主尸检台上从不同的动物切片中恢复淋巴结，解剖器 3 将在单独的工作台上工作，从每个淋巴结中分离切片，并将它们转移到装有防腐剂溶液的试管中。我们将从识别和切除肩胛前淋巴结开始。理想情况下，在解剖前触诊淋巴结将有助于确定淋巴结的位置。

虽然并不总是能够检测到，但肩胛前淋巴结通常在健康动物中是可触及的。首先将动物置于侧卧式。通过将前肢向后移动到膝盖水平来伸展肩部。

这个动作将使肩膀向后移动，并允许轻松触诊淋巴结。如图所示，感觉淋巴结的存在。找到并肩部仍然伸展后，使用手术刀或尸检刀沿着肩部轮廓做一个皮肤切口。

缩回皮肤，露出肩部和颈部肌肉组织的尖端。有时会观察到一段皮下脂肪，尤其是在过度调节的动物中。肩胛前淋巴结通常带有皮下脂肪部分。

在这里，您可以看到皮肤、肌肉和皮下脂肪的三层。再次触诊淋巴结的位置。与皮下脂肪不同，淋巴结在触诊时会保持其形状。

定位肩胛前淋巴结后，仔细解剖皮下脂肪，解剖淋巴结。由于大黄石地区的野牛对布鲁氏菌敏感，我们在布鲁氏菌病研究中使用了这些淋巴结，因此我们在野牛中的外观是相似的。在这里，我们展示了肩胛前淋巴结的外观，就像从美国野牛的右肩上解剖出来的一样。

接下来，我们将进行腮腺淋巴结的分离。在动物处于侧卧状态的情况下，找到颞下颌关节。使用手术刀或尸检刀，小心地在皮肤上切开一个切口。

从关节背侧开始，并沿下颌线垂直延伸。解剖皮肤以露出皮下组织。腮腺唾液腺是可见的，首先是因为它体积大、表面呈分叶状和呈红色。

使用镊子和手术刀，将腮腺唾液腺移到一边，找到位于唾液腺内侧和内侧的腮腺淋巴结。在分离腮腺淋巴结时，将淋巴结组织与腮腺组织分离至关重要。组织类型看起来不同，包括组织横截面内。

这可以在这里观察到，左边是腮腺淋巴结，右边是腮腺唾液腺。在进一步处理之前，请务必仔细检查腮腺淋巴结组织的纹理。在某些情况下，可能需要切除腮腺唾液腺以定位腮腺淋巴结。

这是一个从阉牛身上切除腮腺的例子，其中淋巴结嵌入唾液腺内，在腺体切除前不可见。有关识别所选淋巴结的其他信息，请参见主要手稿。收集淋巴结后，您就可以切除切片以进行保存。

使用手术刀或尸检刀，切除一部分淋巴结，然后矢状切口以打开淋巴结。检查淋巴结内部，尤其是来自受感染动物的标本，寻找不对称、病变、色差等。在这个牛肩胛前淋巴结中，肉眼可以看到多个特征。

这些包括作为 B 淋巴细胞所在地的滤泡和作为 T 细胞所在地的深层皮质单位。这些原因看起来比髓窦更暗，髓窦更浅。这里描述了另一个未感染淋巴结的例子。

这个淋巴结来自一头年轻的野牛。请注意，在此示例中，毛囊不太明显。为了对组织进行切片进行处理，一种选择是用手术刀从每个淋巴结收集小组织片段，以便随后进行 RNA 回收。

然而，比较样品之间的表达谱的一个主要挑战是，与小鼠淋巴结相比，大型动物淋巴结体积较大，而小鼠淋巴结可以很容易地提取整个用于 RNA 提取。因此，小组织切片不会均匀地捕获淋巴结中的细胞图谱。相反，为了捕获淋巴结轮廓上的细胞，从淋巴结上切出一个饼状楔形，切成不超过 5 毫米的小块，然后用镊子放入含有 RNAlater 的试管中。

或者利用活检方法从每个淋巴结切除组织切片。如果您想从淋巴结中收集特定切片（例如特定卵泡），然后用镊子将活检工具转移到 RNAlater。将样品转移至 RNAlater 后，将其转移回实验室并在 4 摄氏度下储存过夜，以便组织渗透。

然后，去除多余的 RNAlater，并将组织样品储存在 80 摄氏度。使用 RNA 保存溶液的一个优点是，在尸检时和从现场收集样本时都不需要液氮。在取样之前，将 Trizol 试剂预分装到试管中进行均质化。

从冰箱中取出样品后，根据制造商的建议，立即将其转移到 Trizol 试剂中进行后续处理。在这里，一块 50-100 毫克的组织被转移到 Trizol 试剂中。在添加 Trizol 之前尽可能限制解冻。

当从冰箱中取出多个样品进行处理时，可以使用干冰储存。将试管放在均质器上，并在 Trizol 试剂中匀浆。此处使用两分钟的 RNA 提取设置。

完成后，检查是否有混浊外观。如有必要，请重复此作。按照制造商的方案为每个样品生成水性和有机层。

用移液器吸头去除上层透明水相。转移到新的微量离心管中。接下来，与等体积的 100% 乙醇混合。

充分混合。管子经常会出现浑浊。使用微量移液器吸头，将液体转移到基于硅胶的商用离心柱中，以进一步纯化并洗脱 RNA。

为了评估 RNA 质量，将 1 升或 2 升洗脱的 RNA 样品上样至分光光度计进行分析。完成该程序后，我们观察到 260-280 比率和 260-230 比率的吸光度比约为 2，表明高纯度和最小的化学残留。从 260-230nm 吸光度比的降低可以观察到苯酚污染。

在对野牛等动物进行尸检过程中，我们观察到从安乐死到将第一个组织样本转移到防腐剂之间至少有 20 分钟的时间。相比之下，安乐死后可以在几分钟内切除和保存小鼠淋巴结。因此，我们对表征淋巴结随时间的降解曲线感兴趣。

在主要手稿中，我们还汇编了一系列其他组织类型中 RNA 稳定性谱的摘要，这些组织类型已在其他出版物中进行了测试。在对野牛淋巴结进行的代表性实验中，RNA 稳定性在安乐死后一小时内相对一致。在这里，我们描绘了从美国野牛的乳上淋巴结组织片段中纯化的总 RNA 的凝胶图像。

这一发现与从文献中汇编的其他组织类型的先前数据一致。这表明，甚至可以从野牛和麋鹿等更具挑战性的物种中收集质量可接受的样本，用于基因表达的下游分析。然而，重要的是要认识到，死亡和样品保存之间的较长时间会导致 RNA 表达谱发生变化，包括 mRNA 转录本三个主要末端的降解增加。

因此，利用快速、简化的工作流程进行组织回收仍然很重要，以便在动物可以进行尸检后减少进一步的延迟，以获得最生物学有效的 RNA 图谱。此外，我们注意到，在整个过程中必须小心谨慎，以避免 RNA 污染物在整个过程中进入样品中，超出组织中已经存在的污染物。这包括使用手套作为其他必需的个人防护设备的一部分。

我们还将最终的 RNA 产物分装到多个试管中，以尽可能限制 RNA 样品的自由滞留。例如，可以储存单独的等分试样以用于质量控制测试。总之，在本视频中，我们提供了用于下游基因表达分析的淋巴结鉴定、收集、代表性采样和处理的重要信息。

虽然我们的代表性视频已经用牛和野牛的例子进行了演示，但我们也用了其他大型物种的淋巴结，包括山羊和麋鹿。我们希望您会发现此视频对您的工作有所帮助，无论您是考虑在工作中使用转录组学方法的兽医科学家，还是有兴趣涉足大型动物科学领域的分子生物学家。