微生物菌落生物膜的石蜡嵌入和薄切片显微分析

该程序的总体目标是生成石蜡包埋的生物膜切片，可用于评估完整天然形态内荧光蛋白产生所报告的基因表达分布。该方法可以帮助回答微生物群落研究中的关键问题，例如特定基因在外聚物物质生产中的表达如何在天然生物膜结构的背景下分布。该技术的主要优点是允许分析生物膜横截面保留形态内的基因表达，同时也适用于下游处理，例如不同特征的染色和高分辨率成像，如共聚焦或电子显微镜。

根据文本方案制备琼脂胰蛋白胨溶液后，使用 50 毫升锥形管将 45 毫升溶液倒入 100 毫米 x 100 毫米的方形培养皿中。让琼脂凝固约 20 至 30 分钟。在第一层的顶部倒入第二层 15 毫米的薄片，然后让它凝固一夜，如有必要，使用无绒纸巾去除眼睑上的冷凝水。

接下来，为了发现菌落生物膜，根据文本方案从冷冻原液中培养出分离的单个铜绿假单胞菌菌落后，将 2.5 至 10 微升细胞悬液移液到中等双层板上。菌落可以在 25 摄氏度、80% 至 100% 相对湿度的黑暗中孵育长达四天。将 15 毫升琼脂溶液轻轻倒在生长培养基和菌落上，让琼脂在室温下形成凝胶 5 分钟。

然后，使用锋利的剃须刀片切出一个方形的三层卡盘，菌落层压在顶部两层之间。如果制备多个样品，请确保将每个卡盘切割成相当的尺寸。从含有卡盘的菌落中轻轻去除任何多余的琼脂。

然后，将刮刀的平头浸入 PBS 或水中，轻轻插入琼脂的顶层和底层之间。立即将层压菌落转移到用耐化学性标记笔标记的包埋盒中。将包埋盒放入包含先前制备的固定剂的载玻片邮件中。

处理样本。使用 1X PBS 洗涤两次，每次 1 小时。为获得最佳结果，请使用自动组织脱水机的离心功能上的低设置来自动进行试剂均质化。

要包埋样品，请在蜡模中加入加热至 55 摄氏度的熔融石蜡，然后使用加热的平刮刀将浸润的卡盘从包埋盒快速转移到蜡模中，确保卡盘与模具底部平行。让蜡在 4 摄氏度下凝固一夜。用固体蜡模制的样品可以在此温度下无限期储存。

蜡凝固后，从模具中取出样品，并使用剃须刀片修剪样品周围多余的蜡。留下一些从样品一端伸出的蜡，可用于将其夹入切片机中。修剪蜡包埋样品，使其形状有利于收集光滑的线性带，这一点很重要。

修剪中的小瑕疵会在色带中产生伪影并损害截面的完整性。接下来，将水浴加热至 42 摄氏度。然后，将样品夹入切片机中，使菌落表面垂直于刀片边缘。

以 50 微米的间隔修剪样品，直到到达所需的菌落平面，使用切片速度为 75 至 80 RPM 且通离角为 6 至 10 度的切片机从该平面收集切片。剪下所需数量的 10 微米厚截面的带状物。然后，使用细尖油漆刷将色带从刀片上拆下。

现在，用镊子或巴斯德移液管尖端的一滴水，轻轻地将丝带转移到水浴中。立即将玻片插入水浴中，并将其以 45 度角放置在色带下方。将色带的窄边触摸到磨砂标签正下方的幻灯片上。

色带应粘附。将载玻片从水浴中拉出并调整角度，使其垂直于水面，使色带沿其长度平放在载玻片上。避免在色带下方积聚过多的水。

轻轻地将玻片放在吸水剂、不起毛的纸巾上，从切片中吸走多余的水分。然后，将玻片放在纸巾上，在室温下避光晾干过夜。将平整的热板加热至 45 摄氏度，然后将载玻片放在板上 30 到 60 分钟。

蜡会变成半熔融的，并在载玻片上变平。轻轻地将玻片从热板上提起，将其平放在光滑的水平室温表面上约一分钟，直到蜡凝固。确保熔融的蜡不会拉到载玻片的任一侧。

将样品放入载玻片邮寄袋中，用清洗剂四次清洗玻片，每次 5 分钟。使用 Buchner 抽吸器在两次洗涤之间去除溶液。使用 100% 乙醇洗涤玻片 3 次，每次 1 分钟。

然后，根据文本方案对载玻片进行再水化后，立即将切片安装在 tris 缓冲的安装介质中并盖上盖玻片。切片周围的覆盖琼脂不与固定剂反应，因此它不会粘附在甜菜载玻片上。这种琼脂在再水化过程中会脱落并损坏切片，因此在再水化过程中应注意不要搅动溶液。

让封片剂在室温下聚合过夜。聚合后，使用透明指甲油将盖玻片密封到载玻片上。最后，将密封的玻片无限期地存放在 4 摄氏度的黑暗中。

虽然使用 40 倍油浸物镜的 DIC 成像足以显示生物膜薄片的一些形态特征，但经过工程改造的组成型表达荧光蛋白的菌株的荧光显微镜检查提供了样品内细胞分布的增强可视化。如这些面板所示，各个切片的图像可以拼接在一起以生成整个菌落的横截面，并为宏观水平上整体形态中结构特征的定位提供背景。使用经过工程改造的菌株，在特异性启动子的控制下表达荧光蛋白，可以实现基因表达分布的可视化。

此外，菌落可以在含有染料的培养基上生长，或者可以在切片后将染料添加到染色剂的特异性多糖中。最后，也可以使用透射电子显微镜以更高的分辨率制备样品并以更高的分辨率成像，如此处所述。在尝试此程序时，请务必注意样品的敏捷性以及通过固定、切片或再水化引入荧光和结构伪影的可能性，这可能会影响您对数据的解释。

该程序允许进行定量图像分析，例如将荧光报告基因的表达谱与生物膜的形态学特征和 Z 轴相关联。该方案可应用于具有医学和工业意义的各种生物膜形成微生物，例如铜绿假单胞菌、霍乱弧菌和枯草芽孢杆菌。观看本视频后，您应该对如何通过石蜡包埋培养和准备用于切片的集落生物膜有很好的了解。